Name: genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Forfatterne takke Kay lab for input til denne metode og LMB mikroskopi og flow flowcytometri faciliteter for fremragende videnskabelig og teknisk støtte. Dette arbejde blev finansieret af Medical Research Council grant MC_U105115237 til R. R. Kay, BBSRC (bioteknologi og biologiske Sciences Research Council) tilskud BB/K009699/1 til R. R. Kay, Cancer Research UK give A15672 til R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867, Z, 16/Z til Jonathan R Chubb og MRC finansiering (MC_U12266B) til MRC LMCB Universitet enhed på UCL.

<ol>
	<li>Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Dictyostelium+discoideum.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum.</a> Development. 138 (3), 387-396 (2011).</li><li>Sussman, R., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Dictyostelium+discoideum+in+axenic+culture.">Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).</li><li>Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+the+Dictyostelium+alpha-actinin+gene+leads+to+an+altered+mRNA+and+lack+of+the+protein.">Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein.</a> The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).</li><li>De Lozanne, A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+Dictyostelium+myosin+heavy+chain+gene+by+homologous+recombination.">Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination.</a> Science. 236, 1086-1091 (1987).</li><li>Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+transient+expression+system+for+Dictyostelium+discoideum.">Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum.</a> Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).</li><li>Knecht, D., Pang, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Dictyostelium+discoideum.">Electroporation of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).</li><li>Wetterauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+strains+of+Dictyostelium+discoideum+can+be+transformed+using+a+novel+selection+cassette+driven+by+the+promoter+of+the+ribosomal+V18+gene.">Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene.</a> Plasmid. 36, 169-181 (1996).</li><li>Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditions+for+the+transformation+of+nonaxenic+Dictyostelium+strains.">Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains.</a> Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).</li><li>Bloomfield, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+controls+macropinocytosis+and+phagocytosis+in+Dictyostelium.">Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP(3)-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Hoeller, O., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+the+absence+of+PIP3+gradients.">Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients.</a> Current Biology. 17, 813-817 (2007).</li><li>Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dictyostelium+RasS+protein+is+required+for+macropinocytosis,+phagocytosis+and+the+control+of+cell+movement.">The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement.</a> Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).</li><li>Schaap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phylogeny+and+evolution+of+morphology+in+the+social+amoebas.">Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas.</a> Science. 314, 661-663 (2006).</li><li>Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+Aggregative+Multicellularity+and+Cell-Cell+Communication+in+the+Dictyostelia.">The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).</li><li>Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+in+social+amoebae+is+mediated+by+allelic+pairs+of+tiger+genes.">Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes.</a> Science. 333 (6041), 467-470 (2011).</li><li>Strassmann, J. E., Queller, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+cooperation+and+control+of+cheating+in+a+social+microbe.">Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).</li><li>Wolf, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+Trade-offs+Result+in+the+Illusion+of+Social+Success.">Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success.</a> Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).</li><li>Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+set+of+small,+extrachromosomal+expression+vectors+for+Dictyostelium+discoideum.">A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum.</a> Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).</li><li>Woznica, D., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under-agarose+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).</li><li>Dubin, M., Nellen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+set+of+tagged+expression+vectors+to+monitor+protein+localisation+and+function+in+Dictyostelium.">A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium.</a> Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).</li><li>de Hostos, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+mutants+lacking+the+cytoskeletal+protein+coronin+are+defective+in+cytokinesis+and+cell+motility.">Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility.</a> Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).</li><li>Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+targeting+of+multiple+genes+in+Dictyostelium.">CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).</li><li>Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+harbours+for+the+integration+of+new+DNA+in+the+human+genome.">Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).</li><li>Rosengarten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaps+and+lulls+in+the+developmental+transcriptome+of+Dictyostelium+discoideum.">Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum.</a> BMC Genomics. 16, 294 (2015).</li><li>Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-mediated+diversification+of+transcriptional+bursting+dynamics+following+gene+duplication.">Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).</li><li>Gebbie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phg2,+a+kinase+involved+in+adhesion+and+focal+site+modeling+in+Dictyostelium.">Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.

Brug af ikke-axenic, wild-type Dictyostelium celler har været meget begrænset hidtil i molekylær forskning. Tilgængelige metoder til genetisk modificering af disse stammer har manglet pålidelighed og effektivitet23, forhindrer deres generelle vedtagelse. De genererede materialer og protokoller præsenteres her kan bruges til enhver D. discoideum stamme uafhængigt af dens evne til at vokse i flydende substrat. Det bør nævnes, at denne protokol er optimeret til NC4-afledte cellelinjer. Transfektion effektivitetsgevinster for frisk isolerede stammer fra naturen adskiller sig fra NC4, som vi har observeret før og er vist her for V12M2 og WS21628,9. Elektroporation betingelser synes især at have en betydelig indflydelse på Transfektion effektivitet og kan kræve yderligere optimering for nogle stammer. Generelt, en tilstrækkelig mængde af transfectants er blevet observeret i alle stammer testet hidtil, viser, at disse metoder er gennemførlige. Antallet af positive transfectants opnås ved hjælp af NC4-afledte stammer er højere i forhold til andre ikke-axenic stammer, wild-type, men i alle tilfælde, er tilstrækkeligt antal transfectants opnået for at give mulighed for yderligere eksperimenter. Det, plus enkelheden af vores protokol, er en stor forbedring i forhold til tidligere forsøg på8,9.
Disse nye ikke-axenic protokoller dække alle genetiske standardprocedurer og tilføje yderligere fordele, da transfections kan udføres hurtigt og effektivt i parallel. Positive kloner fås i dage snarere end uger, siden vækst på bakterier halvdele division tid. De nyoprettede plasmider også arbejder under axenic forhold og kan være rutinemæssigt anvendes under begge vækstbetingelser, der er en anden udvikling af denne methology22. Som blev indført i protokollen, plasmid brugt til valg på bakterier har særlige krav, der er afgørende for succes af Transfektion. Især er initiativtagerne kørsel udtryk og modstand-kassetter vigtige for vellykket Transfektion. Ofte brugte act6 (aktin 6) promotor24 for at køre modstand eller udtryk kassetter mangler effektivitet, når celler dyrkes på bakterier. I vores plasmid system drev meget aktive act15 (aktin 15) selskabet alle udtryk kassetter, mens modstand kassetter er under kontrol af en coA (coactosin A) promotor, både som er aktiv på axenic vilkår og i celler dyrkes på bakterier. Krav til udtryk for reporter konstruktioner samt knock-i og knock-out konstruktioner gør det nødvendigt at bruge vores plasmid repertoire, men desværre begrænser brugen af vektorer allerede oprettet som bruger ineffektive act6 promotor.
Promotor effektivitetsgevinster er især kritisk til transfections, der afhænger af en enkelt integration begivenhed i den korrekte genomisk locus. På grund af vores forbedring af initiativtagerne kørsel resistens Gen-ekspression, er nok modstand protein produceret fra enkelt locus integrationer. En stor bekymring var favorisere af flere integrationer i genomet, når du bruger hygromycin eller G418 som beskrevet. Ingen favorisere af flere integrationer er blevet observeret så langt, som rapporteret tidligere for G418 markeringer med ældre promotor systemer25. Dette betyder, at både hygromycin og G418 er egnede valgbare markører for generation af ren knock-outs og knock-ins. Desværre, valgbar markør blasticidin fungerer ikke på ikke-axenic betingelser. Dette er en større ulempe for vores metode, da blasticidin modstand kassettebånd bruges rutinemæssigt til at generere knock-out konstruktioner i D. discoideum. Konstruktioner, der allerede blev genereret med blasticidin modstand kassetter skal være rederived ved hjælp af en af de anvendelige valgbare markører. En anden mulighed for at overvinde denne begrænsning er at kombinere den nyligt etablerede axenic D. discoideum CRISPR teknologi med denne Transfektion protokol26. Generation af egnet, enkelt guide RNA'er (sgRNAs) er enklere og hurtigere end genopbygningen af komplet knock-out konstruktioner. For fremtidige retninger, mulighed for at generere flere knock-outs ved hjælp af CRISPR/Cas9 kombineret med protokollens Transfektion er tiltalende og kan bane vejen for mange forskere i Fællesskabets Dictyostelium . Dog bør gennemførligheden af de etablerede forbigående ekspressionssystem anvendes til CRISPR/Cas9 i axenic dyrkede celler undersøges nøje.
Act5 banke-in system præsenteret tilbyder en pålidelig og sikker integrationssystem for generation af stabil cellelinjer i D. discoideum, med fordelen, at lignende sider etableret i andre organismer22. Det også afhænger af en enkelt integration begivenhed i genomet og tilbyder mange muligheder for forskellige retninger. Act5 promotor er stærkt aktiv og garanterer næsten homogent udtryk27 uafhængige af dyrkning betingelser. Fluorescerende reporter proteiner kan nemt integreres i dette fristed locus ved hjælp af de manipuleret målretning plasmider. Dette kan være nyttigt, for eksempel til celle-sporing formål, som vist her i en mix eksperiment. Cellerne Vis minimal celle til celle udtryk variabilitet, som kan hjælpe med automatiseret celle sporing. Vigtigere, vises indsættelsen af en ønsket rækkefølge i den handle5 locus fænotype neutral28,29. Som udtrykket ikke afhænger af en valgbar markør til at opretholde protein udtryk, som det ses i tilfældig integrants eller extrachromosomal vektor-bærende cellelinjer, kan act5 system være nyttige for redning eksperimenter, så godt. Da cellelinjer er homogen, kan alle celler analyseres. Det er ikke muligt ved hjælp af en extrachromosomal plasmid for udtryk, hvor der er stor heterogenitet i udtryk.
Ud over disse generelle forbedringer for alle stammer giver evne til at bruge ikke-axenic wild-type celler for Molekylær forskning en vurdering af virkningerne af akkumulerede mutationer i nuværende laboratorium stammer. Flere genetiske rearrangementer er blevet fundet siden vedtagelsen af Ax2 stamme i 1970, som det fremgår af tidligere udgivne microarray analyser26. Syntetisk fænotyper overholdes på grund af tilstedeværelsen af disse mutationer. For eksempel viser en rapporteret phg2 mutant nedsat adhæsion i ét laboratorium stamme baggrund og øget friktion i en anden3. Disse modstridende data kan nu løses ved at gentage forsøget i den fælles forfader stamme (i dette tilfælde, DdB). Styrken af denne tilgang har for nylig vist sig for den lille GTPase RasS30,31.
Evnen til at udføre genetiske eksperimenter i enhver D. discoideum stamme udvider potentiale af nye forskning retninger, der afhænger af brugen af vilde isolater, især dem der involverer social evolution, kin anerkendelse og seksuel cyklus22.

Dictyostelium -slægten er jordlevende sociale amøbe, der primært lever af bakterier. Lægges i phylum Amoebozoa, et stort antal arter er blevet isoleret, kan inddeles i fire forskellige klader1. Arter Dictyostelium discoideum (D. discoideum) er blevet en populær model organisme at studere komplekse cellulære processer såsom celle migration og fagocytose. At kontrollere og standardisere forsøgsbetingelser, axenic celle linjer er blevet udviklet, som er i stand til at vokse i komplekse eller definerede flydende medium i mangel af bakterier2. Af særlig betydning er Ax2, Ax3, og Ax4 stammer, som blev genereret i 1970 ' erne og i sidste ende stammer fra en enkelt vild isolere NC43. Værktøjer til genteknologi blev udviklet i disse axenic stammer, hvilket resulterer i den første offentliggjorte knockout i 19874,5. Protokoller blev yderligere udviklet og optimeret til brug under axenic forhold6,7.
Tilpasning af disse protokoller til wild-type D. discoideum stammer, der ikke er i stand til at vokse i flydende bouillon har været forsøgt af flere laboratorier. Men dette er ikke blevet fuldt ud vellykket da Transfektion protokoller er komplekse og manglende effektivitet, delvis på grund af kapacitet af bakterierne til at fungere som en vask for selektiv reagenser8,9. Som et resultat, kommer det væsentlige alle molekylære data på D. discoideum fra efterkommere af en enkelt vildtype isolat. Vi ønskede at overvinde denne begrænsning og udvikle en metode til at genetisk ændre D. discoideum celler uafhængigt af deres evne til at vokse i flydende substrat. Behovet for en sådan metode kan forklares ved den konstatering, at det blev antaget i fortiden, at mutationer giver mulighed axenic vækst var overvejende neutrale og ikke forringe celle fysiologi. Denne antagelse er kun delvist korrekt. Generelt er der to markante forskelle; først, mellem de forskellige isoleret axenic stammer, og for det andet, hvornår disse axenic stammer er sammenlignet med ikke-axenic vilde isolater8,9.
Måske er den mest kritiske faktor den vigtigste axenic gen, axeB, der blev identificeret for nylig som RasGAP NF1. Den vigtigste funktion af NF1 som en RasGAP er at begrænse Ras aktivitet3. Sletning af enzym i alle axenic stammer fører til overdreven Ras aktivitet manifesteret som dannelsen af store aktive Ras patches. Disse udvidede Ras patches føre til ophobning af PIP3 i plasma membranen. De tilfældigt optræder lapper af PIP3 og aktiv Ras er en skabelon for dannelsen af en cirkulær flæse, der til sidst lukkes og fører til dannelsen af macropinosomes10. Konsekvensen er en for stor stigning i macropinocytic aktivitet. Macropinocytosis er en actin-drevet proces. En konkurrence for cytoskeletal komponenter for dannelsen af enten macropinosomes eller pseudopods er resultatet. Dens indvirkning på celle adfærd er afspejlet i den næsten komplet forebyggelse af chemotaxis vegetative celler til folat11. De massivt forstørret PIP3 patches er meget persistent. Selv i sultet celler, PIP3 patches forblive og kan mistolkes som pseudopods, som kan forårsage problemer tolkning undersøgelser på chemotaxis til lejren.
I nogle tilfælde er NF1 mutation eksperimentelt nyttige. Dette fører os til en anden motivation for at udvikle en Transfektion metode for bacterially dyrket D. discoideum celler, da stigningen i macropinocytosis sats gør axenic celler værdifulde for at undersøge grundlæggende aspekter af denne proces12 . Mutation i de gener, der er nødvendige for macropinocytosis, som Ras og PI3-kinaser10, har dog næsten afskaffet axenic vækst, hvilket gør det nødvendigt at manipulere disse celler gennem vækst på bakterier. En anden grund, der gengiver bakterier-baseret transfections værdifulde er den øgede anvendelse af Dictyostelids til at undersøge spørgsmål i udviklingen af multi celleforandringer13,14, kin anerkendelse15,16, og altruistiske cellulære adfærd, som hovedsagelig afhænger af anvendelsen af frisk isolerede vildtype isolerer17. Alle nævnte forskningsområder kan lettes ved effektive metoder til genetisk manipulation af vilde isolater, som er ikke-axenic og dyrker ikke i flydende bouillon.
Vores protokoller giver mulighed for at overvinde de beskrevne begrænsninger. Tilsammen, mulighed for at udføre genetiske manipulationer med bakteriel vokset D. discoideum celler rummer fordele for alle Dictyostelium forskere, selv om det er bare den øget hastighed af udvælgelsesprocessen grund hurtigere vækst af amoeba (4 h fordobling tid) på bakterier i forhold til væksten i axenic medier (10 h fordobling tid).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:820px;" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Equipment</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-400-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">12823252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EP6331000025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gene Pulser X Cell, including CE &#38; PC modules</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Safety Cabinet Foruna - SCANLAF</td>
			<td style="width:184px;">Labogene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BioPhotometer Plus</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CLSM 710</td>
			<td style="width:184px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Media &#38; Agaroses</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LoFlo Medium</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LF0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:184px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Low EEO Agarose</td>
			<td style="width:184px;">BioGene</td>
			<td style="width:119px;">300-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Purified Agar</td>
			<td style="width:184px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SM broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">SMB0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2x LB broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LBD0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Chemicals</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HEPES free acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">391340 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">P/4800/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">Na2HPO4 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2 * 6 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">5982 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">CaCl2 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">442909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KOH</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">26668.263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cultur Dishes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5</td>
			<td style="width:184px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:119px;">P50G-1.5-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Geneticin G418-sulphate</td>
			<td style="width:184px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hygromycin B Gold</td>
			<td style="width:184px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Additional Consumables</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2mm gap electroporation cuvettes, long electrode</td>
			<td style="width:184px;">Geneflow Limited</td>
			<td style="width:119px;">E6-0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10 &#181;l Inoculating Loop, Blue 10 Micro L</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">129399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Spreader, L-shaped, sterile</td>
			<td style="width:184px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">730190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Combitips advanced 5 ml</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf BIOPUR</td>
			<td style="width:119px;">30089669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Kits</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ZR Plasmid Miniprep Classic</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D4016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Quick DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zymoclean DNA Recovery Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Enzymes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0482L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td style="width:184px;">TakaraBio</td>
			<td style="width:119px;">R045A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria

Dictyostelium discoideum er en spændende model organisme for studiet af celle differentiering processer under udvikling, celle signalering, og andre vigtige cellebiologi spørgsmål. De tilgængelige at genmanipulere Dictyostelium celler teknologier er veludviklet. Transfections kan udføres ved hjælp af forskellige valgbare markører og markør igen cykling, herunder homologe rekombination og pattedyrsceller mutagenese. Dette understøttes af et godt kommenteret genom. Men disse tilgange er optimeret til axenic cellelinjer vokser i flydende kulturer og er vanskelige at anvende til ikke-axenic wild-type celler, der lever kun af bakterier. De mutationer, der findes i axenic stammer forstyrre Ras signalering, forårsager overdreven macropinocytosis kræves til fodring, og forringe celle migration, som tilintetgør fortolkning af signaltransduktion og chemotaxis eksperimenter i disse stammer. Tidligere forsøg på at genmanipulere ikke-axenic celler har manglet effektivitet og krævede komplekse eksperimentelle procedurer. Vi har udviklet en simpel Transfektion protokol, der for første gang, overvinder disse begrænsninger. Disse serier af store forbedringer til Dictyostelium molekylær genetik tillade wild-type celler til at være manipuleret så let som standard laboratorium stammer. Ud over fordelene for at studere ufordærvede signalering og motilitet processer, kan mutanter, der forstyrrer macropinocytosis-baserede vækst nu let isoleret. Derudover er hele Transfektion arbejdsprocessen meget fremskyndet, med rekombinant celler, der kan genereres i dage snarere end uger. En anden fordel er, at molekylær genetik yderligere kan udføres med frisk isolerede vildtype Dictyostelium prøver fra miljøet. Dette kan bidrage til at udvide anvendelsesområdet for metoder, der anvendes i disse forskningsområder.

Extrachromosomal plasmider bruges til reporter undersøgelser, som har til formål at identificere lokalisering af visse proteiner inde i en celle eller ændringer i cellestruktur af muterede celler. For mange tilgange, såsom kontrol af cellecyklus, er det afgørende at udtrykke to journalister på samme tid. Det er nu muligt ved hjælp af vores dual reporter extrachromosomal plasmid system (tabel 1). På dag 1, var celler transfekteret før du tilføjer den valgbar markør G418 efter 5 h (figur 1). I eksemplet, NC4, DdB, Ax2 og uafhængigt afledte vilde isolaterne V12M2 og WS2162 (supplerende tabel 1) var transfekteret med plasmidet pPI289, som koder for normal god landbrugspraksis-TubulinA, en markør for mikrotubuli og mCherry-PCNA, et protein, der er bruges til at overvåge celle cyklus (figur 2A). Efter 32 h, blev cellerne observeret under mikroskop. Fleste celler udtrykt både fluorescerende-mærket fusion proteiner, rapporter konsistent med tidligere dette udtryk af to journalister fra de samme plasmid viser lignende udtryk niveauer, som er næsten umuligt, når du bruger to forskellige plasmider 18,19. En repræsentativ celle for hver cellelinje (NC4, DdB, Ax2, V12M2 og WS2162) udtrykker det ønskede dual reporter er vist i figur 2B. Transfektion effektivitetsgevinster er sammenfattet i fig.2 C. NC4-afledte cellelinjer vise de bedste Transfektion effektivitetsgevinster. Men for cellelinjer, V12M2 og WS2162, et betydeligt stort antal transfectants blev opnået.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig2.jpg"> Figur 2 : Udtryk for en extrachromosomal plasmid. (A) Extrachromosomal plasmider er direkte transfekteret i cirkulær form. Som et eksempel, er dobbelt reporter pPI289 vist. NgoMIV websteder angive indsættelse af den anden reporter i extrachromosomal udtryk plasmid. (B) Z-projektion af en repræsentativ celle udtryk for normal god landbrugspraksis-TubulinA (cytoplasmatisk) og mCherry-PCNA (overvejende nukleare) for fem forskellige wild-type cellelinier anvendes (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C) Transfektion effektivitetsgevinster for de fem cellelinjer afbilledet i (B) blev beregnet. Vist er gennemsnit af to eksperimenter. Fejllinjer angive ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Integration af en målretning vektor i en bestemt genomisk locus er mere udfordrende og kræver mere grundig analyse af den genererede cellelinie. I figur 3forsøges en act5- mCherry KI i NC4. Først, plasmidet skal være lineariseret for at øge hyppigheden af rekombination begivenhederne efter Transfektion. For dette, er plasmidet pDM1514 skåret med NgoMIV. To bands er fremstillet efter løb digest'en på en agarosegel. 4127 bp band indeholder de ønskede konstruktion (figur 3). For Transfektion, fordøjet DNA skal udvindes fra gel og renset ved hjælp af en gel udvinding kit efter fabrikantens anvisninger.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig3.jpg"> Figur 3 : Udarbejdelse af act5 knock-i og DNA for Transfektion. Et eksempel på brugen af en handle5 knock-i plasmidet pDM1514 er vist. Forberedelsestrinnene er opført som følger. (A) før elektroporation, linearize plasmid ved hjælp af de angivne NgoMIV websteder. (B, C) Køre de afskårne plasmid på en agarosegel, indtil de to forventede bands er korrekt separeret. Skåret ud 4127 bp bandet indeholdende rekombination våben, mCherry og modstand-kassetten, og gel uddrag DNA. DNA er nu klar til Transfektion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Oprenset DNA blev brugt til Transfektion af NC4 celler. Efter 5-6 dage af udvælgelsen, var kloner opnået. Repræsentative Transfektion effektivitetsgevinster og mængden af positivt identificeret kloner for flere act5 knock-i forsøg er sammenfattet i tabel 3. To kloner af NC4 Transfektion var tilfældigt valgt og analyseret af PCR (figur 4A), og begge viste de forudsagte band mønstre forventes af en knock-i og blev yderligere bekræftet med det sydlige skamplet analyse til at sikre en enkelt integration tilfælde af construct i genom20. Skamplet viser en klar enkelt integration i det ønskede act5 locus (fig. 4B). Den genererede NC4::act5-mCherry -cellelinie kan nu anvendes i eksperimenter.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig4.jpg"> Figur 4 : Validering af act5- mCherry KIs i NC4. (A) ordning og kontrol PCR'er for validering af positive integrationer til act5 locus. De angivne primere blev brugt til at analysere to uafhængige kloner og overordnet. Begge kloner viser de forventede bands for modstand-kassette og downstream (P1) eller opstrøms primer (P2), som ikke er til stede i forældrenes stammen. Primer kombination (P1/P2) bekræfter den korrekte integration af mCherry og modstand kassette i act5 locus. Wild-type NC4 viser den forventede 2800 bp band, mens begge KI kloner mangler dette band og i stedet vise en PCR produkt om 1400 basepar større. (B) ordning for brugte begrænsning digest og sydlige skamplet. Begge knock-i kloner Vis mindre 3400 bp bandet, som er resultatet af integrationen af konstruktionen i det handle5 locus, specielt den yderligere Bcljeg site i hygromycin modstand kassette. Wild-type kontrolelement viser den forventede 5,8 kb som følge af de to nedstrøms beliggende Bcljeg websteder. Skamplet blev beskåret og splejset for klarhed. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>målrettet konstruktion til act5 locus</td>
			<td>plasmid navn</td>
			<td>antallet af besatte brønde</td>
			<td>antallet af kontrollerede kloner</td>
			<td>Positive kloner</td>
			<td>Korrekte kloner (%)</td>
			<td>Dictyostelium stamme bruges</td>
			<td>Transfektion effektivitet (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µg DNA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-mCherry</td>
			<td>pPI226</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>14.2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-normal god landbrugspraksis</td>
			<td>pPI227</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>5</td>
			<td>41,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>6 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>66,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>66</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td>55,5</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.3 x 10 ^ -5</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>221</td>
			<td>12</td>
			<td>10</td>
			<td>83,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.1 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>85,7</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>70</td>
			<td>DdB</td>
			<td>5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>240</td>
			<td>12</td>
			<td>11</td>
			<td>91,6</td>
			<td>DdB</td>
			<td>1.2 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>320</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>100</td>
			<td>NC4</td>
			<td>1,6 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Transfektion effektivitetsgevinster og mængden af opnået positive transfectants for generation af act5 KIs i forskellige stamme baggrunde 22 .
Den handle5 locus tilbyder relativt homogent udtryk for integreret reporter21. De genererede NC4::act5-mCherry celler tillade mix forsøg skal udføres med andre act5 knock-ins ved hjælp af en forskellige fluorescerende protein som normal god landbrugspraksis. For at understrege den store fordel ved dette system, er blande eksperimenter med Ax2::act5-normal god landbrugspraksis vist. På grund af manglende evne til at transfect ikke-axenic wild-type celler, kunne denne form for tilgang ikke udføres før. Mix eksperimenter er et vigtigt redskab til at analysere celle adfærd, fordi de tillader en direkte sammenligning mellem forskellige cellelinjer oplever samme forsøgsbetingelser. NC4 celler vokse hurtigere på bakteriel græsplæner end Ax2 celler (figur 5A). Dette kan skyldes en højere kapacitet til phagocytosis bakterier eller forbedret evne til at flytte og Vis chemotaxis mod en fødekilde. Ved hjælp af en manglende agar folat chemotaxis assay, var direkte sammenligning af en population af NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-normal god landbrugspraksis udført, viser, at NC4::act5-mCherry er meget mere effektiv i folat sensing. Efter 4 h var flere NC4::act5-mCherry celler i stand til at kravle ind under Agarosen end Ax2::act5-NGL celler (figur 5B). Analysere standard målinger af chemotaxis for celler migrerer under Agarosen viste, at NC4::act5-mCherry celler blev hurtigere og viste stærkere kemotaktisk respons end Ax2::act5-NGL celler (figur 5C-E ).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig5.jpg"> Figur 5 : Brug af handle5 KIs til image-baseret chemotaxis mix eksperimenter. (A) NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-NGL udtrykker den angivne fluorescerende protein fra den handle5 locus blev analyseret for mulighed for at vokse på en bakteriel græsplæne. Efter 4 dage, plaque diameter opstået fra ensomme forgyldt Dictyostelium celler blev målt. Ikke-axenic act5:: NC4 celler gøre betydeligt større plaques end axenic Ax2::act5-NGL celler (betyde ± SD, *** p < 0,0001, n = 3, skalere bar 5 mm). (B) For brug af under Agarosen folat chemotaxis assay22 at direkte sammenligne de kemotaktisk evner af NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-NGL anvendes i (A), bakterier-vokset amøber af begge stammer blev blandet i forholdet 50: 50. Celler fik lov til at kravle ind under agarosegelelektroforese. Efter 4 h, blev celler, der overfører op folat gradient afbildet ved hjælp af en Konfokal mikroskop. Antallet af NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-NGL celler blev derefter bestemt. NC4::act5-mCherry celler blev mere effektiv i sensing folat. Om 10-fold mere NC4::act5-mCherry celler blev fundet i forhold til Ax2::act5-NGL celler (betyde ± SD, *** p < 0,0001, n = 6, skala bar 100 µm). (C, D) Cellerne blev filmet i 60 min., og deres hastighed og kemotaktisk indeks blev beregnet. Efter foreløbig udvælgelse af de mest chemotactically lydhør celler (kun dem, der overføres under Agarosen), celler Ax2::act5-NGL viste lavere værdier for både celle hastighed og chemotaxis. Halvtreds celler pr. cellelinje blev analyseret. (median ± SD, * p < 0,01, n = 3). (E) numre med NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-GFPact5 knock-ins afbildes over 60 min, viser bevægelsen mere rettet mod chemoattractent kilden til NC4::act5-mCherry celler (median ± SD, ** * p < 0,0001, n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Act5 banke-i cellelinjer kan også bruges til flowcytometri. Som med vækst på bakterier, er der store forskelle i udvikling mellem axenic stammer og ikke-axenic vilde-typer. Efter udvikling, frugtsætning organer af NC4 celler er omtrent dobbelt så store som dem, der stammer fra Ax2 celler. Hvis celler er blandet, opnås en mellemliggende størrelse frugtsætning krop. For at analysere de begge cellelinjer bidrag mere kvantitativt, blev flowcytometri brugt. Disse analyser viste klart, at de mellemliggende mellemstore frugtsætning organer er på grund af forskellige niveauer af bidrag fra begge cellelinjer. Mens NC4::act5-mCherry celler lavet op omkring 75% af de målte sporer, bidrog Ax2::act5-NGL kun 25%, afslører en potentiel fitness fordel for ikke-axenic stammer (figur 6). Da analysen ikke overvåger stilk celle befolkning, er der to muligheder for at forklare ubalancen mellem Ax2 og NC4 udvikling. En mulighed er at Ax2 celler bidrager især til stilk cellen befolkningen i stedet ind i befolkningens spore celle. Alternativt, mere NC4 celler kan indtaste den udviklingsmæssige cyklus, med Ax2 relativt forsinket, og de er derfor ikke at bidrage til samling af et frugtsætning organ. Muligheden for at transfect ikke-axenic wild-type celler videreudvikler andre tilgange og forenkler eksperimentelle procedurer.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig6.jpg"> Figur 6: Act5 KIs Tillad analyse af mix eksperimenter ved hjælp af flowcytometri. (A) NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-normal god landbrugspraksis var udviklet separat eller i en 50: 50 blanding på ikke-næringsstoffer agar plader. NC4::act5-mCherry celler danner større frugtsætning organer end Ax2::act5-normal god landbrugspraksis. Mix i stedet viser en mellemliggende størrelse (skala bar 5 mm). Konfokal fluorescens lysmikroskopi foreslår en højere mængde af NC4::act5-mCherry sporer i spore hoveder stammer fra blandinger. (B) at kvantificere denne observation, mængder af sporer i høstede spore hoveder fra den blanding eksperiment i (A) blev analyseret ved flowcytometri. Omkring 75% af sporer stammer fra NC4::act5-mCherry celler, med kun 25% fra Ax2::act5-NGL celler. (C) repræsentative distribution af sporer fra begge cellelinjer, der er vist i et flow flowcytometri scatter. Ca. 0,05% vise positive mCherry og normal god landbrugspraksis signaler, tyder på at parasexual fusionsprocesser har fundet sted eller at sporerne stikker til hinanden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Cellelinie</td>
			<td>Genetisk baggrund</td>
			<td>Referencenummer</td>
			<td>Offentliggjort før</td>
			<td>Type</td>
		</tr>
<tr>
<td>AX2 (Ka)</td>
			<td></td>
			<td>DBS0235521</td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>vildtype</td>
		</tr>
<tr>
<td>NC4 (S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>vildtype</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::mCherry klon 5</td>
			<td>NC4</td>
			<td>HM1912</td>
			<td>Paschke et al., 2018</td>
			<td>act5 banke-i</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::GFP klon 2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>HM1930</td>
			<td>Paschke et al., 2018</td>
			<td>act5 banke-i</td>
		</tr>
<tr>
<td>V12M2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>vildtype</td>
		</tr>
<tr>
<td>WS2162</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>vildtype</td>
		</tr>
</tbody></table>Supplerende tabel 1: forskellige stammer af Dictyostelium studerede.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Gensplejsning af Dictyostelium discoideum celler baseret på udvælgelse og vækst på bakterier

Dictyostelium discoideum er en populær model organisme at studere komplekse cellulære processer såsom celle migration, endocytose og udvikling. Nytten af organismen er afhængig af muligheden for genmanipulation. Vi præsenterer her, metoder til at transfect Dictyostelium discoideum celler, at overvinde eksisterende begrænsninger af dyrkningsbaserede celler i flydende medier.

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Værdien af denne protokol er, at det tillader næsten enhver stamme af dictyostelium discoideum, der skal manipuleres af molekylær genetik, uanset om denne stamme vil vokse aksenisk i flydende medium eller ej. Den anden fordel ved denne teknik er, at det er hurtigt og enkelt. Transponer til transfectceller med en exochromosomal plasmid, før du begynder at blande dictyosteliums.Resultaterne kan allerede valideres to dage efter transfektion ved hjælp af mikroskopi. Det er usædvanligt at arbejde med dictyostelium celler og bakterier suspension. Visualisering vil bidrage til at give eksperimentatorer en idé om, hvordan er de forskellige trin i protokollerne udføres.Demonstration af proceduren med mig vil være Soudabeh Imanikia, en postdoc fra mit laboratorium. Til at begynde, forberede 1000 milliliter sørensen buffer arbejdsopløsning med magnesiumchlorid og calciumchlorid i henhold til tekstprotokollen. Efter dette, skal du bruge en enkelt koloni af K aerogener til at vaccinere en liter LB medium.Lad bakterierne vokse natten over ved 37 grader celsius med rystelser. Drej cellerne ned i to 500 milliliter centrifuge rør til at høste cellerne. Derefter vaskes bakterierne en gang med 500 milliliter buffer.Opslæm pellet i 20 milliliter buffer. Brug et fotometer til at kontrollere prøvens optiske tæthed og fortynde prøven med buffer, indtil den optiske tæthed er ca. 100. Derefter forberedes H40-elektroporationsbufferen i henhold til tekstprotokollen.Dyrk K aerogene til sammenløbet en SM medium natten over ved stuetemperatur. Tilføj 400 mikroliter af bakteriel suspension til en SM agar plade og sprede det jævnt. Derefter tage en steril løkke og inokulere det med dictyostelium celler og sprede cellerne på den ene kant af pladen.Inkuber pladen ved 22 grader Celsius i to dage for at sikre, at vækstzonerne er store nok til transfektion. Tilføj 10 milliliter K aerogene suspension til en 10 centimeter væv kultur-behandlet petriskål. Brug derefter en 10 mikroliter engangsookuleringsløkke til at skrabe celler fra vækstzonerne på kulturpladen.Cellerne overføres til et 1,5 milliliterrør, der indeholder iskold H40-buffer. Drej cellerne i to sekunder ved 10000 gange tyngdekraften. Derefter kasseres supernatanten og opslæm cellerne i H40 buffer.Dernæst tilsættes 100 mikroliter af cellerne til et rør, der indeholder et til to mikrogram DNA. Pipette op og ned for at blande og overføre celle-DNA-blandingen til en forkølet elektroporationskjille. Tilsæt ikke mere end to mikrogram DNA.Højere DNA-koncentration er giftige for cellerne og reducerer effektiviteten. Efter elektroporation, straks overføre cellerne til en forberedt 10 centimeter petriskål og lad cellerne til at inddrive i fem timer. Hvis du vil vælge et transfectant til en knock-out, knock-in eller en handling fem knock-in, skal du tage cellerne ud af petriskålen ved at pipettere væske over overfladen.Derefter skal du oprette tre fortyndinger af det selektive middel i henhold til tekstprotokollen. Endelig distribuere 150 mikroliter af de forberedte fortyndinger i hver brønd af 96-godt fladbundet væv kultur plader. I denne protokol blev der påvist et dobbelt reporter ekstrakromosomalt plasmidsystem.32 timer efter transfektion udtrykte de fleste celler begge fluorescerende mærkede fusionsproteiner. En handling fem M kirsebær knock-in og en NC4 blev også forsøgt. To bånd blev opnået efter at have kørt fordøje på en agarose gel.4127-grundparbåndet indeholder den ønskede konstruktion. Det rensede DNA blev anvendt til transinfektion af NC4-celler. To kloner af NC4 transinfektion blev analyseret via PCR og begge viste den forudsagte band mønstre.Southern blot blev derefter brugt til at validere resultaterne af PCR. NC4 voksede hurtigere på bakteriegræsplæner end Ax2-celler. Efter fire timer, flere af NC4 celler var i stand til at kravle under agarose end Ax2 celler.NC4-cellerne var hurtigere og viste stærkere chemotactic respons på folat end Ax2-cellerne. Brug altid celler fra nyudstændede SM-plader. Brug aldrig celler, der er ældre end fire dage, ellers vil effektiviteten falde.Frisk isoleret, ikke-berusende, hvide HAP stammer er almindeligt anvendt til at behandle spørgsmål vedrørende en ruching eller social adfærd dictyosteliums. Vores gør det muligt at anvende molekylær genetik gennem disse isolater.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Genetic Engineering af en utraditionel Gær for Vedvarende Biobrændsel og biokemisk Produktion

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Design og brug af en Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution Bacteria Under antibiotikum Drug Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugering Parring Analyser for Sekvens-specifik analyse af Transfer proteiner involveret i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering af DNA forurening i RNA prøver baseret på ribosomale DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Single Molecule Analyse af Laser Lokaliserede Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Udvælgelsesafhængig og uafhængig generering af CRISPR / Cas9-medierede Gene Knockouts i Pattedyrceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolation, karakterisering og mikroRNA-baseret genetisk modificering af menneskelige Dental follikel stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massespektrometri-baseret Proteomics analyser ved hjælp af OpenProt Database til at afsløre nye proteiner oversat fra ikke-kanoniske åbne læserammer

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Samlede CRISPR-baserede genetiske skærme i pattedyrsceller

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetisk kortlægning af termo Toleranceforskelle mellem arter af Saccharomyces gær via Genome-Wide gensidig Hemizygosity analyse

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...