Name: genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

يشكر المؤلفون مختبر كاي للإدخال لهذا الأسلوب و LMB المجهري والتدفق الخلوي مرافق للدعم العلمي والتقني الممتاز. تم تمويل هذا العمل من "مجلس البحوث الطبية في" منحة MC_U105115237 ر. ر. كاي، بسرك (مجلس بحوث العلوم البيولوجية والتكنولوجيا الأحيائية) منحة BB/K009699/1 إلى ر. ر. كاي، منح "أبحاث السرطان" في بريطانيا A15672 R. H. Insall، "ويلكوم ترست كبار زمالة" 202867/Z/16/Z لجوناثان R تشب، ولجنة نهر الميكونج التمويل (MC_U12266B) إلى "وحدة جامعة لمكب لجنة نهر الميكونج" في دوري إبطال أوروبا.

<ol>
	<li>Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Dictyostelium+discoideum.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum.</a> Development. 138 (3), 387-396 (2011).</li><li>Sussman, R., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Dictyostelium+discoideum+in+axenic+culture.">Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).</li><li>Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+the+Dictyostelium+alpha-actinin+gene+leads+to+an+altered+mRNA+and+lack+of+the+protein.">Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein.</a> The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).</li><li>De Lozanne, A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+Dictyostelium+myosin+heavy+chain+gene+by+homologous+recombination.">Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination.</a> Science. 236, 1086-1091 (1987).</li><li>Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+transient+expression+system+for+Dictyostelium+discoideum.">Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum.</a> Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).</li><li>Knecht, D., Pang, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Dictyostelium+discoideum.">Electroporation of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).</li><li>Wetterauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+strains+of+Dictyostelium+discoideum+can+be+transformed+using+a+novel+selection+cassette+driven+by+the+promoter+of+the+ribosomal+V18+gene.">Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene.</a> Plasmid. 36, 169-181 (1996).</li><li>Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditions+for+the+transformation+of+nonaxenic+Dictyostelium+strains.">Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains.</a> Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).</li><li>Bloomfield, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+controls+macropinocytosis+and+phagocytosis+in+Dictyostelium.">Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP(3)-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Hoeller, O., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+the+absence+of+PIP3+gradients.">Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients.</a> Current Biology. 17, 813-817 (2007).</li><li>Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dictyostelium+RasS+protein+is+required+for+macropinocytosis,+phagocytosis+and+the+control+of+cell+movement.">The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement.</a> Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).</li><li>Schaap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phylogeny+and+evolution+of+morphology+in+the+social+amoebas.">Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas.</a> Science. 314, 661-663 (2006).</li><li>Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+Aggregative+Multicellularity+and+Cell-Cell+Communication+in+the+Dictyostelia.">The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).</li><li>Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+in+social+amoebae+is+mediated+by+allelic+pairs+of+tiger+genes.">Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes.</a> Science. 333 (6041), 467-470 (2011).</li><li>Strassmann, J. E., Queller, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+cooperation+and+control+of+cheating+in+a+social+microbe.">Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).</li><li>Wolf, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+Trade-offs+Result+in+the+Illusion+of+Social+Success.">Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success.</a> Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).</li><li>Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+set+of+small,+extrachromosomal+expression+vectors+for+Dictyostelium+discoideum.">A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum.</a> Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).</li><li>Woznica, D., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under-agarose+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).</li><li>Dubin, M., Nellen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+set+of+tagged+expression+vectors+to+monitor+protein+localisation+and+function+in+Dictyostelium.">A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium.</a> Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).</li><li>de Hostos, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+mutants+lacking+the+cytoskeletal+protein+coronin+are+defective+in+cytokinesis+and+cell+motility.">Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility.</a> Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).</li><li>Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+targeting+of+multiple+genes+in+Dictyostelium.">CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).</li><li>Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+harbours+for+the+integration+of+new+DNA+in+the+human+genome.">Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).</li><li>Rosengarten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaps+and+lulls+in+the+developmental+transcriptome+of+Dictyostelium+discoideum.">Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum.</a> BMC Genomics. 16, 294 (2015).</li><li>Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-mediated+diversification+of+transcriptional+bursting+dynamics+following+gene+duplication.">Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).</li><li>Gebbie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phg2,+a+kinase+involved+in+adhesion+and+focal+site+modeling+in+Dictyostelium.">Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).</li></ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

وقد تم استخدام الخلايا ديكتيوستيليوم غير أكسينيك، والبرية من نوع محدودة جداً حتى الآن في الأبحاث الجزيئية. الأساليب المتاحة للهندسة الوراثية لهذه السلالات تفتقر إلى الموثوقية والكفاءة23، منع اعتمادها العام. يمكن استخدام المواد التي تم إنشاؤها والبروتوكولات المقدمة هنا لأي سلالة ديسكويديوم دال- مستقلة عن قدرته أن ينمو في المتوسط السائل. تجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول هو الأمثل لخطوط الخلايا المستمدة من NC4. الكفاءة تعداء للسلالات المعزولة طازجة من البرية تختلف عن NC4، كما أننا لاحظنا قبل وترد هنا ل V12M2 و WS2162،من89. شروط انهانسر خاصة ويبدو أن لها تأثير كبير على الكفاءة تعداء وقد تتطلب مزيدا من التحسين لبعض السلالات. وبصفة عامة، لوحظت على كمية كافية من ترانسفيكتانتس في جميع سلالات اختبارها حتى الآن، تبين أن هذه الأساليب قابلة للتطبيق. عدد ترانسفيكتانتس الإيجابية التي تم الحصول عليها باستخدام سلالات المستمدة من NC4 أعلى بالمقارنة بغيرها من السلالات البرية من نوع غير أكسينيك، ولكن في جميع الحالات، يتم الحصول على العدد الكافي من ترانسفيكتانتس للسماح لمزيد من التجارب. هذا، بالإضافة إلى بساطة لدينا البروتوكول، وهو تحسن كبير مقارنة بمحاولات سابقة8،9.
تغطي جميع الإجراءات الجينية القياسية هذه البروتوكولات غير أكسينيك جديدة وإضافة المزيد من المزايا، حيث يمكن إجراء ترانسفيكشنز سرعة وكفاءة في نفس الوقت. يمكن الحصول على النسخ الإيجابية في أيام بدلاً من أسابيع، منذ نمو في النصفين البكتيريا الوقت شعبة. والبلازميدات المنشأة حديثا أيضا العمل في ظل ظروف أكسينيك، ويمكن بشكل روتيني استخدامها تحت ظروف النمو على حد سواء، وهو آخر النهوض بهذه الأساطير22. كما أدخلت في البروتوكول، قد بلازميد المستخدمة لاختيار على البكتيريا المتطلبات الخاصة التي تعتبر حاسمة بالنسبة لنجاح تعداء. على وجه الخصوص، المروجين القيادة شرائط التعبير والمقاومة هامة لنجاح تعداء. مروج غالباً ما تستخدم act6 (أكتين 6)24 للقيادة أشرطة الكاسيت المقاومة أو التعبير يفتقر إلى الكفاءة عندما تزرع الخلايا على البكتيريا. في نظامنا بلازميد، داعية نشطة للغاية act15 (أكتين 15) محركات جميع الأشرطة التعبير، بينما الأشرطة المقاومة تحت سيطرة أحد المروجين coA (كواكتوسين A)، سواء التي تنشط في ظل الظروف أكسينيك، وفي الخلايا المزروعة في البكتيريا. متطلبات للتعبير عن مراسل بنيات فضلا عن طريقة الكبس وثوابت المغلوب تجعل من الضروري استخدام مرجع بلازميد لدينا، ولكن للأسف يحد استخدام الموجهات التي تستخدم المروج الكفاءة act6 بالفعل بإنشاء.
الكفاءة المروج تكتسي أهمية حاسمة خاصة ترانسفيكشنز التي تعتمد على حدث واحد تكامل في موضع الجينوم الصحيح. سبب لنا تحسين المروجين القيادة تعبير الجينات المقاومة، ينتج ما يكفي من البروتين المقاومة من التكاملات محور واحد. وكان شاغلا رئيسيا تحابي تكاملات متعددة في مجال المجين عند استخدام هيجروميسين أو G418 كما هو موضح. لا تحابي تكاملات متعددة وقد لوحظ حتى الآن، كما ذكرت سابقا لتحديدات G418 باستخدام نظم المروج الأكبر سنا25. وهذا يعني أن كل من هيجروميسين و G418 علامات التحديد مناسبة لتوليد تدق الرافضة نظيفة وتدق ins. للأسف، بلاستيسيدين علامة التحديد لا يعمل تحت ظروف غير أكسينيك. هذا عيب رئيسي لأسلوبنا، منذ كاسيت المقاومة بلاستيسيدين تستخدم بشكل روتيني لإنشاء بنيات المغلوب في ديسكويديوم د. الثوابت التي تم إنشاؤها بالفعل مع أشرطة المقاومة بلاستيسيدين ستحتاج إلى أن يكون ريديريفيد باستخدام واحدة من علامات التحديد قابلة للتطبيق. وثمة إمكانية أخرى للتغلب على هذا القيد الجمع بين أكسينيك أنشئت مؤخرا ديسكويديوم دال كريسبر التكنولوجيا مع هذا البروتوكول تعداء26. جيل مناسبة، واحدة دليل الكشف (سجرناس) أبسط وأسرع من إعادة بناء كاملة بنيات المغلوب. لاتجاهات المستقبل، إمكانية توليد عدة طرق الرافضة استخدام كريسبر/Cas9 جنبا إلى جنب مع هذا البروتوكول تعداء جذابة وقد تمهد الطريق للعديد من الباحثين في المجتمع ديكتيوستيليوم . ومع ذلك، ينبغي أن تدرس قابلية نظام التعبير عابر المنشأة المستخدمة كريسبر/Cas9 في أكسينيك الخلايا المزروعة بعناية.
يوفر act5 تدق في نظام عرض نظام تكامل آمنة وموثوق بها لتوليد خطوط الخلايا مستقرة في ديسكويديوم دال، مع استفادة مواقع مماثلة في سائر الكائنات الحية22. كما يعتمد على حدث واحد تكامل في الجينوم ويوفر العديد من الإمكانيات للاتجاهات البحثية المختلفة. مروج act5 تنشط بقوة وضمانات التعبير متجانسة تقريبا27 مستقلة عن شروط زراعة. البروتينات الفلورية مراسل يمكن دمجها بسهولة في هذا المكان ملاذا والبلازميدات استهداف هندسيا باستخدام. يمكن أن يكون هذا مفيداً، على سبيل المثال، لأغراض تتبع الخلية، كما هو موضح هنا في تجربة مزيج. إظهار الخلايا تقلب أدنى خلية إلى التعبير، التي يمكن أن تساعد في الخلية الآلي تتبع. الأهم من ذلك، يظهر إدخال تسلسل المطلوب في موضع العمل5 محايدة فينوتيبيكالي28،29. حسبما التعبير لا تعتمد على علامة اختيار للحفاظ على التعبير البروتين، كما رأينا في إينتيجرانتس عشوائي أو خطوط الخلايا الحاملة لناقل اكستراتشروموسومال، نظام act5 يمكن أن تكون مفيدة لتجارب الإنقاذ، كذلك. منذ خطوط الخلية متجانسة، يمكن تحليل كافة الخلايا. وهذا لا يمكن استخدام بلازميد اكستراتشروموسومال للتعبير، التي يوجد تباين كبير في التعبير.
وبالإضافة إلى هذه التحسينات العامة لجميع سلالات، يتيح القدرة على استخدام غير أكسينيك البرية من نوع الخلايا للأبحاث الجزيئية تقييما لآثار الطفرات المتراكمة في سلالات المختبر الحالي. تم العثور على عدة ترتيبات جديدة الوراثية منذ اعتماد سلالة Ax2 في عام 1970، كما يتضح من تحليلات ميكرواري المنشورة سابقا26. ولوحظت تعمل الاصطناعية بسبب وجود هذه الطفرات. على سبيل المثال، يظهر متحولة المبلغ هو2 التصاق انخفض في مختبر واحد سلالة الخلفية والالتصاق المتزايد في آخر3. مثل هذه البيانات المتضاربة يمكن حلها الآن بتكرار هذه التجربة في سلالة الجد المشترك (في هذه الحالة، DdB). وقد تبين قوة هذا النهج مؤخرا لل30،جتباسي رأس الصغيرة31.
القدرة على إجراء التجارب الجينية في أي سلالة ديسكويديوم دال- يوسع إمكانيات البحث الاتجاهات الجديدة التي تعتمد على استخدام يعزل البرية، لا سيما تلك التي تنطوي على التطور الاجتماعي والتعرف على الأقرباء و دورة الجنسي22.

جنس ديكتيوستيليوم هي أميبا الحية التربة الاجتماعية التي تتغذى أساسا على البكتيريا. يتم وضعها في الأسرة في اللغات متموريات، عدد كبير من الأنواع وقد تم عزل التي يمكن تجميعها في أربعة أطوار مختلفة1. وقد أصبح الأنواع ديسكويديوم ديكتيوستيليوم (ديسكويديوم د) كائن نموذج شعبية لدراسة العمليات الخلوية المعقدة مثل الهجرة الخلية والبلعمه. للتحكم وتوحيد الشروط التجريبية، خلية أكسينيك ووضعت الخطوط التي تستطيع أن تنمو في المتوسطة السائلة المعقدة أو تم تعريفها في حالة عدم وجود البكتيريا2. Ax2، Ax3، تكتسب أهمية خاصة، وعزل سلالات Ax4، التي كانت كلها ولدت في السبعينات وفي نهاية المطاف مستمدة من البرية واحد NC43. ووضعت أدوات للهندسة الوراثية في هذه السلالات أكسينيك، أسفر عن التقديم المنشورة الأولى في عام 19874،5. كذلك وضعت بروتوكولات والأمثل للاستخدام تحت ظروف أكسينيك6،7.
التكيف مع هذه البروتوكولات إلى البرية من نوع ديسكويديوم دال- حاولت السلالات التي لا تستطيع أن تنمو في المرق السائل من عدة مختبرات. ومع ذلك، هذا لا أصبحت ناجحة تماما منذ بروتوكولات تعداء معقدة وتفتقر إلى الكفاءة، وجزئياً بسبب قدرة البكتيريا على العمل كبالوعة لل8،الكواشف انتقائية9. نتيجة لذلك يأتي الأساس الجزيئي جميع البيانات المتعلقة ديسكويديوم د من أحفاد عزل البرية من نوع واحد. لقد أردنا للتغلب على هذا التحديد، ووضع طريقة لتعديل الخلايا ديسكويديوم دال- مستقلة عن قدرتها على النمو في المتوسط السائل وراثيا. ويمكن تفسير الحاجة إلى مثل هذا أسلوب بالملاحظة أنه كان يفترض في الماضي أن الطفرات مما يسمح بزيادة أكسينيك كانت محايدة أساسا ولا تنتقص من فيزيولوجيا الخلية. هذا الافتراض صحيح جزئيا فقط. وبصفة عامة، هناك اثنين من الاختلافات الملحوظة؛ أولاً، بين مختلف عزل سلالات أكسينيك، والثانية، وعند مقارنة هذه السلالات أكسينيك مع يعزل البرية غير أكسينيك8،9.
ولعل أكثر العوامل حسما هو الرئيسية أكسينيك الجينات، فاسب، التي اعتبرت مؤخرا NF1 راسجاب. المهمة الرئيسية ل NF1 راسجاب لكبح جماح رأس النشاط3. حذف الإنزيم في جميع سلالات أكسينيك يؤدي إلى النشاط المفرط رأس يتجلى كتشكيل بقع Ras نشطة كبيرة. هذه البقع Ras الموسع يؤدي إلى تراكم PIP3 في غشاء البلازما. هذه البقع الظهور مصادفة PIP3 ورأس النشطة هي قالب لتشكيل دائرية [روفل] أن يغلق في نهاية المطاف، ويؤدي إلى تشكيل ماكروبينوسوميس10. والنتيجة زيادة مفرطة في النشاط ماكروبينوسيتيك. ماكروبينوسيتوسيس عملية يحركها أكتين. مسابقة لمكونات سيتوسكيليتال للتشكيل أما ماكروبينوسوميس أو بسيودوبودس هو النتيجة. تأثيره على سلوك الخلية ينعكس في منع إنزيمية خلايا النباتية لحمض الفوليك11كاملة تقريبا. هذه البقع PIP3 الموسع على نطاق واسع جداً ثابتة. حتى في الخلايا المتعطشة، تظل البقع PIP3 ويمكن أن يساء تفسيره بسيودوبودس، الذي يمكن أن يسبب مشاكل تفسير الدراسات المتعلقة به إلى المخيم.
وفي بعض الحالات، أن الطفرة NF1 مفيد تجريبيا. وهذا يقودنا إلى حافز ثاني لتطوير أسلوب تعداء للبكتريا نمت ديسكويديوم دال- الخلايا، نظراً للزيادة في معدل ماكروبينوسيتوسيس يجعل الخلايا أكسينيك قيمة للتحقيق في الجوانب الأساسية لهذه العملية12 . ومع ذلك، ألغت الطفرات في الجينات المطلوبة ماكروبينوسيتوسيس، مثل PI3-مؤنزم ورأس10، تقريبا النمو أكسينيك، مما يجعل من الضروري التعامل مع هذه الخلايا من خلال النمو في البكتيريا. وهناك سبب آخر يجعل القائم على البكتيريا ترانسفيكشنز قيمة هو تزايد استخدام ديكتيوستيليدس لاستكشاف المسائل في التطور متعدد سيلولاريتي13،14، الاعتراف بالقربى15،16، ويعزل الإيثار سلوك الخلوية، التي تعتمد أساسا على استخدام البرية الطازجة معزولة من نوع17. جميع المذكورة يمكن تيسير مجالات البحث بأساليب تتسم بالكفاءة للتحوير الوراثي يعزل البرية، وهي غير أكسينيك ولا تنمو في المرق السائل.
لدينا بروتوكولات تسمح للتغلب على أوجه القصور الموصوفة. أخذت معا، إمكانية أداء التلاعبات الجينية مع البكتيريا نمت الخلايا ديسكويديوم دال- يحمل فوائد لجميع الباحثين ديكتيوستيليوم ، حتى لو أنها مجرد زيادة سرعة عملية الاختيار المقرر أن أسرع نمو الاميبا (ح 4 مضاعفة الوقت) على البكتيريا مقارنة بالنمو في وسائل الإعلام أكسينيك (10 ح مضاعفة الوقت).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:820px;" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Equipment</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-400-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">12823252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EP6331000025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gene Pulser X Cell, including CE &#38; PC modules</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Safety Cabinet Foruna - SCANLAF</td>
			<td style="width:184px;">Labogene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BioPhotometer Plus</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CLSM 710</td>
			<td style="width:184px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Media &#38; Agaroses</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LoFlo Medium</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LF0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:184px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Low EEO Agarose</td>
			<td style="width:184px;">BioGene</td>
			<td style="width:119px;">300-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Purified Agar</td>
			<td style="width:184px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SM broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">SMB0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2x LB broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LBD0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Chemicals</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HEPES free acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">391340 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">P/4800/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">Na2HPO4 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2 * 6 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">5982 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">CaCl2 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">442909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KOH</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">26668.263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cultur Dishes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5</td>
			<td style="width:184px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:119px;">P50G-1.5-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Geneticin G418-sulphate</td>
			<td style="width:184px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hygromycin B Gold</td>
			<td style="width:184px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Additional Consumables</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2mm gap electroporation cuvettes, long electrode</td>
			<td style="width:184px;">Geneflow Limited</td>
			<td style="width:119px;">E6-0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10 &#181;l Inoculating Loop, Blue 10 Micro L</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">129399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Spreader, L-shaped, sterile</td>
			<td style="width:184px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">730190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Combitips advanced 5 ml</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf BIOPUR</td>
			<td style="width:119px;">30089669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Kits</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ZR Plasmid Miniprep Classic</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D4016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Quick DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zymoclean DNA Recovery Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Enzymes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0482L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td style="width:184px;">TakaraBio</td>
			<td style="width:119px;">R045A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria

ديسكويديوم ديكتيوستيليوم كائن حي نموذجية مثيرة للاهتمام لدراسة عمليات تمييز الخلية أثناء التنمية والخلية الإشارات والأسئلة الهامة البيولوجيا الخلوية الأخرى. التكنولوجيات المتاحة للتلاعب وراثيا بخلايا ديكتيوستيليوم متطورة جداً. ترانسفيكشنز يمكن أن يؤديها باستخدام علامات التحديد مختلفة وعلامة إعادة ركوب الدراجات، بما في ذلك جزئ مثلى والطفرات insertional. وهذا معتمد من قبل جينوم مشروحة جيدا. بيد أن هذه النهج هي الأمثل لخطوط الخلايا أكسينيك المتنامية في الثقافات السائل ويصعب من تطبيق غير أكسينيك البرية من نوع الخلايا، التي تتغذى على البكتيريا فقط. الطفرات التي تكون موجودة في سلالات أكسينيك تخل برأس الإشارات، مما تسبب في ماكروبينوسيتوسيس المفرطة المطلوبة لتغذية، وتضعف الهجرة الخلية، مما يفند تفسير توصيل الإشارة وتجارب إنزيمية في هذه السلالات. محاولات سابقة للتلاعب وراثيا بخلايا غير أكسينيك تفتقر إلى الكفاءة والإجراءات التجريبية المعقدة المطلوبة. قمنا بتطوير بروتوكول تعداء بسيطة، للمرة الأولى، ويتغلب على هذه القيود. هذه السلسلة من التحسينات الكبيرة في علم الوراثة الجزيئي ديكتيوستيليوم السماح بالتلاعب بها بسهولة كما سلالات مختبرية قياسية البرية من نوع الخلايا. بالإضافة إلى المزايا لدراسة عمليات الإشارات وحركية غير المعطوب، يمكن طفرات التي تعطل النمو القائم على ماكروبينوسيتوسيس الآن سهولة معزولة. وعلاوة على ذلك، سير العمل تعداء كامل هو تسارع إلى حد كبير، مع المؤتلف الخلايا التي يمكن أن تتولد في أيام بدلاً من أسابيع. هناك ميزة أخرى أن علم الوراثة الجزيئي كذلك يمكن أن يؤديها مع معزولة طازجة البرية من نوع ديكتيوستيليوم عينات من البيئة. وهذا يمكن أن تساعد على توسيع نطاق النهج المستخدمة في هذه المجالات البحثية.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

الهندسة الوراثية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "الخلايا استناداً إلى" التحديد والنمو في البكتيريا

ديسكويديوم ديكتيوستيليوم كائن نموذج شعبية لدراسة العمليات الخلوية المعقدة مثل الهجرة الخلية والالتقام، والتنمية. الأداة المساعدة للكائن الحي يتوقف على إمكانية التلاعب بالجينات. نقدم هنا، أساليب ترانسفيكت الخلايا ديسكويديوم ديكتيوستيليوم أن التغلب على القيود القائمة لتثقيف الخلايا في سائل الإعلام.

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

قيمة هذا البروتوكول هو أنه يسمح تقريبا أي سلالة من discoideum dictyostelium أن يتم التلاعب بها من قبل علم الوراثة الجزيئية، بغض النظر عما إذا كانت تلك السلالة سوف تنمو axnically في المتوسطة السائلة أم لا. الميزة الأخرى لهذه التقنية هي أنها سريعة وبسيطة. نقل إلى الخلايا عبرfect مع البلازمي exochromosomal قبل البدء في مزج dictyosteliums.يمكن التحقق من صحة النتائج بالفعل بعد يومين من نقل الرضاخ باستخدام المجهر. ومن غير المعتاد العمل مع خلايا dictyostelium وتعليق البكتيريا. سوف التصور تساعد على إعطاء المجربين فكرة كيف يتم تنفيذ الخطوات المختلفة للبروتوكولات.إثبات الإجراء معي سيكون سودابة إيمانيكيا، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبري. للبدء، وإعداد 1000 ملليلتر من محلول عمل سورنسن العازلة مع كلوريد المغنيسيوم وكلوريد الكالسيوم وفقا لبروتوكول النص. بعد ذلك، استخدام مستعمرة واحدة من أيوجينات K لتطعيم لتر واحد من متوسطة LB.السماح للبكتيريا أن تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز. تدور الخلايا في اثنين من أنابيب الطرد المركزي 500 ملليلتر لحصاد الخلايا. ثم، وغسل البكتيريا مرة واحدة مع 500 ملليلتر من العازلة.إعادة بناء بيليه في 20 ملليلتر من العازلة. استخدم مقياس ضوئي للتحقق من الكثافة البصرية للعينة وتمييع العينة مع المخزن المؤقت حتى تبلغ الكثافة البصرية حوالي 100. بعد ذلك، قم بإعداد المخزن المؤقت للكهربة H40 وفقًا لبروتوكول النص.تنمو ك aerogenes لالتقاء متوسطة SM بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. إضافة 400 ميكرولترات من التعليق البكتيري إلى لوحة أجار SM ونشرها بالتساوي. ثم، واتخاذ حلقة عقيمة وتطعيم مع خلايا dictyostelium ونشر الخلايا على حافة واحدة من لوحة.احتضان لوحة في 22 درجة مئوية لمدة يومين، لضمان مناطق النمو كبيرة بما يكفي لtransfete. أضف 10 ملليلترات من تعليق الأيروجين K إلى طبق بيتري معالج بثقافة الأنسجة طوله 10 سنتيمترات. ثم، استخدم حلقة تطعيم 10 ميكرولتر يمكن التخلص منها لكشط الخلايا من مناطق النمو في لوحة الثقافة.نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر، التي تحتوي على الجليد الباردة H40 العازلة. تدور الخلايا لمدة ثانيتين في 10000 مرة الجاذبية. ثم، تجاهل عظمى وإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت H40.بعد ذلك، أضف 100 ميكرولترات من الخلايا إلى أنبوب يحتوي على ميكروغرام واحد إلى اثنين من الحمض النووي. الماصات صعودا وهبوطا لخلط ونقل خليط الحمض النووي الخلية إلى cuvette الكهربائي قبل المبردة. لا تضيف أكثر من اثنين من ميكروغرام من الحمض النووي.أعلى تركيز الحمض النووي هي سامة للخلايا والحد من الكفاءة. بعد الكهربة، نقل الخلايا على الفور إلى طبق بيتري معد 10 سنتيمترا والسماح للخلايا للتعافي لمدة خمس ساعات. لتحديد transfectant لضربة قاضية ، بالضربة القاضية ، أو فعل خمسة في الضربة القاضية ، وفصل الخلايا من طبق بيتري عن طريق الأنابيب السائل على السطح.ثم، اقامة ثلاثة تخفيفات من عامل انتقائي وفقا لبروتوكول النص. وأخيرا، توزيع 150 ميكرولترات من التخفيفات المعدة في كل بئر من 96-جيدا مسطح القاع لوحات ثقافة الأنسجة. في هذا البروتوكول، تم عرض نظام بلازمي خارج هتكروموسوم مراسل مزدوج.بعد 32 ساعة من عملية التهيّن، عبّرت غالبية الخلايا عن كلا بروتينات الانصهار ذات التسمية الفلورية. كما حاول قانون خمسة M الكرز طرق الدخول وNNC4. تم الحصول على اثنين من العصابات بعد تشغيل هضم على هلام agarose.يحتوي شريط زوج 4127 الأساسي على البناء المطلوب. تم استخدام الحمض النووي المنقى لتحول خلايا NC4. تم تحليل اثنين من استنساخ من نقل NC4 عن طريق PCR وكلاهما أظهر أنماط الفرقة المتوقعة.ثم استخدمت البقعة الجنوبية للتحقق من صحة نتائج PCR. نمت NC4 بشكل أسرع على المروج البكتيرية من خلايا Ax2. بعد أربع ساعات، تمكن المزيد من خلايا NC4 من الزحف تحت أغاروز من خلايا Ax2.كانت خلايا NC4 أسرع وأظهرت استجابة كيمائية أقوى للفولات من خلايا Ax2. دائما استخدام الخلايا من إعداد حديثا حتى لوحات SM. أبدا استخدام الخلايا أقدم من أربعة أيام، وإلا سوف تنخفض الكفاءة.سلالات هايب البيضاء المعزولة حديثاً، غير إضاءات يشيع استخدامها لمعالجة الأسئلة المتعلقة بالسلوك الاجتماعي أو السلوك الاجتماعي للديكتيوستيليوم. يسمح لدينا لتطبيق علم الوراثة الجزيئية من خلال تلك العزلات.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

الهندسة الوراثية من الخميرة غير تقليدية للالمتجددة الوقود الحيوي وإنتاج البيوكيميائية

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

تصميم واستخدام ومنخفضة التكلفة، الآلي Morbidostat عن التكيف تطور البكتيريا تحت المضادات الحيوية اختيار الدواء

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

تقييم التلوث الحمض النووي في عينات الحمض النووي الريبي استناداً إلى ريبوسومال الحمض النووي

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

واحدة تحليل جزيء من الليزر المترجمة السورالين Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

تحليلات البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي باستخدام قاعدة البيانات أوبينبروت لكشف النقاب عن البروتينات رواية مترجمة من إطارات القراءة المفتوحة غير متعارف عليه

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

الشاشات الوراثية المجمعة المستندة إلى كريسبر في خلايا الثدييات

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

رسم الخرائط الوراثية للاختلافات التسامح الحراري بين أنواع الخميرة Saccharomyces عن طريق تحليل الهيميزيغوستي على نطاق الجينوم المتبادل

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...