Name: genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00
Duration: 6 min 8 s
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Die Autoren danken Kay Lab für die Eingabe in diese Methode und die LMB Mikroskopie und Flow Cytometry Einrichtungen für hervorragende wissenschaftliche und technische Unterstützung. Diese Arbeit durch Medical Research Council Grant MC_U105115237, R. R. Kay, BBSRC (Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research Council) BB/K009699/1, R. R. Kay finanziert wurde, Cancer Research UK gewähren A15672 R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z Jonathan R Chubb und MRC Finanzierung (MC_U12266B) zum MRC LMCB Universität Gerät am UCL.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Die Verwendung von nicht-axenic, Wildtyp Dictyostelium Zellen wurden nur sehr geringe so weit in der molekularen Forschung. Verfügbare Methoden für die Gentechnik dieser Stämme haben Zuverlässigkeit und Effizienz23, ihre allgemeine Annahme verhinderten fehlte. Die erzeugten Materialien und Protokolle, die hier vorgestellten einsetzbar für jede D. Discoideum Belastung unabhängig von seiner Fähigkeit im flüssigen Medium wachsen. Es sei darauf hingewiesen, dass dieses Protokoll für SC4-abgeleitete Zellinien optimiert ist. Transfektion Wirkungsgrade für frisch isolierten Stämme aus der freien Wildbahn unterscheiden sich von SC4, wie wir beobachtet haben, vor und werden hier für V12M2 und WS21628,9gezeigt. Die Elektroporation Bedingungen scheinen insbesondere einen erheblichen Einfluss auf die Effizienz der Transfektion und erfordern weitere Optimierung für einige Stämme. In der Regel eine ausreichende Menge an Transfectants eingehalten worden in alle Sorten getestet bisher zeigen, dass diese Methoden durchführbar sind. Die Anzahl der positiven Transfectants SC4-abgeleitete Stämme mit Hilfe anderer nicht axenic Wildtyp Stämme, sondern in allen Fällen höher verglichen wird, sind Transfectants in ausreichender Zahl erhalten, um für weitere Experimente zu ermöglichen. Dies, plus die Einfachheit unseres Protokolls ist die wesentliche Verbesserung im Vergleich zu früheren Versuche8,9.
Diese neue nicht-axenic Protokolle decken alle genetischen Standardverfahren und fügen Sie weitere Vorteile, da Transfektionen parallel rasch und effizient durchgeführt werden können. Positive Klone erhalten Sie in Tagen statt Wochen, da Wachstum auf Bakterien Hälften der Sparte Zeit. Die neu gegründete Plasmide auch arbeiten unter axenic Bedingungen und routinemäßig verwendet werden unter beiden Wachstumsbedingungen, die ist ein weiterer Fortschritt dieser Methology22. Wie im Protokoll eingeführt, das Plasmid zur Auswahl auf Bakterien haben spezielle Anforderungen, die für den Erfolg der Transfektion von entscheidender Bedeutung sind. Die Promotoren fahren die Meinungs- und Widerstand Kassetten sind insbesondere wichtig für erfolgreiche Transfektion. Die oft verwendete act6 (Aktin 6) Veranstalter24 für das fahren der Widerstand oder Ausdruck Kassetten fehlt Effizienz, wenn Zellen auf Bakterien gezüchtet werden. In unserem Plasmid-System fährt der hochaktiven act15 (Aktin 15) Veranstalter alle Expressionskassetten, während der Widerstand-Kassetten unter der Kontrolle eines Promotors coA (Coactosin A), sowohl sind von denen aktiv unter axenic Bedingungen und in Zellen, die auf Bakterien gezüchtet. Anforderungen für den Ausdruck der Reporter erstellt sowie Knock-in und Knock-out-Konstrukte machen es notwendig, unsere Plasmid-Repertoire zu benutzen, aber leider schränkt die Verwendung von Vektoren, die bereits erstellt, dass die Nutzung der ineffizienten act6 Projektträger.
Promotor Wirkungsgrade sind besonders wichtig für Transfektionen, die von einer einzigen Integration-Veranstaltung in der richtigen genomischen Lokus abhängen. Durch unsere Verbesserung der Promotoren fahren die Resistenz-Gen-Expression wird genügend Widerstand Protein aus einzelnen Lokus Integrationen hergestellt. Ein Hauptanliegen war die Begünstigung von mehreren Integrationen in das Genom, bei Verwendung von Hygromycin oder G418 wie beschrieben. Keine Begünstigung von mehreren Integrationen ist bisher, wie bereits berichtet für G418 Auswahlen mit älteren Förderer Systeme25beobachtet worden. Dies bedeutet, dass sowohl Hygromycin und G418 sind geeignete wählbaren Marker für die Erzeugung von sauberer Durchbrüche und Knock-VG leider nicht auswählbare Markierung Blasticidin funktioniert nicht axenic Bedingungen. Dies ist ein großer Nachteil unserer Methode, da die Blasticidin Widerstand Kassette routinemäßig verwendet, um Knock-out-Konstrukte in D. Discoideumzu generieren. Konstrukte, die bereits mit Blasticidin Widerstand Kassetten erstellt wurden müssen rederived werden unter Verwendung eines praktikablen wählbaren Marker. Eine andere Möglichkeit, diese Einschränkung zu überwinden ist, die kürzlich ins Leben gerufene axenic D. Discoideum CRISPR verbinden Technik mit diesem Transfektion Protokoll26. Die Generation geeignet, einzelne Guide RNAs (SgRNAs) ist einfacher und schneller als die Rekonstruktion der komplette Knock-out-Konstrukte. Für zukünftige Richtungen, die Möglichkeit mehrere Durchbrüche zu erzeugen mit CRISPR/Cas9 kombiniert mit diesem Protokoll Transfektion ist ansprechend und kann ebnen den Weg für viele Forscher in der Dictyostelium -Gemeinschaft. Die Verarbeitbarkeit des etablierten transiente Expressionssystems zur CRISPR/Cas9 in axenic gewachsenen Zellen sollten jedoch sorgfältig geprüft werden.
Das act5 Knock-in-System präsentiert bietet eine zuverlässige und sichere Integrationssystem zur Erzeugung von stabilen Zelllinien in D. Discoideum, mit dem Vorteil von ähnlichen Websites anderer Organismen22gegründet. Außerdem hängt von einer einzigen Integration Ereignis im Genom und bietet viele Möglichkeiten für verschiedene Forschungsrichtungen. Der act5 Projektträger ist stark aktiv und garantiert fast homogene Ausdruck27 unabhängig von den Anbaubedingungen. Fluoreszierende Reporter Proteine können diese sicherer Hafen-Locus mit veränderter targeting Plasmide leicht integriert werden. Dies ist nützlich, zum Beispiel für Handy-Tracking-Zwecke, wie hier in einem Mix-Experiment gezeigt. Die Zellen zeigen minimale Zelle zu Zelle Ausdruck Variabilität, die bei automatisierten Zelle tracking unterstützen kann. Wichtig ist, erscheint die Einfügung einer gewünschten Sequenz in den 5 handelnLocus phänotypisch neutral28,29. Wie der Ausdruck nicht auf eine auswählbare Markierung Proteinexpression, pflegen abhängt, wie in zufälligen Integrants oder extrachromosomale Vektor-Lager-Zell-Linien zu sehen, kann das act5 System für Rettung Experimente, sowie nützlich sein. Da die Zelllinien homogen sind, können alle Zellen analysiert werden. Dies ist nicht möglich mit einem extrachromosomale Plasmid für Ausdruck, in denen gibt es beträchtliche Heterogenität im Ausdruck.
Neben diesen allgemeinen Verbesserungen für alle Stämme ermöglicht das verwenden Sie nicht axenic Wildtyp Zellen für molekularbiologische Untersuchungen eine Bewertung der Auswirkungen der angesammelten Mutationen im aktuellen Laborbelastungen. Mehrere genetische Rearrangements ist seit der Verabschiedung des Stammes Ax2 1970 gefunden worden, wie zuvor veröffentlichten Microarray Analysen26gezeigt. Synthetische Phänotypen sind wegen des Vorhandenseins dieser Mutationen beobachtet. Beispielsweise zeigt eine gemeldete Phg2 Mutante verminderte Haftung in einem Labor Stamm Hintergrund und gesteigerte Adhäsion in einem anderen3. Solche widersprüchlichen Daten können jetzt durch Wiederholung des Experiments in der gemeinsame Vorfahr Belastung (in diesem Fall, DdB) gelöst werden. Die Stärke dieses Ansatzes hat sich vor kurzem für die kleine GTPase RasS30,31gezeigt.
Die Fähigkeit zur genetischen Experimente in jede Sorte von D. Discoideum erweitert das Potenzial der neuen Forschungsrichtungen, die die Verwendung von wilden Isolate, insbesondere solche, die gesellschaftliche Entwicklung, Kin Anerkennung und die sexuelle Zyklus22abhängen.

Gattung Dictyostelium sind Boden-lebendige soziale Amöbe, die vor allem von Bakterien ernähren. In der Phylum Amoebozoa gestellt, eine große Anzahl von Arten wurden isoliert, können in vier verschiedenen Stämme1gruppiert werden. Gattung Dictyostelium Discoideum (D. Discoideum) geworden beliebter Modellorganismus, komplexe zelluläre Prozesse wie Zelle Migration und Phagozytose zu studieren. Zu kontrollieren und zu standardisieren Versuchsbedingungen, axenic Zelle Linien entwickelt worden, die in komplexen oder definierten flüssigen Medium in der Abwesenheit von Bakterien2wachsen können. Von besonderer Bedeutung sind die Ax2, Ax3, und Ax4 Stämme, die alle in den 1970er Jahren erzeugt und schließlich von einem einzigen wilden abgeleitet isolieren SC43. Werkzeuge für die Gentechnik wurden in diese axenic Stämme, was in der ersten veröffentlichten k.o. in 19874,5entwickelt. Protokolle wurden weiterentwickelt und optimiert für den Einsatz unter axenic Bedingungen6,7.
Anpassung dieser Protokolle zu Wildtyp D. Discoideum wurden Stämme, die nicht in der Lage, flüssige Brühe wachsen sind von mehreren Labors versucht. Dies ist jedoch nicht vollständig erfolgreich geworden, da die Transfektion Protokolle komplex sind und mangelnde Effizienz, teilweise aufgrund der Handlungsfähigkeit der Bakterien als Senke für die selektive Reagenzien8,9. Infolgedessen kommt im Wesentlichen alle molekulare Daten auf D. Discoideum aus Nachkommen von einem einzigen Wildtyp Isolat. Wir wollten diese Einschränkung zu überwinden und eine Methode, um unabhängig von ihrer Fähigkeit zu wachsen in flüssigem Medium D. Discoideum Zellen genetisch zu verändern. Die Notwendigkeit für ein solches Verfahren kann die Beobachtung erklärt werden, dass es in der Vergangenheit, die die Mutationen erlauben axenic Wachstum vor allem neutral waren ausgegangen und Zellphysiologie keinen Abbruch wurde. Diese Vermutung ist nur teilweise richtig. Im Allgemeinen gibt es zwei bemerkenswerte Unterschiede; zunächst isoliert zwischen den verschiedenen axenic Stämmen, und zweitens, wenn diese axenic Stämme mit nicht axenic wild Isolate8,9verglichen werden.
Vielleicht ist der kritischste Faktor der Schlüssel axenic-gen, AxtB, das vor kurzem als RasGAP NF1 identifiziert wurde. Die Hauptfunktion des NF1 als ein RasGAP Ras Aktivität3zurückhalten soll. Die Streichung des Enzyms in allen axenic Stämmen führt zu einer übermäßigen Ras Aktivität manifestiert als die Bildung von großen aktiven Ras-Patches. Diese erweiterten Ras-Patches führen zu die Ansammlung von PIP3 in der Plasmamembran. Diese zufälligen erscheinenden Flecken von PIP3 und aktiven Ras sind eine Vorlage für die Bildung von einem kreisförmigen Rüsche, die schließlich schließt und führt zur Bildung von Macropinosomes10. Die Folge ist eine übermäßige Zunahme der Macropinocytic Aktivität. Macropinocytosis ist ein Aktin-gesteuerten Prozess. Ein Wettbewerb für Zellskelett Komponenten für die Bildung von Macropinosomes oder Scheinfüßchen entsteht. Seinen Einfluss auf das Verhalten der Zelle spiegelt sich in der fast vollständige Verhinderung des Chemotaxis von vegetativen Zellen an Folat11. Die massiv erweiterten PIP3 Flecken sind sehr hartnäckig. Auch im ausgehungerten Zellen die PIP3 Patches bleiben und als Scheinfüßchen, die Interpretation von Studien über die Chemotaxis, cAMP Probleme verursachen können fehlinterpretiert werden können.
In einigen Fällen eignet sich die NF1 Mutation experimentell. Dies führt uns zu eine zweite Motivation für die Entwicklung einer Transfektion Methode für bakteriell gewachsenen D. Discoideum Zellen, da die Erhöhung Macropinocytosis axenic Zellen für die Untersuchung von grundlegenden Aspekte dieses Prozesses12 wertvoll macht . Jedoch haben Mutationen in den Genen für Macropinocytosis, wie z. B. Ras und PI3-Kinasen10, benötigt fast abgeschafft axenic Wachstum, machen es notwendig, diese Zellen durch Wachstum auf Bakterien zu manipulieren. Ein weiterer Grund, der Bakterien-basierte Transfektionen wertvoll macht ist der zunehmende Einsatz von Dictyostelids Fragen in der Entwicklung von Multi-Zellularität13,14, Kin Anerkennung15,16, und altruistische zellulären Verhalten, welches hauptsächlich davon abhängen, die Verwendung von frisch isolierte Wildtyp isoliert17. Alle genannten Forschungsbereiche durch effiziente Methoden zur Genmanipulation von wilden Isolaten gefördert werden können, die nicht axenic sind und wachsen nicht in flüssige Brühe.
Unsere Protokolle zulassen für die Überwindung der beschriebenen Einschränkungen. Zusammengenommen, die Möglichkeit der Durchführung von genetischer Manipulationen mit bakteriellen gewachsen D. Discoideum Zellen hält Vorteile für alle Dictyostelium Forscher, auch wenn es nur die erhöhte Geschwindigkeit des Auswahlverfahrens aufgrund schneller Wachstum der Amöbe (4 h Verdopplungszeit) auf Bakterien im Vergleich zu Wachstum in axenic Medien (10 h Verdopplungszeit).

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	</colgroup>
	<tbody>
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			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Equipment</td>
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-400-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">12823252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EP6331000025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gene Pulser X Cell, including CE &#38; PC modules</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652660</td>
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Safety Cabinet Foruna - SCANLAF</td>
			<td style="width:184px;">Labogene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BioPhotometer Plus</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CLSM 710</td>
			<td style="width:184px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Media &#38; Agaroses</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LoFlo Medium</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LF0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:184px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Low EEO Agarose</td>
			<td style="width:184px;">BioGene</td>
			<td style="width:119px;">300-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Purified Agar</td>
			<td style="width:184px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SM broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">SMB0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2x LB broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LBD0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Chemicals</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HEPES free acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">391340 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">P/4800/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">Na2HPO4 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2 * 6 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">5982 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">CaCl2 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">442909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KOH</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">26668.263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cultur Dishes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5</td>
			<td style="width:184px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:119px;">P50G-1.5-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Geneticin G418-sulphate</td>
			<td style="width:184px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hygromycin B Gold</td>
			<td style="width:184px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Additional Consumables</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2mm gap electroporation cuvettes, long electrode</td>
			<td style="width:184px;">Geneflow Limited</td>
			<td style="width:119px;">E6-0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10 &#181;l Inoculating Loop, Blue 10 Micro L</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">129399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Spreader, L-shaped, sterile</td>
			<td style="width:184px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">730190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Combitips advanced 5 ml</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf BIOPUR</td>
			<td style="width:119px;">30089669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Kits</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ZR Plasmid Miniprep Classic</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D4016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Quick DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zymoclean DNA Recovery Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Enzymes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0482L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td style="width:184px;">TakaraBio</td>
			<td style="width:119px;">R045A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria

Dictyostelium Discoideum ist eine faszinierende Modellorganismus zur Erforschung der Zelle Differenzierungsprozesse während Entwicklung, Zelle und andere wichtige zelluläre Biologie Fragen. Die Technologien zur Verfügung, Dictyostelium Zellen genetisch zu manipulieren sind gut entwickelt. Transfektionen können mit verschiedenen wählbaren Markierungen und Marker, Recycling, einschließlich homologe Rekombination und insertional Mutagenese durchgeführt werden. Dies wird unterstützt durch eine gut kommentierte Genom. Jedoch diese Ansätze sind optimiert für axenic Zelllinien in flüssigen Kulturen wachsen und schwierig anzuwenden, nicht axenic Wildtyp Zellen, die nur sich von Bakterien ernähren. Die Mutationen, die in axenic Stämme sind, Ras-Signalisierung, verursacht übermäßige Macropinocytosis erforderlich für die Fütterung zu stören und beeinträchtigen Zellwanderung, die die Interpretation der Signaltransduktion und Chemotaxis Experimente in dieser Stämme verwirrt. Frühere Versuche, nicht axenic Zellen genetisch zu manipulieren haben Effizienz und erforderlichen komplexen experimentellen Verfahren fehlte. Wir haben ein einfaches Transfektion Protokoll entwickelt, die zum ersten Mal diese Grenzen überwindet. Diese Reihe von großen Verbesserungen an Dictyostelium molekulare Genetik erlauben Wildtyp Zellen so einfach wie standard Laborbelastungen manipuliert zu werden. Neben den Vorteilen für das Studium uncorrupted Signal- und Motilität Prozesse können Mutanten, die Macropinocytosis abgestütztes Wachstum stören jetzt leicht isoliert werden. Darüber hinaus ist die gesamte Transfektion Workflow erheblich beschleunigt, mit rekombinanten Zellen, die in Tagen statt Wochen generiert werden können. Ein weiterer Vorteil ist, dass molekulare Genetik mit frisch isolierte Wildtyp Dictyostelium Proben aus dem Umfeld weiter durchgeführt werden kann. Dies kann helfen, den Anwendungsbereich der Ansätze auf diesen Forschungsgebieten.

Extrachromosomale Plasmide dienen Reporter Studien, die darauf abzielen, die Lokalisierung bestimmter Proteine in einer Zelle oder Veränderungen in der Zellstruktur der mutierten Zellen zu identifizieren. Für viele Ansätze, wie die Überwachung des Zellzyklus ist es wichtig, zwei Reporter zur gleichen Zeit auszudrücken. Dies ist jetzt möglich mit unserem dual Reporter extrachromosomale Plasmid System (Tabelle 1). Am 1. Tag wurden Zellen transfiziert vor dem Hinzufügen des wählbaren Markers G418 nach 5 h (Abbildung 1). In dem Beispiel SC4, DdB, Ax2 und unabhängig voneinander abgeleiteten wild Isolate V12M2 und WS2162 (zusätzliche Tabelle1) wurden mit dem Plasmid pPI289, die kodiert für GLP-TubulinA, ein Marker für die Mikrotubuli und mCherry-PCNA, ein Protein, das transfiziert zur Überwachung des Zellzyklus (Abb. 2A) eingesetzt. Nach 32 h wurden die Zellen unter dem Mikroskop beobachtet. Der Großteil der Zellen sowohl fluoreszierende beschriftet Fusionsproteine ausgedrückt meldet konsistent mit früheren diesen Ausdruck von zwei Reporter aus den gleichen Plasmid zeigt ähnliche Ausdruck, was fast unmöglich ist, bei der Verwendung von zwei unterschiedlichen Plasmide 18,19. Eine repräsentative Zelle für jede Zelllinie (SC4, DdB, Ax2, V12M2 und WS2162) mit dem Ausdruck der gewünschten dual Reporters in Abbildung 2Bdargestellt ist. Die Transfektion Wirkungsgrade sind in Abbildung2 Czusammengefasst. SC4-abgeleitete Zell-Linien zeigen die besten Transfektion Wirkungsgrade. Für Zell-Linien V12M2 und WS2162, wurde jedoch eine deutlich hohe Anzahl von Transfectants erhalten.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig2.jpg"> Abbildung 2 : Ausdruck einer extrachromosomale Plasmid. (A) extrachromosomale Plasmide sind direkt in Kreisform transfiziert. Als Beispiel ist der dual Reporter pPI289 gezeigt. Die NgoMIV Orte anzugeben Einfügung der zweiten Reporter in die extrachromosomale Expressionsplasmid. (B) Z-Projektion einer repräsentativen Zelle GFP-TubulinA (zytoplasmatischen) und mCherry-PCNA (weitgehend nuklearen) für fünf unterschiedliche Wildtyp Zelllinien verwendet (SC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162) zum Ausdruck bringt. (C) die Transfektion Wirkungsgrade für die fünf Zell-Linien im Bild (b) wurden berechnet. Dargestellt ist der Mittelwert der beiden Experimenten. Fehlerbalken zeigen ± SD <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
Integration von einem Targetingvektor in einen angegebenen genomischen Locus ist schwieriger und erfordert eine sorgfältigen Analyse der generierten Zelllinie. In Abbildung 3wird eine act5- mCherry KI in SC4 versucht. Erstens muss das Plasmid linearisiert werden, um die Häufigkeit der Rekombinationsereignisse nach Transfektion erhöhen. Hierzu wird das Plasmid pDM1514 mit NgoMIV geschnitten. Zwei Bands erhalten Sie nach dem Ausführen des Digests auf einem Agarosegel. Die 4127 bp-Band enthält das gewünschte Konstrukt (Abbildung 3). Zur Transfektion die verdaute DNA aus dem Gel extrahiert werden muss und gereinigt mit einem Gel Extraction Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig3.jpg"> Abbildung 3 : Vorbereitung von act5 Knock-in und DNA zur Transfektion. Ein Beispiel für die Verwendung einer 5 handeln-Knock-in das Plasmid pDM1514. Die Schritte zur Vorbereitung sind wie folgt. (A) vor der Elektroporation, linearisieren das Plasmid mit dem angegebenen Ngo-MIV-Sites. (B, C) Führen Sie die geschnittenen Plasmid auf ein Agarosegel aus, bevor die beiden erwarteten Bands richtig getrennt sind. Schneiden Sie die 4127 bp Band enthält die Rekombination Arme, mCherry und der Widerstand-Kassette und Gel die DNA extrahieren. Die DNA ist nun bereit zur Transfektion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Die gereinigte DNA wurde für die Transfektion von SC4 Zellen verwendet. Nach ca. 5-6 Tagen Auswahl wurden Klone erhalten. Repräsentative Transfektion Wirkungsgrade und die Höhe der positiven identifizierten Klone für mehrere act5 Knock-Versuche sind in Tabelle 3zusammengefasst. Zwei Klone von SC4 Transfektion wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und analysiert mittels PCR (Abb. 4A), und beide zeigten die vorhergesagten Band Muster erwartet ein Knock-in und weitere validiert mit südlicher Fleckanalyse zu eine einzige Integration zu gewährleisten Veranstaltung des Konstrukts in der Genom-20. Der Blot zeigt eine klare einheitliche Integration in die gewünschte act5 Locus (Abbildung 4B). Die erzeugten NC4::act5-mCherry -Zell-Linie kann jetzt in Experimenten verwendet werden.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig4.jpg"> Abbildung 4 : Validierung der act5- mCherry KIs in SC4. (A) Regelung und Steuerung PCRs zur Validierung von positiven Integrationen in act5 Locus. Die angegebenen Primer wurden verwendet, um zwei unabhängige Klone und die Eltern zu analysieren. Beide Klone zeigen die erwarteten Bands für den Widerstand-Kassette und nachgeschalteten (P1) oder upstream Primer (P2), die nicht in der elterlichen Belastung vorhanden sind. Die Primer-Kombination (P1/P2) bestätigt die korrekte Integration von mCherry und Widerstand Kassette act5 Locus. Der Wildtyp SC4 zeigt die erwarteten 2800 bp Band, während beide KI-Klone dieser Band fehlt und stattdessen ein PCR-Produkt über 1400 Basenpaare größer angezeigt. (B) Regelung für die verwendeten Beschränkungsauswahl und südlicher Fleck. Beide Knock-in-Klone zeigen die kleineren 3400 bp Band, das ist das Ergebnis der Integration des Konstrukts in den 5 handelnLocus, speziell die zusätzlichen BclWebsite ich in der Hygromycin-Resistenz-Kassette. Die Wildtyp Steuerelement zeigt die erwarteten 5,8 kb infolge der zwei nachgeschalteten befindet sich BclWebsites ich. Der Fleck war beschnitten und gespleißt aus Gründen der Übersichtlichkeit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>gezielte Konstrukt in der act5 Lokus</td>
			<td>Plasmid-name</td>
			<td>Anzahl der besetzten Brunnen</td>
			<td>Anzahl der aufgegebenen Klone</td>
			<td>Positive Klone</td>
			<td>Richtige Klone (%)</td>
			<td>Verwendete Dictyostelium-Stamm</td>
			<td>Transfektion Effizienz (Transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µg DNA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-mCherry</td>
			<td>pPI226</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>14.2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-GFP</td>
			<td>pPI227</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>5</td>
			<td>41,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>6 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>66,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1,5 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1,5 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>66</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td>55,5</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.3 x 10 ^-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>221</td>
			<td>12</td>
			<td>10</td>
			<td>83,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.1 x 10 ^-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1,5 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>85,7</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>70</td>
			<td>DdB</td>
			<td>5 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>240</td>
			<td>12</td>
			<td>11</td>
			<td>91,6</td>
			<td>DdB</td>
			<td>1.2 x 10 ^-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>320</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>100</td>
			<td>SC4</td>
			<td>1.6 x 10 ^-4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Transfektion Wirkungsgrade und die Höhe der erhaltenen positiven Transfectants zur Erzeugung von act5 KIs in anderen Stamm Hintergründe 22 .
Die 5 handelnLocus bietet relativ homogenen Ausdruck der integrierten Reporter21. Die erzeugten NC4::act5-mCherry -Zellen ermöglichen Mischung Experimente mit anderen act5 Knock-ins mit einem verschiedenen fluoreszierenden Proteins wie GFP durchgeführt werden. Den großen Vorteil dieses Systems zu betonen, sind mischen Experimente mit Ax2::act5-GFP gezeigt. Aufgrund der Unfähigkeit, nicht axenic Wildtyp Zellen zu transfizieren könnte diese Art von Ansatz nicht vor durchgeführt werden. Mix Experimente sind ein wichtiges Instrument zur Zelle Verhalten zu analysieren, denn sie ermöglichen einen direkten Vergleich zwischen verschiedenen Zelllinien, die identische Versuchsbedingungen zu erleben. SC4 Zellen wachsen schneller auf bakterielle Rasen als Ax2 Zellen (Abb. 5A). Dies ist möglicherweise aufgrund einer höheren Kapazität zu phagozytieren Bakterien oder verbesserte Fähigkeit zu bewegen und zeigen Chemotaxis gegenüber eine Nahrungsquelle. Verwenden ein unter Agar Folat Chemotaxis-Assays, wurde eine Bevölkerung von NC4::act5-mCherry und Ax2::act5-GFP im direkter Vergleich durchgeführt, zeigen, dass NC4::act5-mCherry sind sehr viel effizienter in der Sensorik Folat. Nach 4 h konnten weitere NC4::act5-mCherry -Zellen kriechen unter die Agarose als Ax2::act5-GFP Zellen (Abb. 5B). Standard Analyse von Chemotaxis für die Zellen unter der Agarose Migration ergab, dass NC4::act5-mCherry -Zellen schneller waren und stärkere chemotaktische Reaktion als Ax2::act5-GFP Zellen (Abbildung 5C-E zeigten ).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig5.jpg"> Abbildung 5 : Mit 5 handelnKIs für Image-basierte Chemotaxis Mischung Experimente. (A) NC4::act5-mCherry und Ax2::act5-GLP mit dem Ausdruck das angegebene fluoreszierende Protein aus den 5 handelnLocus für die Fähigkeit, auf eine bakterielle Rasen wachsen analysiert wurden. Nach 4 Tagen wurden die Plakette Durchmesser entstanden aus einsamen vergoldeten Dictyostelium Zellen gemessen. Non-axenic act5:: SC4 Zellen machen deutlich größeren Plaques als axenic Ax2::act5-GFP -Zellen (± SD bedeuten *** p < 0,0001, n = 3, 5 mm Maßstab). (B) für die Nutzung der unter Agarose Folat Chemotaxis assay22 , die chemotaktische Fähigkeiten des NC4::act5-mCherry und Ax2::act5-GFP verwendet in (A) direkt zu vergleichen, Bakterien-Amöben beider Stämme gewachsen waren gemischt im Verhältnis 50: 50. Zellen durften kriechen unter die Agarose. Nach 4 h wurden die Zellen, die die Folsäure Steigung Migration waren abgebildet mit einem konfokalen Mikroskop. Dann wurde die Anzahl der NC4::act5-mCherry und Ax2::act5-GFP Zellen bestimmt. NC4::act5-mCherry -Zellen waren effizienter in der Sensorik Folat. Über 10-divisibel mehr NC4::act5-mCherry Zellen fanden im Vergleich zu Ax2::act5-GFP Zellen (± SD bedeuten *** p < 0,0001, n = 6, Skala bar 100 µm). (C, D) Die Zellen wurden für 60 min. gefilmt, und ihre Geschwindigkeit und chemotaktische Index berechnet wurden. Nach einer Vorauswahl der meisten chemotactically reagieren Zellen (nur diejenigen, die unter die Agarose migriert), Zellen Ax2::act5-GFP zeigten niedrigere Werte für Zelle Geschwindigkeit und Chemotaxis. Fünfzig Zellen pro Zell-Linie wurden analysiert. (Median ± SD, * p < 0,01, n = 3). (E) die Spuren der NC4::act5-mCherry und Ax2::act5-GFPact5 Knock-ins werden über 60 min, zeigen mehr gerichtete Bewegung in Richtung der Chemoattractent Quelle der NC4::act5-mCherry Zellen gezeichnet (Median ± SD, ** * p < 0,0001, n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Die act5 Knock-in Zell-Linien können auch für Durchflusszytometrie verwendet werden. Wie bei Wachstum auf Bakterien, gibt es große Unterschiede in der Entwicklung axenic Stämme und nicht axenic Wildtypen. Nach der Entwicklung der Fruchtkörper SC4 Zellen sind etwa doppelt so groß wie die von Ax2 Zellen abgeleitet. Wenn Zellen gemischt werden, ergibt sich eine mittlere Größe Fruchtkörper. Um den Beitrag der beiden Zelllinien mehr quantitativ zu analysieren, wurde Durchflusszytometrie verwendet. Diese Analysen zeigten deutlich, dass die mittlere Fruchtkörper durch verschiedene Ebenen des Beitrags von beiden Zelllinien sind. Während NC4::act5-mCherry -Zellen bis zu ca. 75 % der gemessenen Sporen gebildet, trugen Ax2::act5-GFP nur 25 %, offenbart einen potenziellen Fitness-Vorteil für nicht-axenic-Stämme (Abbildung 6). Da die Analyse der Stiel-Zell-Population nicht überwacht, gibt es zwei Möglichkeiten, das Ungleichgewicht in der Entwicklung zwischen Ax2 und SC4 zu erklären. Eine Möglichkeit ist, dass Ax2 Zellen vor allem auf den Stiel-Zell-Population, anstatt die Spore-Zell-Population beitragen. Alternativ können mehr SC4-Zellen die Entwicklungen-Zyklus, mit Ax2 relativ verzögert, und sie sind daher nicht zu der Versammlung einen Fruchtkörper beitragen. Die Möglichkeit, nicht-axenic Wildtyp Zellen zu transfizieren andere Ansätze weiterentwickelt und experimentelle Verfahren erheblich vereinfacht.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig6.jpg"> Abbildung 6: Act5 KIs erlauben eine Analyse der Mischung Experimente mit Durchflusszytometrie. (A) NC4::act5-mCherry und Ax2::act5-GFP wurden einzeln oder in einer 50: 50 Mischung auf Agarplatten-Nährstoff entwickelt. NC4::act5-mCherry Zellen bilden größere Fruchtkörper als Ax2::act5-GFP. Die Mischung zeigt stattdessen eine Zwischengröße (Skala 5 mm). Konfokale Fluoreszenzmikroskopie Licht schlägt vor, einen höheren Anteil an NC4::act5-mCherry Sporen in die Spore-Köpfe, abgeleitet aus den Mischungen. (B), diese Beobachtung, die Mengen von Sporen in der geernteten Spore zu quantifizieren, die Köpfe aus dem Mischpult Experiment in (A) durch Durchflusszytometrie analysiert wurden. Etwa 75 % der Sporen stammt aus NC4::act5-mCherry Zellen mit nur 25 % vom Ax2::act5-GFP Zellen. (C) repräsentative Verteilung der Sporen von beiden Zelllinien in einen Flow Cytometry Scatter gezeigt. Ca. 0,05 % zeigen positive mCherry und GLP signalisiert, was darauf hindeutet, dass parasexual Fusionsprozesse aufgetreten sind oder, dass Sporen in einander stecken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Zell-Linie</td>
			<td>Genetisch Hintergrund</td>
			<td>Referenz-Nummer</td>
			<td>Veröffentlicht vor</td>
			<td>Typ</td>
		</tr>
<tr>
<td>AX2 (Ka)</td>
			<td></td>
			<td>DBS0235521</td>
			<td>Bloomfield Et Al., 2008</td>
			<td>Wildtyp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SC4 (S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield Et Al., 2008</td>
			<td>Wildtyp</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::mCherry Klon 5</td>
			<td>SC4</td>
			<td>HM1912</td>
			<td>Paschke Et Al., 2018</td>
			<td>act5 Knock-in</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::GFP Klon 2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>HM1930</td>
			<td>Paschke Et Al., 2018</td>
			<td>act5 Knock-in</td>
		</tr>
<tr>
<td>V12M2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield Et Al., 2008</td>
			<td>Wildtyp</td>
		</tr>
<tr>
<td>WS2162</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield Et Al., 2008</td>
			<td>Wildtyp</td>
		</tr>
</tbody></table>Ergänzende Tabelle1: verschiedene Stämme von Dictyostelium studierte.

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Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Gentechnische Veränderung von Dictyostelium Discoideum Zellen basierend auf Auswahl und das Wachstum von Bakterien

Dictyostelium Discoideum ist ein beliebter Modellorganismus, komplexe zelluläre Prozesse wie Zelle Migration, Endozytose und Entwicklung zu studieren. Das Dienstprogramm des Organismus ist abhängig von der Machbarkeit der Genmanipulation. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden, um Dictyostelium Discoideum Zellen zu transfizieren, die bestehende Grenzen der Kultivierung Zellen in flüssigen Medien zu überwinden.

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Der Wert dieses Protokolls ist, dass es es erlaubt, fast jeden Stamm von Dictyostelium-Discoideum durch Molekulargenetik zu manipulieren, unabhängig davon, ob dieser Stamm axenisch im flüssigen Medium wächst oder nicht. Der andere Vorteil dieser Technik ist, dass sie schnell und einfach ist. Transponieren Sie zu transfekten Zellen mit einem exochromosomalen Plasmid, bevor Sie beginnen, Dikyosteliume zu mischen.Die Ergebnisse können bereits zwei Tage nach der Transfektion mittels Mikroskopie validiert werden. Es ist ungewöhnlich, mit Dictyostelium-Zellen und Bakterien Suspension zu arbeiten. Die Visualisierung wird den Experimentatoren eine Vorstellung davon vermitteln, wie die verschiedenen Schritte der Protokolle ausgeführt werden.Demonstrieren das Verfahren mit mir wird Soudabeh Imanikia, ein Postdoc aus meinem Labor sein. Zunächst 1000 Milliliter Sorensen-Puffer-Arbeitslösung mit Magnesiumchlorid und Calciumchlorid nach dem Textprotokoll vorbereiten. Danach verwenden Sie eine einzige Kolonie von K Aerogenes, um einen Liter LB-Medium zu impfen.Lassen Sie die Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln wachsen. Drehen Sie die Zellen in zwei 500 Milliliter Zentrifugenröhren nach unten, um die Zellen zu ernten. Dann waschen Sie die Bakterien einmal mit 500 Milliliter Puffer.Das Pellet in 20 Milliliter Puffer wieder aufhängen. Verwenden Sie ein Photometer, um die optische Dichte der Probe zu überprüfen und die Probe mit Puffer zu verdünnen, bis die optische Dichte etwa 100 beträgt. Danach bereiten Sie den Elektroporationspuffer H40 entsprechend dem Textprotokoll vor.Wachsen Sie K-Aerogene, um ein SM-Medium über Nacht bei Raumtemperatur zu konfluken. 400 Mikroliter bakterielle Suspension zu einer SM-Agarplatte geben und gleichmäßig verteilen. Nehmen Sie dann eine sterile Schleife und impfen Sie sie mit Dikyosteliumzellen und verbreiten die Zellen an einem Rand der Platte.Inkubieren Sie die Platte zwei Tage lang bei 22 Grad Celsius, um sicherzustellen, dass die Wachstumszonen groß genug für die Transfektion sind. Fügen Sie 10 Milliliter K Aerogene Suspension zu einer 10 Zentimeter Gewebe kulturbehandelten Petrischale hinzu. Verwenden Sie dann eine 10-Mikroliter Einweg-Impfschleife, um Zellen aus den Wachstumszonen der Kulturplatte zu kratzen.Übertragen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Rohr, das einen eiskalten H40-Puffer enthält. Drehen Sie die Zellen für zwei Sekunden bei 10000-facher Schwerkraft. Entsorgen Sie dann den Überstand, und setzen Sie die Zellen im H40-Puffer wieder auf.Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der Zellen in eine Röhre mit ein bis zwei Mikrogramm DNA. Pipette nach oben und unten, um die Zell-DNA-Mischung zu mischen und in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette zu übertragen. Fügen Sie nicht mehr als zwei Mikrogramm DNA hinzu.Eine höhere DNA-Konzentration ist toxisch für die Zellen und reduziert die Effizienz. Nach der Elektroporation die Zellen sofort in eine vorbereitete 10-Zentimeter-Petrischale übertragen und die Zellen für fünf Stunden erholen lassen. Um ein Transfektat für einen Knock-out, ein Knock-in oder einen Akt fünf Einschlag auszuwählen, lösen Sie die Zellen von der Petrischale, indem Sie Flüssigkeit über die Oberfläche pfeifen.Richten Sie dann drei Verdünnungen des selektiven Agenten gemäß dem Textprotokoll ein. Schließlich verteilen Sie 150 Mikroliter der vorbereiteten Verdünnungen in jeden Brunnen von 96-gut flachen Gewebekulturplatten. In diesem Protokoll wurde ein extrachromosomales Plasmidsystem mit zwei Reportern demonstriert.32 Stunden nach der Transfektion exprimierte die Mehrheit der Zellen beide fluoreszierend gekennzeichneten Fusionsproteine. Ein Akt fünf M Kirsche Knock-in und ein NC4 wurde auch versucht. Zwei Bänder wurden erhalten, nachdem der Digest auf einem Agarose-Gel ausgeführt wurde.Das 4127 Basispaarband enthält das gewünschte Konstrukt. Die gereinigte DNA wurde für die Transfektion von NC4-Zellen verwendet. Zwei Klone der NC4-Transfektion wurden über PCR analysiert und beide zeigten die vorhergesagten Bandmuster.Southern Blot wurde dann verwendet, um die Ergebnisse der PCR zu validieren. Der NC4 wuchs auf bakteriellen Rasenflächen schneller als Ax2-Zellen. Nach vier Stunden konnten mehr NC4-Zellen unter die Agarose kriechen als Ax2-Zellen.Die NC4-Zellen waren schneller und zeigten eine stärkere chemotaktische Reaktion auf Folat als die Ax2-Zellen. Verwenden Sie immer Zellen aus frisch eingerichteten SM-Platten. Verwenden Sie niemals Zellen, die älter als vier Tage sind, sonst sinkt die Effizienz.Frisch isolierte, nonextenische, weiße HAP-Stämme werden häufig verwendet, um Fragen zu einem Ruching oder sozialen Verhalten von Dikyosteliumen zu beantworten. Unsere ermöglicht es, Molekulargenetik durch diese Isolate anzuwenden.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Genetic Engineering eines Unconventional Hefe für Erneuerbare Biokraftstoff- und Biochemie Produktion

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Forschung

Genetik

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

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Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

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Genetische Kartierung von Thermotoleranzunterschieden zwischen Spezies von Saccharomyces Hefe über Genom-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...