Name: genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

De auteurs bedanken het Kay lab voor de inbreng in deze methode en de LMB microscopie en stroom cytometry faciliteiten voor uitstekende wetenschappelijke en technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door Medical Research Council subsidie MC_U105115237 voor R. R. Kay, BBSRC (biotechnologie en biologische Sciences Research Council) subsidie BB/K009699/1 tot en met R. R. Kay, Cancer Research UK toekennen A15672 R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z te Jonathan R Chubb, MRC financiering (MC_U12266B) aan de MRC LMCB Universiteit eenheid aan de UCL.

<ol>
	<li>Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Dictyostelium+discoideum.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum.</a> Development. 138 (3), 387-396 (2011).</li><li>Sussman, R., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Dictyostelium+discoideum+in+axenic+culture.">Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).</li><li>Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+the+Dictyostelium+alpha-actinin+gene+leads+to+an+altered+mRNA+and+lack+of+the+protein.">Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein.</a> The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).</li><li>De Lozanne, A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+Dictyostelium+myosin+heavy+chain+gene+by+homologous+recombination.">Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination.</a> Science. 236, 1086-1091 (1987).</li><li>Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+transient+expression+system+for+Dictyostelium+discoideum.">Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum.</a> Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).</li><li>Knecht, D., Pang, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Dictyostelium+discoideum.">Electroporation of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).</li><li>Wetterauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+strains+of+Dictyostelium+discoideum+can+be+transformed+using+a+novel+selection+cassette+driven+by+the+promoter+of+the+ribosomal+V18+gene.">Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene.</a> Plasmid. 36, 169-181 (1996).</li><li>Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditions+for+the+transformation+of+nonaxenic+Dictyostelium+strains.">Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains.</a> Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).</li><li>Bloomfield, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+controls+macropinocytosis+and+phagocytosis+in+Dictyostelium.">Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP(3)-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Hoeller, O., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+the+absence+of+PIP3+gradients.">Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients.</a> Current Biology. 17, 813-817 (2007).</li><li>Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dictyostelium+RasS+protein+is+required+for+macropinocytosis,+phagocytosis+and+the+control+of+cell+movement.">The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement.</a> Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).</li><li>Schaap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phylogeny+and+evolution+of+morphology+in+the+social+amoebas.">Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas.</a> Science. 314, 661-663 (2006).</li><li>Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+Aggregative+Multicellularity+and+Cell-Cell+Communication+in+the+Dictyostelia.">The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).</li><li>Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+in+social+amoebae+is+mediated+by+allelic+pairs+of+tiger+genes.">Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes.</a> Science. 333 (6041), 467-470 (2011).</li><li>Strassmann, J. E., Queller, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+cooperation+and+control+of+cheating+in+a+social+microbe.">Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).</li><li>Wolf, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+Trade-offs+Result+in+the+Illusion+of+Social+Success.">Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success.</a> Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).</li><li>Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+set+of+small,+extrachromosomal+expression+vectors+for+Dictyostelium+discoideum.">A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum.</a> Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).</li><li>Woznica, D., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under-agarose+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).</li><li>Dubin, M., Nellen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+set+of+tagged+expression+vectors+to+monitor+protein+localisation+and+function+in+Dictyostelium.">A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium.</a> Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).</li><li>de Hostos, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+mutants+lacking+the+cytoskeletal+protein+coronin+are+defective+in+cytokinesis+and+cell+motility.">Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility.</a> Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).</li><li>Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+targeting+of+multiple+genes+in+Dictyostelium.">CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).</li><li>Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+harbours+for+the+integration+of+new+DNA+in+the+human+genome.">Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).</li><li>Rosengarten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaps+and+lulls+in+the+developmental+transcriptome+of+Dictyostelium+discoideum.">Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum.</a> BMC Genomics. 16, 294 (2015).</li><li>Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-mediated+diversification+of+transcriptional+bursting+dynamics+following+gene+duplication.">Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).</li><li>Gebbie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phg2,+a+kinase+involved+in+adhesion+and+focal+site+modeling+in+Dictyostelium.">Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).</li></ol>

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Het gebruik van niet-Axenische, wild-type Dictyostelium cellen geweest tot nu toe weinig in moleculair onderzoek. Beschikbare methoden voor genetische manipulatie van deze stammen hebben betrouwbaarheid en efficiëntie23, voorkomen van de algemene aanneming ervan ontbrak. De gegenereerde materialen en protocollen die hier gepresenteerd kunnen worden gebruikt voor elke D. discoideum stam onafhankelijk van haar vermogen om te groeien in de vloeistof. Er moet worden opgemerkt dat dit protocol is geoptimaliseerd voor NC4-afgeleide cellijnen. Transfectie efficiëntie voor vers geïsoleerde stammen uit het wild afwijken NC4, als we vóór hebben geconstateerd en hier voor V12M2 en WS21628,9worden weergegeven. De electroporation voorwaarden met name lijken te hebben een aanzienlijke invloed op de efficiëntie van de transfectie en kunnen eisen dat verdere optimalisatie voor sommige stammen. In het algemeen, een voldoende hoeveelheid transfectants waargenomen bij alle stammen getest tot nu toe, waaruit blijkt dat deze methoden werkbaar zijn. Het aantal positieve transfectants verkregen met behulp van NC4 afkomstige stammen is hoger in vergelijking met andere niet-een wild-type strains, maar in alle gevallen, worden voldoende aantal transfectants verkregen als u wilt toestaan voor verdere experimenten. Dit, plus de eenvoud van onze protocol, is de grote verbetering ten opzichte van eerdere pogingen8,9.
Deze nieuwe niet-een protocollen omvatten alle genetische standaardprocedures en toevoegen van verdere voordelen, aangezien het transfections kan worden uitgevoerd snel en efficiënt in parallel. Positieve klonen kunnen worden verkregen in de dagen in plaats van weken, sinds groei op bacteriën helften de tijd van de divisie. De nieuw opgerichte plasmiden ook werken in een omstandigheden en kunnen worden routinematig gebruikt in beide groei-omstandigheden, dat is een ander vooruitgang van deze methology22. Zoals in het protocol is opgenomen, de plasmide gebruikt voor selectie op bacteriën hebben speciale vereisten die zijn cruciaal voor het succes van de transfectie. De initiatiefnemers rijden de expressie en weerstand cassettes zijn met name belangrijk voor succesvolle transfectie. De vaak gebruikte act6 (actine 6) promotor24 voor het besturen van de weerstand of expressie cassettes mist efficiëntie wanneer cellen worden gekweekt op bacteriën. In onze plasmide-systeem rijdt de promotor van de zeer actieve act15 (actine 15) alle expressie cassettes, terwijl de weerstand cassettes onder de controle van de promotor van een coA (coactosin A), zowel zijn van die actief zijn in en een voorwaarden zijn cellen die op bacteriën worden gekweekt. Vereisten voor de expressie van verslaggever construeert evenals knock-in en knock-out constructies nopen tot het gebruiken van onze plasmide repertoire, maar helaas beperkt het gebruik van vectoren al gemaakt die gebruikmaken van de inefficiënte act6 promotor.
Promotor efficiencyeffecten zijn vooral kritiek voor transfections die afhangen van een gebeurtenis van de integratie van de enkel in de juiste genomic locus. Als gevolg van onze verbetering van initiatiefnemers rijden de genexpressie weerstand, wordt voldoende weerstand eiwit geproduceerd uit interne locus integraties. Een belangrijk aandachtspunt was de ten gunste van meerdere integraties in het genoom bij het gebruik van hygromycin of G418 zoals beschreven. Geen ten gunste van meerdere integraties geconstateerd is tot nu toe, zoals eerder gemeld voor G418 selecties met behulp van oudere promotor systemen25. Dit betekent dat zowel hygromycin en G418 zijn geschikt selecteerbare merkers voor de generatie van schone knock-outs en knock-ins. Helaas, de selecteerbare marker-blasticidin werkt niet onder niet-een omstandigheden. Dit is een groot nadeel van onze methode, omdat de blasticidin weerstand cassette routinematig gebruikt is voor het genereren van knock-out constructies in D. discoideum. Constructies die reeds werden gegenereerd met blasticidin weerstand cassettes moet worden rederived met behulp van een van de werkbare selecteerbare merkers. Een andere mogelijkheid om te overwinnen van deze beperking is het combineren van de onlangs opgerichte een D. discoideum CRISPR technologie met deze transfectie protocol26. De generatie van geschikt, één gids RNAs (sgRNAs) is eenvoudiger en sneller dan de wederopbouw van complete knock-out constructies. Voor toekomstige richtingen, de mogelijkheid van meerdere knock-outs te genereren met behulp van CRISPR/Cas9 in combinatie met dit protocol transfectie is aantrekkelijk en kan de weg vrijmaken voor veel onderzoekers in de Gemeenschap Dictyostelium . De uitvoerbaarheid van het systeem van de gevestigde voorbijgaande expressie gebruikt voor CRISPR/Cas9 in een volwassen cellen moet echter zorgvuldig worden onderzocht.
Het act5 knock-in systeem gepresenteerd biedt een betrouwbare en veilige integratie systeem voor het genereren van stabiele cellijnen in D. discoideum, met het voordeel van vergelijkbare sites gevestigd in andere organismen22. Ook hangt af van de gebeurtenis van een interne integratie in het genoom en biedt vele mogelijkheden voor verschillende onderzoek richtingen. De promotor van de act5 is sterk actief en garandeert bijna homogene expressie27 onafhankelijk van de voorwaarden van de teelt. Fluorescerende verslaggever eiwitten kunnen gemakkelijk geïntegreerd worden in deze veilige haven locus met behulp van de gemanipuleerde targeting plasmiden. Dit kan nuttig zijn, bijvoorbeeld voor cel-tracking doeleinden, zoals hier wordt weergegeven in een mix-experiment. De cellen Toon minimal cel-naar-cel expressie variabiliteit, die kan helpen bij het geautomatiseerde cel bijhouden. Nog belangrijker is, verschijnt de invoeging van een gewenste volgorde in de locus handelen5 fenotypische neutrale28,29. Als de expressie niet een selecteerbare marker om eiwituitdrukking, hangt zoals te zien in willekeurige integrants of extrachromosomal vector-bevattende cellijnen, kan het act5 -systeem nuttig zijn voor redding experimenten, ook. Aangezien de cellijnen homogene zijn, kunnen alle cellen worden geanalyseerd. Dit is niet mogelijk met behulp van een extrachromosomal plasmide voor expressie, waarin er aanzienlijke heterogeniteit in expressie is.
Naast deze algemene verbeteringen voor alle stammen maakt de mogelijkheid om niet-een wild-type cellen gebruiken voor moleculair onderzoek een beoordeling van de gevolgen van geaccumuleerde mutaties in huidige laboratorium stammen. Meerdere genetische herschikkingen is gebleken dat sinds de goedkeuring van de Ax2 stam in 1970, zoals blijkt uit de eerder gepubliceerde microarray analyse26. Synthetische fenotypen zijn vanwege de aanwezigheid van deze mutaties waargenomen. Bijvoorbeeld, toont een mutant gerapporteerde phg2 verminderde adhesie in één laboratorium stam achtergrond en verhoogde hechting in nog eens3. Dergelijke tegenstrijdige gegevens kunnen nu worden opgelost door het herhalen van het experiment in de gemeenschappelijke voorouder stam (in dit geval, DdB). De kracht van deze aanpak is onlangs gebleken voor de kleine GTPase RasS30,31.
De mogelijkheid voor het uitvoeren van genetische experimenten in alle discoideum D. stam breidt de mogelijkheden van nieuwe onderzoek richtingen die afhankelijk van het gebruik van wilde isolaten, met name die met betrekking tot de sociale evolutie, geslacht herkenning en de seksuele cyclus22.

Het geslacht Dictyostelium zijn bodem-levende sociale amoeba die zich voornamelijk voeden met bacteriën. In de stam van deze berichten wordt geplaatst, zijn een groot aantal soorten geïsoleerd die kunnen worden ingedeeld in vier verschillende clades1. De soorten Dictyostelium discoideum (D. discoideum) uitgegroeid tot een populaire model-organisme om complexe cellulaire processen zoals cel migratie en fagocytose te bestuderen. Om te controleren en standaardiseren van experimentele omstandigheden, een cel lijnen hebben ontwikkeld die kunnen groeien in complexe of gedefinieerde vloeistof in de afwezigheid van bacteriën2. Van bijzonder belang zijn de Ax2, Ax3, en Ax4 stammen, die werden alle gegenereerd in de jaren 1970 en uiteindelijk afgeleid van een enkele wilde isoleren NC43. Hulpmiddelen voor de gentechnologie werden ontwikkeld in deze een stammen, resulterend in het eerste gepubliceerde knock-out in 19874,5. Protocollen werden verder ontwikkeld en geoptimaliseerd voor gebruik onder een voorwaarden6,7.
Aanpassing van deze protocollen bij wild-type D. discoideum stammen die zijn niet in staat om te groeien in vloeibare Bouillon zijn geprobeerd door verschillende laboratoria. Dit is echter niet geworden volledig succesvol omdat de protocollen van de transfectie complex zijn en gebrek aan efficiëntie, gedeeltelijk als gevolg van de capaciteit van de bacteriën om te fungeren als een gootsteen voor de selectieve reagentia8,9. Dientengevolge, afkomstig in wezen alle moleculaire gegevens op D. discoideum van afstammelingen van een één isolaat van de wild-type. We wilden deze beperking ondervangen en ontwikkelen van een methode om genetisch Wijzig D. discoideum cellen onafhankelijk van hun vermogen om te groeien in vloeistof. De noodzaak van een dergelijke methode kan worden verklaard door de observatie dat het werd aangenomen in het verleden dat de mutaties waardoor een groei voornamelijk neutraal waren en deed geen afbreuk doen aan celfysiologie. Deze veronderstelling is slechts gedeeltelijk juist. In het algemeen, zijn er twee opvallende verschillen; eerst, tussen de verschillende geïsoleerd een stammen, en ten tweede, wanneer deze een stammen worden vergeleken met niet-een wild isolaten8,9.
De meest kritische factor is misschien wel het belangrijkste een gen, bijlB, die onlangs werd geïdentificeerd als RasGAP NF1. De belangrijkste functie van NF1 als een RasGAP is te bedwingen Ras activiteit3. De schrapping van het enzym in alle Axenische stammen leidt tot buitensporige Ras activiteit manifesteerde als de vorming van grote actieve Ras patches. Deze uitgebreide Ras patches leiden tot de opeenstapeling van PIP3 in het plasma-membraan. Deze toevallige verschijnen patches van PIP3 en actieve Ras zijn een sjabloon voor de vorming van een circulaire ruffle die uiteindelijk wordt gesloten en leidt tot de vorming van macropinosomes10. Het gevolg is een buitensporige toename van de activiteit van de macropinocytic. Macropinocytosis is een proces van actine-gedreven. Een competitie voor cytoskeletal componenten voor de vorming van macropinosomes of pseudopods is het resultaat. Het effect ervan op het gedrag van de cel wordt weerspiegeld in de bijna volledige preventie van chemotaxis van vegetatieve cellen folaat11. De enorm uitgebreide PIP3 patches zijn zeer persistent. Zelfs in uitgehongerd cellen, de PIP3 patches blijven en pseudopods, die kunnen leiden tot problemen interpreteren studies over chemotaxis naar kamp kunnen worden geïnterpreteerd.
In sommige gevallen is de mutatie NF1 experimenteel handig. Dit leidt ons tot een tweede motivatie voor de ontwikkeling van een methode van de transfectie voor bacterially geteeld D. discoideum cellen, aangezien de verhoging macropinocytosis een cellen waardevol maakt voor het onderzoeken van de fundamentele aspecten van dit proces12 . Mutatie in de genen die nodig zijn voor macropinocytosis, zoals Ras- en PI3-kinases10, hebben echter bijna afgeschaft, een groei, waardoor het noodzakelijk wordt om te manipuleren van deze cellen via de groei van bacteriën. Een andere reden dat bacteriën gebaseerde transfections waardevolle maakt is het toenemende gebruik van Dictyostelids om te vragen in de evolutie van multi buiten13,14, geslacht herkenning15,16, verkennen en altruïstische cellulaire gedrag, die vooral afhankelijk zijn van het gebruik van vers geïsoleerde wild-type isoleert17. Alle genoemde onderzoeksgebieden kunnen worden vergemakkelijkt door efficiënte methoden voor genetische manipulatie van wild isolaten, die niet-Axenische en groeien niet in vloeibare Bouillon.
Onze protocollen toestaan voor het overwinnen van de beperkingen beschreven. Samen genomen, de mogelijkheid van het uitvoeren van genetische manipulaties met bacteriële geteeld D. discoideum cellen wachtruimten voordelen voor alle Dictyostelium onderzoekers, zelfs als het alleen de hogere snelheid van het selectieproces moet sneller groei van de amoebe (4 h verdubbeling keer) op bacteriën in vergelijking met groei in een media (10 h verdubbeling van tijd).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:820px;" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Equipment</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-400-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">12823252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EP6331000025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gene Pulser X Cell, including CE &#38; PC modules</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Safety Cabinet Foruna - SCANLAF</td>
			<td style="width:184px;">Labogene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BioPhotometer Plus</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CLSM 710</td>
			<td style="width:184px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Media &#38; Agaroses</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LoFlo Medium</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LF0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:184px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Low EEO Agarose</td>
			<td style="width:184px;">BioGene</td>
			<td style="width:119px;">300-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Purified Agar</td>
			<td style="width:184px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SM broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">SMB0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2x LB broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LBD0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Chemicals</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HEPES free acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">391340 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">P/4800/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">Na2HPO4 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2 * 6 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">5982 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">CaCl2 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">442909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KOH</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">26668.263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cultur Dishes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5</td>
			<td style="width:184px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:119px;">P50G-1.5-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Geneticin G418-sulphate</td>
			<td style="width:184px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hygromycin B Gold</td>
			<td style="width:184px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Additional Consumables</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2mm gap electroporation cuvettes, long electrode</td>
			<td style="width:184px;">Geneflow Limited</td>
			<td style="width:119px;">E6-0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10 &#181;l Inoculating Loop, Blue 10 Micro L</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">129399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Spreader, L-shaped, sterile</td>
			<td style="width:184px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">730190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Combitips advanced 5 ml</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf BIOPUR</td>
			<td style="width:119px;">30089669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Kits</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ZR Plasmid Miniprep Classic</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D4016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Quick DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zymoclean DNA Recovery Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Enzymes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0482L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td style="width:184px;">TakaraBio</td>
			<td style="width:119px;">R045A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria

Dictyostelium-discoideum is een intrigerende modelorganisme voor de studie van cel differentiatie processen tijdens ontwikkeling, cel signalering en andere belangrijke cellulaire biologie vragen. De technologieën die beschikbaar zijn om genetisch te manipuleren Dictyostelium cellen zijn goed ontwikkeld. Transfections kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende selecteerbare merkers en marker opnieuw fietsen, met inbegrip van homologe recombinatie en dat mutagenese. Dit wordt ondersteund door een goed geannoteerde genoom. Echter, deze benaderingen zijn geoptimaliseerd voor een cellijnen groeien in vloeibare culturen en zijn moeilijk toe te passen op niet-een wild-type cellen, die alleen als bacteriën waardplanten. De mutaties die aanwezig in een stammen zijn verstoren Ras signalering, waardoor buitensporige macropinocytosis die nodig zijn voor het voederen en afbreuk doen aan cel migratie, die de interpretatie van signaaltransductie en chemotaxis experimenten in die stammen kunstdiscours. Eerdere pogingen om genetisch te manipuleren niet-een cellen ontberen efficiëntie en vereiste complexe experimentele procedures. We hebben een eenvoudige transfectie protocol dat voor de eerste keer, deze beperkingen overwint ontwikkeld. Deze serie van grote verbeteringen aan Dictyostelium moleculaire genetica toestaan wild-type cellen worden gemanipuleerd net zo gemakkelijk als standaard laboratorium stammen. Naast de voordelen voor de studie van onbeschadigde signalering en motiliteit processen, kunnen mutanten die macropinocytosis gebaseerde groei verstoren nu gemakkelijk geïsoleerd. De gehele transfectie workflow wordt bovendien aanzienlijk versneld, met recombinant cellen die kunnen worden gegenereerd in de dagen in plaats van weken. Een ander voordeel is dat de moleculaire genetica verder kan worden uitgevoerd met vers geïsoleerde wild-type Dictyostelium monsters uit de omgeving. Dit kan helpen om de reikwijdte van de benaderingen die zijn gebruikt in deze onderzoeksgebieden.

Extrachromosomal plasmiden worden gebruikt voor verslaggever studies, die gericht zijn op het identificeren van de lokalisatie van bepaalde eiwitten in een cel of veranderingen in de cellulaire structuur van mutantcellen. Voor vele benaderingen, zoals de controle van de celcyclus, is het van cruciaal belang wil twee verslaggevers op hetzelfde moment. Dit is nu mogelijk met behulp van onze dubbele verslaggever extrachromosomal plasmide systeem (tabel 1). Op dag 1, werden cellen transfected alvorens toe te voegen de selecteerbare markering G418 na 5 uur (Figuur 1). In het voorbeeld, NC4 DdB, Ax2 en de onafhankelijk afgeleide wild isolaten V12M2 en WS2162 (aanvullende tabel 1) zijn transfected met de plasmide-pPI289, die codeert voor GFP-TubulinA, een marker voor microtubuli en mCherry-PCNA, een eiwit dat is gebruikt voor de controle van de celcyclus(Figuur 2). Na 32 h, werden de cellen onder de Microscoop waargenomen. De meerderheid van de cellen uitgedrukt beide TL-geëtiketteerden fusie-eiwitten, verslagen consistent met vorige die uitdrukking van twee verslaggevers van de dezelfde plasmide toont vergelijkbare expressie niveaus, wat bijna onmogelijk is bij het gebruik van twee verschillende plasmiden 18,19. Een representatieve cel voor elke regel van de cel (NC4 DdB, Ax2, V12M2 en WS2162) de gewenste dual verslaggever uitdrukken is afgebeeld in Figuur 2B. De efficiëntie van de transfectie worden samengevat in figuur2 C. NC4-afgeleide cellijnen Toon de beste transfectie efficiencyverbeteringen. Echter, cellijnen V12M2 en WS2162, een aanzienlijk hoge aantal transfectants werd behaald.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig2.jpg"> Figuur 2 : Uitdrukking van een extrachromosomal plasmide. (A) Extrachromosomal plasmiden zijn direct transfected in ronde vorm. Als voorbeeld, is de dubbele verslaggever pPI289 komt te staan. De NgoMIV sites geven het invoegen van de tweede verslaggever in de extrachromosomal expressie plasmide. (B) Z-projectie van een representatieve cel GFP-TubulinA (cytoplasmatische) en mCherry-PCNA (grotendeels nucleaire) voor vijf verschillende wild-type cellijnen gebruikt (NC4 DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C) de transfectie efficiëntie voor de vijf cellijnen afgebeeld in (B) werden berekend. Het gemiddelde van twee experimenten wordt getoond. Foutbalken geven ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Integratie van een targeting vector in een opgegeven genomic locus is moeilijker en vereist meer zorgvuldige analyse van de gegenereerde cellijn. In Figuur 3wordt een act5- mCherry-KI in NC4 geprobeerd. Ten eerste moet het plasmide te verhogen van de frequentie van recombinatie gebeurtenissen na transfectie worden linearized. Hiervoor wordt de plasmide pDM1514 gesneden met NgoMIV. Twee bands worden verkregen na het uitvoeren van de digest op een agarose gel. De band 4127 bp bevat de gewenste constructie (Figuur 3). Voor transfectie, het verteerd DNA moet worden geëxtraheerd vanaf de gel en gezuiverd met behulp van een gel extractie kit na instructies van de fabrikant.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig3.jpg"> Figuur 3 : Voorbereiding op act5 knock-in en DNA voor Transfectie. Een voorbeeld van het gebruik van een handelen5 knock-in de plasmide-pDM1514 wordt weergegeven. De stappen voor de voorbereiding van zijn als volgt vermeld. (A) vóór electroporation, linearize het plasmide met behulp van de aangegeven NgoMIV sites. (B, C) Voer de gesneden plasmide op een agarose gel totdat de twee verwachte bands zijn goed gescheiden. Knip uit de 4127 bp band met de armen recombinatie, mCherry en de weerstand-cassette, en gel extract het DNA. Het DNA is nu klaar voor Transfectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Het gezuiverde DNA werd gebruikt voor Transfectie NC4 cellen. Na 5-6 dagen van selectie, werden klonen verkregen. Representatieve transfectie efficiëntie en de hoeveelheid positieve geïdentificeerde klonen voor verschillende act5 knock-in pogingen zijn samengevat in tabel 3. Twee klonen van de transfectie NC4 werden willekeurig gekozen en geanalyseerd door PCR (Figuur 4A), en beide toonde de voorspelde band patronen van een knock-in verwacht en werden verder gevalideerd met zuidelijke vlekkenanalyse om te zorgen voor een interne integratie in geval van de constructie in het genoom20. De vlek toont een duidelijke interne integratie in de gewenste act5 locus (Figuur 4B). De gegenereerde cellijn van NC4::act5-mCherry kan nu worden gebruikt in experimenten.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig4.jpg"> Figuur 4 : Validatie van act5- mCherry KIs in NC4. (A) regeling en controle PCRs voor de validatie van positieve integraties in act5 locus. De aangegeven inleidingen werden gebruikt voor het analyseren van twee onafhankelijke klonen en de ouder. Beide klonen Toon de verwachte bands voor de weerstand-cassette en stroomafwaarts (P1) of upstream primer (P2), die niet aanwezig in de ouderlijke stam zijn. De combinatie van de primer (P1/P2) bevestigt de juiste integratie van mCherry en weerstand cassette in de locus act5 . De wild-type NC4 toont de verwachte 2800 bp band, terwijl beide KI klonen deze band ontbreken en in plaats daarvan een PCR product over 1400 basenparen groter tonen. (B) de regeling voor de beperking van de gebruikte digest en Southern blot. Beide klonen knock-in show de kleinere 3400 bp band, die is het resultaat van de integratie van de constructie in de locus handelen5, specifiek de aanvullende Bclik site in de hygromycin weerstand cassette. De wild-type controle toont de verwachte 5.8 kb die voortvloeien uit de twee stroomafwaarts gelegen Bclik sites. De vlek was bijgesneden en verbinding aan de randen voor de duidelijkheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>gerichte constructie in de locus act5</td>
			<td>de naam van de plasmide</td>
			<td>aantal bezette wells</td>
			<td>aantal geselecteerde klonen</td>
			<td>Positieve klonen</td>
			<td>Juiste klonen (%)</td>
			<td>Dictyostelium stam</td>
			<td>efficiëntie van de transfectie (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µg DNA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-mCherry</td>
			<td>pPI226</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>14.2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-GFP</td>
			<td>pPI227</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>5</td>
			<td>41,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>6 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>66,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>66</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td>55,5</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.3 x 10 ^ -5</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>221</td>
			<td>12</td>
			<td>10</td>
			<td>83,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.1 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>85,7</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>70</td>
			<td>DdB</td>
			<td>5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>240</td>
			<td>12</td>
			<td>11</td>
			<td>91,6</td>
			<td>DdB</td>
			<td>1.2 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>320</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>100</td>
			<td>NC4</td>
			<td>1.6 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: transfectie efficiënties en het bedrag van de verkregen positieve transfectants voor de generatie van act5 KIs in verschillende stam achtergronden 22 .
De locus van handelen5 biedt relatief homogene uitdrukking van de geïntegreerde verslaggever21. De gegenereerde NC4::act5-mCherry -cellen toestaan mix experimenten met andere act5 knock-modules met behulp van een verschillende fluorescente proteïne zoals GFP worden uitgevoerd. Om te benadrukken het grote voordeel van dit systeem, worden mengen experimenten met Ax2::act5-GFP weergegeven. Als gevolg van het onvermogen om te transfect niet-een wild-type cellen, kon niet dit soort benadering worden uitgevoerd voordat. Mix experimenten zijn een belangrijk instrument voor het analyseren van het gedrag van de cel, omdat zij toestaan dat een directe vergelijking tussen verschillende cellijnen ervaren dezelfde proefomstandigheden. NC4 cellen groeien sneller op bacteriële gazons dan Ax2 cellen (Figuur 5A). Dit kan worden veroorzaakt door een hogere capaciteit om phagocytose van bacteriën of verbeterde mogelijkheden om te bewegen en de chemotaxis naar een bron van voedsel. Met behulp van een geringe agar folaat chemotaxis assay, werd directe vergelijking van een bevolking van NC4::act5-mCherry en Ax2::act5-GFP uitgevoerd, waaruit blijkt dat de NC4::act5-mCherry zijn veel efficiënter in folaat sensing. Na 4 uur konden meer cellen van de NC4::act5-mCherry kruipen onder de agarose dan Ax2::act5-GFP cellen (Figuur 5B). Standaard metrics van chemotaxis voor de cellen migreren onder de agarose analyseren bleek dat de NC4::act5-mCherry cellen sneller waren en bleek sterker Chemotactische reactie dan Ax2::act5-GFP cellen (Figuur 5C-E ).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig5.jpg"> Figuur 5 : Met behulp van handelen5 KIs voor beeld-gebaseerde chemotaxis mix experimenten. (A) NC4::act5-mCherry en het Ax2::act5-GFP uiten van het aangegeven fluorescerende eiwit uit de locus handelen5 werden geanalyseerd voor de mogelijkheid om te groeien op een bacteriële gazon. Na 4 dagen, de diameter van de plaque ontstaan uit eenzame vergulde Dictyostelium cellen werden gemeten. Non-een act5:: NC4 cellen maken aanzienlijk groter plaques dan een Ax2::act5-GFP cellen (± SD, betekenen *** p < 0,0001, n = 3, schaal bar 5 mm). (B) voor gebruik van de onder-agarose folaat chemotaxis assay22 rechtstreeks vergelijken de Chemotactische capaciteiten van de NC4::act5-mCherry en Ax2::act5-GFP gebruikt in (A), bacteriën-gegroeid amoeben van beide stammen waren gemengd in een verhouding van 50:50. Cellen mochten kruipen onder de agarose. Na 4 uur, werden cellen die van het verloop van folaat migreren waren beeld met behulp van een confocal microscoop. Het aantal cellen van de NC4::act5-mCherry en Ax2::act5-GFP werd vervolgens vastgesteld. NC4::act5-mCherry cellen werden efficiënter in de detectie van folaat. Over 10-fold meer NC4::act5-mCherry cellen werden gevonden in vergelijking met Ax2::act5-GFP cellen (± SD, betekenen *** p < 0,0001, n = 6, schaal bar 100 µm). (C, D) De cellen werden gefilmd voor 60 min, en hun snelheid en Chemotactische index werden berekend. Na de voorselectie van de meest chemotactically responsieve cellen (alleen die gemigreerd onder de agarose), cellen Ax2::act5-GFP bleek lagere waarden voor cel snelheid én chemotaxis. Vijftig cellen per cellijn werden geanalyseerd. (mediaan ± SD, * p < 0,01, n = 3). (E) de tracks van NC4::act5-mCherry en Ax2::act5-GFPact5 knock-ins meer dan 60 min., toont het meer gericht verkeer naar de bron van de chemoattractent van de NC4::act5-mCherry -cellen worden uitgezet (mediane ± SD, ** * p < 0,0001, n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
De act5 knock-in cellijnen kunnen ook worden gebruikt voor stroom cytometry. Net als bij de groei van bacteriën, zijn er grote verschillen in ontwikkeling tussen een stammen en niet-een wild-types. Na ontwikkeling, zijn de vruchtlichamen van NC4 cellen ongeveer tweemaal zo groot als die afgeleid van Ax2 cellen. Als cellen worden gemengd, wordt een tussenliggende formaat fruiting body verkregen. Voor het analyseren van de bijdrage van de beide cellijnen meer kwantitatief, werd stroom cytometry gebruikt. Deze analyses bleek duidelijk dat de Midden-en kleinbedrijf vruchtlichamen te wijten aan verschillende niveaus van de bijdrage van beide cellijnen zijn. Terwijl NC4::act5-mCherry cellen tot ongeveer 75% van de gemeten sporen gemaakt, Ax2::act5-GFP bijgedragen slechts 25%, waaruit een potentiële fitness voordeel voor niet-een stammen (Figuur 6). Aangezien de analyse niet de stengel celpopulatie controleert, zijn er twee mogelijkheden om uit te leggen van de onbalans in ontwikkeling tussen Ax2 en NC4. Een mogelijkheid is dat Ax2 cellen dragen vooral aan de stengel celpopulatie, in plaats van het invoeren van de spore-celpopulatie. U kunt ook meer NC4 cellen kunnen invoeren de ontwikkelingstoxiciteit cyclus, met Ax2 relatief vertraagd, en ze zijn bijgevolg niet in staat om bij te dragen in de vergadering van een fruiting body. De mogelijkheid om te transfect niet-een wild-type cellen verder ontwikkelt andere benaderingen en vereenvoudigt aanzienlijk experimentele procedures.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig6.jpg"> Figuur 6: Act5 KIs toestaan analyse van mix-experimenten met behulp van stroom cytometry. (A) NC4::act5-mCherry en Ax2::act5-GFP afzonderlijk of in een 50:50 mengsel op niet-nutriënt agar platen werden ontwikkeld. NC4::act5-mCherry cellen vormen grotere vruchtlichamen dan Ax2::act5-GFP. De mix geeft in plaats daarvan een tussentijdse grootte (schaal bar 5 mm). De lichte microscopie van confocal fluorescentie suggereert een hoger bedrag van NC4::act5-mCherry sporen in de hoofden van de spore afgeleid van mixen. (B) te kwantificeren deze observatie, de hoeveelheid sporen in geoogste spore hoofden uit het mengen experiment in (A) werden geanalyseerd door stroom cytometry. Ongeveer 75% van de sporen afkomstig is van NC4::act5-mCherry -cellen, met slechts 25% uit Ax2::act5-GFP cellen. (C) vertegenwoordiger verspreiding van sporen van beide cellijnen wordt weergegeven in een stroom cytometry scatter. Ongeveer 0,05% weergeven positieve mCherry en GFP signalen, wat suggereert dat parasexual fusion processen hebben plaatsgevonden of dat er sporen zijn vasthouden aan elkaar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Cellijn</td>
			<td>Genetisch achtergrond</td>
			<td>Referentienummer</td>
			<td>Gepubliceerd voordat</td>
			<td>Type</td>
		</tr>
<tr>
<td>AX2 (Ka)</td>
			<td></td>
			<td>DBS0235521</td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
<tr>
<td>NC4 (S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::mCherry kloon 5</td>
			<td>NC4</td>
			<td>HM1912</td>
			<td>Paschke et al., 2018</td>
			<td>act5 knock-in</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::GFP kloon 2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>HM1930</td>
			<td>Paschke et al., 2018</td>
			<td>act5 knock-in</td>
		</tr>
<tr>
<td>V12M2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
<tr>
<td>WS2162</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
</tbody></table>Aanvullende tabel 1: verschillende stammen van Dictyostelium studeerde.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetische manipulatie van Dictyostelium discoideum cellen op basis van de selectie en de groei van bacteriën

Dictyostelium-discoideum is een populair model-organisme te bestuderen van complexe cellulaire processen zoals cel migratie, endocytose en ontwikkeling. Het nut van het organisme is afhankelijk van de haalbaarheid van genetische manipulatie. Hier presenteren we methoden om te transfect Dictyostelium discoideum cellen die bestaande van kweken cellen in vloeibare media beperkingen.

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

De waarde van dit protocol is dat het bijna elke stam van dictyostelium discoideum toestaat om door moleculaire genetica worden gemanipuleerd, ongeacht of die spanning axenically in vloeibaar middel of niet zal groeien. Het andere voordeel van deze techniek is dat het snel en eenvoudig is. Transponeren naar transfect cellen met een exochromosomale plasmid voordat u begint te dictyosteliums mengen.De resultaten kunnen al twee dagen na de transfectie worden gevalideerd met behulp van microscopie. Het is ongebruikelijk om te werken met dictyosteliumcellen en bacteriën suspensie. Visualisatie zal helpen om onderzoekers een idee te geven hoe de verschillende stappen van de protocollen worden uitgevoerd.Het aantonen van de procedure met mij zal Soudabeh Imanikia, een postdoc uit mijn lab. Om te beginnen, bereid 1000 milliliter sorensen buffer werkoplossing met magnesiumchloride en calciumchloride volgens het tekstprotocol. Gebruik hierna een enkele kolonie K-aerogenes om een liter LB-medium in te enten.Laat de bacteriën 's nachts groeien op 37 graden Celsius met schudden. Draai de cellen naar beneden in twee 500 milliliter centrifugebuizen om de cellen te oogsten. Dan, was de bacteriën een keer met 500 milliliter buffer.Resuspend de pellet in 20 milliliter buffer. Gebruik een fotometer om de optische dichtheid van het monster te controleren en verdun het monster met buffer totdat de optische dichtheid ongeveer 100 is. Bereid hierna de H40-elektroporatiebuffer volgens het tekstprotocol voor.Grow K aerogenes om een SM-medium 's nachts samen te brengen bij kamertemperatuur. Voeg 400 microliter bacteriële suspensie toe aan een SM agar plaat en verdeel het gelijkmatig. Neem vervolgens een steriele lus en inenting met dictyosteliumcellen en verspreid de cellen aan de ene rand van de plaat.Broed de plaat twee dagen lang op 22 graden Celsius, om ervoor te zorgen dat de groeizones groot genoeg zijn voor transfectie. Voeg 10 milliliter K aerogene suspensie toe aan een met weefselkweek behandeld petrischaaltje van 10 centimeter. Gebruik vervolgens een 10 microliter wegwerpinentingslus om cellen uit de groeizones van de kweekplaat te schrapen.Breng de cellen over naar een buis van 1,5 milliliter, met ijskoude H40-buffer. Draai de cellen twee seconden bij 10000 keer zwaartekracht. Gooi vervolgens de supernatant weg en zet de cellen opnieuw op in de H40-buffer.Voeg vervolgens 100 microliter van de cellen toe aan een buis met één tot twee microgram DNA. Pipet op en neer om het cel-DNA-mengsel te mengen en over te brengen naar een voorgekoelde elektroporatie cuvette. Voeg niet meer dan twee microgram DNA toe.Een hogere DNA-concentratie is giftig voor de cellen en vermindert de efficiëntie. Breng na elektroporatie de cellen onmiddellijk over op een voorbereide petrischaal van 10 centimeter en laat de cellen vijf uur herstellen. Om een transfectant te selecteren voor een knock-out, knock-in, of een handeling vijf knock-in, los de cellen van de Petri schotel door pipettervloeistof over het oppervlak.Stel vervolgens drie verdunningen van het selectieve agens in volgens het tekstprotocol. Verdeel ten slotte 150 microliter van de bereide verdunningen in elke put van 96-well flat-bottom weefselkweekplaten. In dit protocol werd een dubbel verslaggever extrachromosomale plasmide systeem aangetoond.32 uur na de transfectie, de meerderheid van de cellen uitgedrukt zowel fluorescerende gelabelde fusie-eiwitten. Een act vijf M cherry knock-in en een NC4 werd ook geprobeerd. Twee banden werden verkregen na het uitvoeren van de samenvatting op een agarose gel.De 4127 base pair band bevat de gewenste constructie. Het gezuiverde DNA werd gebruikt voor de transfectie van NC4 cellen. Twee klonen van de NC4 transfectie werden geanalyseerd via PCR en beide toonden de voorspelde bandpatronen.Zuidelijke vlek werd vervolgens gebruikt om de resultaten van de PCR te valideren. De NC4 groeide sneller op bacteriële gazons dan Ax2 cellen. Na vier uur konden meer NC4-cellen onder de agarose kruipen dan Ax2-cellen.De NC4 cellen waren sneller en vertoonden een sterkere chemotactische respons op foliumzuur dan de Ax2 cellen. Gebruik altijd cellen van vers ingestelde SM-platen. Gebruik nooit cellen ouder dan vier dagen, anders zal de efficiëntie dalen.Vers geïsoleerde, nonextenic, witte HAP stammen worden vaak gebruikt om vragen over een ruching of sociaal gedrag van dictyosteliums te beantwoorden. Onze maakt het mogelijk om moleculaire genetica toe te passen via die isolaten.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Ontwerp en gebruik van een Low Cost, Automatiseren Morbidostat voor Adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massa spectrometrie gebaseerde Proteomics Analyses met behulp van de OpenProt Database te onthullen nieuwe eiwitten vertaald uit niet-canonieke Open lezing Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetische mapping van Thermotolerance verschillen tussen soorten Saccharomyces gist via genoom-brede wederzijdse Hemizygosity analyse

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...