Name: genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

המחברים תודה למעבדה קיי עבור קלט לשיטה זו LMB מיקרוסקופ לזרום cytometry במתקני לתמיכה מדעיים וטכניים מעולים. עבודה זו מומן על ידי המועצה למחקר רפואי מענק MC_U105115237 ר ר קיי, BBSRC (ביוטכנולוגיה, מחקר מדעי הביולוגיה המועצה) מענק BB/K009699/1 לקיי רבי רבי, לחקר הסרטן בבריטניה להעניק A15672 ר ה Insall, Wellcome אמון מלגת בכיר 202867/ת/16/Z ג'ונתן R צ'אב ולאחר MRC מימון (MC_U12266B) ליחידה אוניברסיטת LMCB MRC ב UCL.

<ol>
	<li>Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Dictyostelium+discoideum.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum.</a> Development. 138 (3), 387-396 (2011).</li><li>Sussman, R., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Dictyostelium+discoideum+in+axenic+culture.">Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).</li><li>Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+the+Dictyostelium+alpha-actinin+gene+leads+to+an+altered+mRNA+and+lack+of+the+protein.">Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein.</a> The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).</li><li>De Lozanne, A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+Dictyostelium+myosin+heavy+chain+gene+by+homologous+recombination.">Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination.</a> Science. 236, 1086-1091 (1987).</li><li>Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+transient+expression+system+for+Dictyostelium+discoideum.">Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum.</a> Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).</li><li>Knecht, D., Pang, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Dictyostelium+discoideum.">Electroporation of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).</li><li>Wetterauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+strains+of+Dictyostelium+discoideum+can+be+transformed+using+a+novel+selection+cassette+driven+by+the+promoter+of+the+ribosomal+V18+gene.">Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene.</a> Plasmid. 36, 169-181 (1996).</li><li>Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditions+for+the+transformation+of+nonaxenic+Dictyostelium+strains.">Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains.</a> Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).</li><li>Bloomfield, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+controls+macropinocytosis+and+phagocytosis+in+Dictyostelium.">Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP(3)-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Hoeller, O., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+the+absence+of+PIP3+gradients.">Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients.</a> Current Biology. 17, 813-817 (2007).</li><li>Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dictyostelium+RasS+protein+is+required+for+macropinocytosis,+phagocytosis+and+the+control+of+cell+movement.">The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement.</a> Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).</li><li>Schaap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phylogeny+and+evolution+of+morphology+in+the+social+amoebas.">Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas.</a> Science. 314, 661-663 (2006).</li><li>Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+Aggregative+Multicellularity+and+Cell-Cell+Communication+in+the+Dictyostelia.">The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).</li><li>Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+in+social+amoebae+is+mediated+by+allelic+pairs+of+tiger+genes.">Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes.</a> Science. 333 (6041), 467-470 (2011).</li><li>Strassmann, J. E., Queller, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+cooperation+and+control+of+cheating+in+a+social+microbe.">Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).</li><li>Wolf, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+Trade-offs+Result+in+the+Illusion+of+Social+Success.">Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success.</a> Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).</li><li>Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+set+of+small,+extrachromosomal+expression+vectors+for+Dictyostelium+discoideum.">A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum.</a> Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).</li><li>Woznica, D., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under-agarose+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).</li><li>Dubin, M., Nellen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+set+of+tagged+expression+vectors+to+monitor+protein+localisation+and+function+in+Dictyostelium.">A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium.</a> Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).</li><li>de Hostos, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+mutants+lacking+the+cytoskeletal+protein+coronin+are+defective+in+cytokinesis+and+cell+motility.">Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility.</a> Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).</li><li>Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+targeting+of+multiple+genes+in+Dictyostelium.">CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).</li><li>Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+harbours+for+the+integration+of+new+DNA+in+the+human+genome.">Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).</li><li>Rosengarten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaps+and+lulls+in+the+developmental+transcriptome+of+Dictyostelium+discoideum.">Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum.</a> BMC Genomics. 16, 294 (2015).</li><li>Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-mediated+diversification+of+transcriptional+bursting+dynamics+following+gene+duplication.">Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).</li><li>Gebbie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phg2,+a+kinase+involved+in+adhesion+and+focal+site+modeling+in+Dictyostelium.">Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

השימוש הלא-axenic, פראי-סוג תאים Dictyostelium הוגבלה מאוד עד כה במחקר מולקולרי. השיטות הזמינות עבור הנדסה גנטית זנים אלה יש חסר אמינות, יעילות23, מניעת אימוץ כללי שלהם. החומרים המופקים והפרוטוקולים המובאת כאן יכול לשמש עבור כל זן discoideum ד עצמאית של יכולתו לגדול במדיום נוזלי. יצוין, כי פרוטוקול זה ממוטב עבור שורות תאים נגזר NC4. תרביות תאים יעילות עבור זנים טרי מבודד מן הטבע נבדלים NC4, כאשר הבחינו לפני מוצגות כאן8,V12M2, WS21629. התנאים אלקטרופורציה נראה בפרט יש השפעה ניכרת על היעילות תרביות תאים, מחייבים נוספים מיטוב עבור זנים מסוימים. באופן כללי, כמות מספקת של transfectants נצפו כל זני נבדקו עד כה, מראה כי שיטות אלה הם מעשי. מספר חיובי transfectants תוך שימוש NC4-derived זנים הוא גבוה יותר בהשוואה זנים אחרים-פראי-סוג הלא-axenic, אך בכל המקרים, מספר מספיק של transfectants מתקבלים כדי לאפשר לניסויים נוספים. זה, וגם את הפשטות של הפרוטוקול שלנו הוא שיפור משמעותי לעומת ניסיונות קודמת8,9.
פרוטוקולים אלה שאינם axenic חדש לכסות את כל נהלי גנטי ולהוסיף יתרונות נוספים, כיוון transfections יכול להתבצע במהירות וביעילות במקביל. ניתן להשיג שיבוטים חיובית בתוך ימים ולא שבועות, מאז גידול על חיידקים חצאים הזמן החטיבה. פלסמידים שהוקם גם לעבוד תחת התנאים axenic, יכול להיות בשימוש שגרתי תחת שני תנאים צמיחה, וזה עוד לקידום הזה methology22. כפי הוצג הפרוטוקול, פלסמיד משמש בחירה על חיידקים יש דרישות מיוחדות, חיוניות להצלחת תרביות תאים. בפרט, היזמים נהיגה הקלטות הביטוי והתנגדות חשובים עבור תקנים מוצלחת. יזם שמרבים להשתמש בו act6 (אקטין 6)24 נהיגה הקלטות התנגדות או ביטוי חסר יעילות כאשר התאים גדלים על חיידקים. במערכת שלנו פלסמיד, האמרגן פעיל ביותר act15 (אקטין 15) כונני קלטות כל ביטוי, בזמן הקלטות ההתנגדות נמצאים תחת השליטה של מקדם coA (coactosin A), שניהם אשר פעילים תחת תנאים axenic תאים גדל על חיידקים. דרישות עבור הביטוי של הכתב בונה כמו גם בטוק, הנוק-אאוט בונה את הצורך להשתמש הרפרטואר שלנו פלסמיד, אך למרבה הצער מגביל את השימוש וקטורים כבר יצרת שימוש זה האמרגן לא יעיל act6 .
מקדם היעילות הם קריטיים במיוחד עבור transfections תלויים אירוע יחיד אינטגרציה לתוך מיקומה גנומית הנכון. עקב השיפור שלנו של היזמים נהיגה בביטוי הגן ההתנגדות, מספיק חלבונים ההתנגדות מופק שילובים לוקוס בודד. הדאגה העיקרית הייתה העדפה של שילובי מרובים לתוך הגנום בעת שימוש hygromycin או G418 כמתואר. אין העדפה של שילובי מרובים נצפתה כה, כפי שדווח בעבר עבור בחירות G418 בעזרת מבוגר המקדם מערכות25. משמעות הדבר היא כי הן hygromycin ו- G418 הם סמנים לבחירה מתאימה לדור של נקי שירותי. טוק, טוק-חברה למרבה הצער, blasticidin סמן לבחירה לא עובד בתנאים שאינם axenic. זהו חיסרון גדול של השיטה שלנו, שכן בקלטת ההתנגדות blasticidin משמש באופן שגרתי כדי לייצר מעלף בונה ב discoideum ד. בונה זה נוצרו כבר עם קלטות ההתנגדות blasticidin צריך להיות rederived באמצעות אחד הסמנים ניתן לבחירה עביד. אפשרות אחרת כדי להתגבר על מגבלה זו היא לשלב את הוקמה לאחרונה axenic discoideum ד CRISPR טכנולוגיה עם פרוטוקול זה תרביות תאים26. הדור של המדריך מתאים, יחיד RNAs (sgRNAs) הוא פשוט יותר ומהירה יותר מאשר מחדש של המבנים הנוק-אאוט מוחלט. עבור כיוונים לעתיד, האפשרות של יצירת טוק מרובים-outs באמצעות CRISPR/Cas9 בשילוב עם פרוטוקול תרביות תאים זה מושך, עשוי לסלול את הדרך עבור חוקרים רבים בקהילה Dictyostelium . עם זאת, עבידות של המערכת הוקמה ביטוי ארעי משמש CRISPR/Cas9 axenic תאים בוגרים צריך בזהירות להיבדק.
Act5 טוק-אין המערכת הציג מציע מערכת אמינה ובטוחה אינטגרציה לדור של שורות תאים יציב ב discoideum ד, עם היתרון של אתרים דומים נוסדה בשנת אורגניזמים אחרים22. זה גם תלוי אירוע יחיד אינטגרציה הגנום, ומציע אפשרויות רבות עבור כיווני מחקר שונים. יזם act5 פעילה בחום ומבטיחה ביטוי הומוגנית כמעט27 עצמאית של התנאים הטיפוח. ניתן לשלב חלבונים כתב פלורסנט בקלות לוקוס זה מבטחים באמצעות של פלסמידים מיקוד מהונדסים. אפשרות זו שימושית, לדוגמה, למטרות מעקב תא, כפי שמוצג כאן ניסוי מיקס. התאים מראים השתנות מינימלית-לתא ביטוי, אשר יכול לסייע בתא אוטומטי מעקב. חשוב, החדרת רצף הרצוי לתוך מיקומה פועלים5 מופיע phenotypically נייטרלית28,29. כמו הביטוי אינו תלוי בסמן לבחירה כדי לשמור על ביטוי חלבון, כפי שניתן לראות integrants אקראית או שורות תאים וקטור מניבי extrachromosomal, מערכת act5 יכול להיות שימושי עבור חילוץ ניסויים, כמו גם. מאז הקווים תא הומוגנית, ניתן לנתח כל התאים. . זה לא אפשרי באמצעות פלסמיד extrachromosomal של הביטוי, בהם יש הטרוגניות ניכר בביטוי.
בנוסף שיפורים כלליים אלה עבור כל זנים, היכולת להשתמש הלא-axenic פראי-סוג תאים למחקר מולקולרית מאפשרת הערכה של ההשפעות של מוטציות שהצטברו זנים מעבדה העדכני. Rearrangements גנטי מרובים נמצאה מאז האימוץ של המתח Ax2 בשנת 1970, כפי שמוצג על ידי microarray שפורסמו בעבר ניתוחים26. סינתטי פנוטיפים שנצפו עקב הנוכחות של מוטציות אלו. לדוגמה, מוטנט שדווחה phg2 מציג אדהזיה ירד רקע זן אחד של מעבדה והצמדות מוגברת עוד3. נתונים סותרים כאלה עכשיו הקרניו לחזור על הניסוי בנימה אב קדמון משותף (במקרה זה, DdB). הכוח של גישה זו הוכח לאחרונה עבור30,רז GTPase קטן31.
היכולת לבצע ניסויים גנטיים בתוך כל זן discoideum ד מרחיב את הפוטנציאל של כיווני מחקר חדשים שתלויים השימוש מבודד פראי, ובפרט אלה מעורבים אבולוציה חברתית ותרבותית, זיהוי משפחה, מיניות מחזור22.

הסוג Dictyostelium הם אדמת-המגורים אמבה חברתית הניזונים בעיקר חיידקים. להציב שלקרוא Amoebozoa, מספר רב של מינים היה מבודד זה ניתן לקבץ ארבע clades שונים1. המין Dictyostelium discoideum (discoideum ד) הפך אורגניזם מודל פופולרי ללמוד תהליכים תאיים מורכבים כגון נדידת תאים ו- phagocytosis. כדי לשלוט לתקנן תנאים ניסיוני, axenic תא קווים פותחו מסוגלים לגדול מורכבים או מוגדר בינוני נוזלי בהיעדרו של חיידקים2. חשיבות מיוחדת Ax2, Ax3, Ax4 זנים, אשר היו כל שנוצרו בשנות ה-70, בסופו של דבר נגזר פרוע אחד לבודד NC43. כלים עבור הנדסה גנטית פותחו בזנים אלו axenic, וכתוצאה מכך הסתרה באמצעות הראשון שפורסם בשנת 19874,5. הפרוטוקולים היו נוספים שפותחו באופן מיטבי לשימוש תחת תנאים axenic6,7.
הסתגלות של פרוטוקולים אלה כדי פראי-סוג ד discoideum זנים שלא מסוגלים לגדול מרק נוזלי נוסו על ידי מספר מעבדות. עם זאת, זה לא הפך לגמרי מוצלח מאז הפרוטוקולים תרביות תאים מורכבים, חוסר יעילות, בין היתר בשל הקיבולת של החיידק לפעול כמו כיור עבור ריאגנטים סלקטיבי8,9. כתוצאה מכך, נתונים למעשה כל מולקולרית ד discoideum נובע צאצאי בידוד פראי-סוג יחיד. רצינו להתגבר על מגבלה זו ולפתח שיטה גנטית לשנות תאים discoideum ד עצמאית של היכולת שלהם גדלים במדיום נוזלי. ניתן להסביר את הצורך של השיטה על ידי התצפית כי היא ההנחה היתה בעבר מוטציות המאפשר צמיחה axenic היו בעיקר נייטרלי, לא לפגום פיזיולוגיה של התא. סברה נכונה רק בחלקה. באופן כללי, יש שני הבדלים בולטים; ראשית, בין השונה בודדו זנים axenic, ושנית, כאשר אלה זנים axenic לעומת מבודד פרא-axenic8,9.
אולי הגורם הקריטי ביותר הוא מפתח axenic הגן, גרזןB, שזוהה לאחרונה כמו RasGAP NF1. הפונקציה העיקרית של NF1 בתור RasGAP הוא לרסן את הפעילות ראס3. המחיקה של האנזים ב כל זני axenic מוביל עודף פעילות ראס בא לידי ביטוי בכינויו היווצרות של טלאים גדולים ראס הפעיל. הטלאים ראס מוגדלת לגרום להצטברות של PIP3 קרום הפלזמה. אלה כתמים המופיעים מקרי של PIP3 וראס פעיל הם תבנית להיווצרות קפלים מעגלית בסופו של דבר נסגר, מוביל את היווצרות של macropinosomes10. התוצאה היא עלייה מוגזמת macropinocytic פעילות. Macropinocytosis הוא תהליך מונחה אקטין. תחרות cytoskeletal מרכיבי היווצרות של macropinosomes או pseudopods היא התוצאה. השפעתה על התנהגות תא באה לידי ביטוי כמעט מוחלט למניעת כימוטקסיס של תאי צמח חומצה פולית11. המדבקות PIP3 מוגדל מסיבית הן מאוד עקשן. אפילו בתאים מורעבים, המדבקות PIP3 נשארים, יכול להתפרש בטעות כשייך pseudopods, אשר יכול לגרום לבעיות לפרש מחקרים על כימוטקסיס למחנה.
במקרים מסוימים, המוטציה NF1 שימושית השפעול. זה מוביל אותנו מניע השני לפיתוח שיטה תקנים עבור מבוגר bacterially discoideum ד תאים, מאז העלייה בשיעור macropinocytosis הופך תאים axenic יקר עבור חוקרים ההיבטים הבסיסיים של תהליך זה,12 . עם זאת, מוטציה בגנים הדרושים עבור macropinocytosis, כגון Ras ו- PI3-kinases10, יש כמעט ביטל צמיחה axenic, ולכן יש צורך לתפעל את התאים האלה דרך גידול על חיידקים. סיבה נוספת שמעבדת המבוססת על חיידקים transfections יקר היא השימוש הגובר Dictyostelids לחקור שאלות באבולוציה של13,cellularity מרובה14,15,זיהוי משפחה16, התנהגות הסלולר אלטרואיסטי, אשר תלויים בעיקר השימוש פראי-סוג טרי מבודד מבודד17. כל הזכיר שטחי מחקר ניתן להקל על ידי שיטות יעילות עבור הנדסה גנטית של מבודד פרא, אשר אי-axenic לא צומחים בתוך מרק נוזלי.
הפרוטוקולים שלנו מאפשרים להתגבר על המגבלות המתואר. יחדיו, את האפשרות של ביצוע מניפולציות גנטיות עם בקטריאלי גדל discoideum ד תאים חסימות הטבות עבור כל החוקרים Dictyostelium , אפילו אם זה רק מהירות מוגברת של תהליך הבחירה בשל מהר יותר הצמיחה של אמבה (4 שעות זמן ההכפלה) על חיידקים לעומת צמיחה בתקשורת axenic (10 h הכפלת זמן).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:820px;" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Equipment</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-400-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">12823252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EP6331000025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gene Pulser X Cell, including CE &#38; PC modules</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Safety Cabinet Foruna - SCANLAF</td>
			<td style="width:184px;">Labogene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BioPhotometer Plus</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CLSM 710</td>
			<td style="width:184px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Media &#38; Agaroses</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LoFlo Medium</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LF0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:184px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Low EEO Agarose</td>
			<td style="width:184px;">BioGene</td>
			<td style="width:119px;">300-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Purified Agar</td>
			<td style="width:184px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SM broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">SMB0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2x LB broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LBD0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Chemicals</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HEPES free acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">391340 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">P/4800/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">Na2HPO4 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2 * 6 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">5982 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">CaCl2 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">442909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KOH</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">26668.263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cultur Dishes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5</td>
			<td style="width:184px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:119px;">P50G-1.5-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Geneticin G418-sulphate</td>
			<td style="width:184px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hygromycin B Gold</td>
			<td style="width:184px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Additional Consumables</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2mm gap electroporation cuvettes, long electrode</td>
			<td style="width:184px;">Geneflow Limited</td>
			<td style="width:119px;">E6-0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10 &#181;l Inoculating Loop, Blue 10 Micro L</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">129399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Spreader, L-shaped, sterile</td>
			<td style="width:184px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">730190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Combitips advanced 5 ml</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf BIOPUR</td>
			<td style="width:119px;">30089669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Kits</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ZR Plasmid Miniprep Classic</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D4016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Quick DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zymoclean DNA Recovery Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Enzymes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0482L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td style="width:184px;">TakaraBio</td>
			<td style="width:119px;">R045A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria

Dictyostelium discoideum הוא אורגניזם מודל מסקרן לחקר תהליכי התמיינות תאים במהלך הפיתוח, התא איתות ושאלות ביולוגיה תאית חשובים אחרים. בטכנולוגיות הזמינות לתמרן גנטית Dictyostelium תאים הם מפותח. Transfections יכול להתבצע באמצעות סמנים שונים לבחירה, סמן מחדש רכיבה על אופניים, כולל רקומבינציה הומולוגית מוטגנזה מכוונת insertional. זה נתמך על ידי הגנום המבואר היטב. עם זאת, גישות אלה ממוטבים עבור שורות תאים axenic גדל בתרבויות נוזלי, קשה להחיל על תאים פראי-סוג הלא-axenic, אשר ניזונים רק חיידקים. מוטציות הנוכחים זנים axenic להפריע Ras איתות, גרימת macropinocytosis מוגזמת הדרושים עבור האכלה, ולפגוע נדידת תאים, אשר מבלבל את הפרשנות של אותות וניסויים כימוטקסיס של זנים אלה. ניסיונות קודמות לתמרן גנטית התאים הלא-axenic יש חסרה ויעילות ההליכים הנדרשים ניסיוני מורכבים. פיתחנו פרוטוקול תרביות תאים פשוטים זה, בפעם הראשונה, מתגבר על מגבלות אלה. אלה סדרה של שיפורים גדולים גנטיקה מולקולרית Dictyostelium מאפשרים פראי-סוג התאים להיות מתומרן כמו זנים מעבדה סטנדרטיים. בנוסף היתרונות לימוד תהליכי איתות, תנועתיות תקינה, מוטציות לשבש צמיחה מבוססי macropinocytosis עכשיו ניתן לבודד בקלות. יתר על כן, שזרימת העבודה כולו תרביות תאים מאוד מואץ, עם תאים רקומביננטי, כי יכול להיווצר בתוך ימים ולא שבועות. יתרון נוסף הוא כי הגנטיקה המולקולרית עוד יותר ניתן לבצע עם פראי-סוג טרי מבודד Dictyostelium דגימות מן הסביבה. זה יכול לעזור כדי להרחיב את היקף גישות בשימוש באזורים אלה מחקר.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

Dictyostelium discoideum הוא אורגניזם מודל פופולרי ללמוד תהליכים תאיים מורכבים כגון נדידת תאים, אנדוציטוזה ופיתוח. השירות של האורגניזם תלויה הכדאיות של הנדסה גנטית. כאן, אנו מציגים שיטות transfect תאים Dictyostelium discoideum להתגבר על המגבלות הקיימות של תאים culturing בתקשורת נוזלי.

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

הערך של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר כמעט כל זן של דיסקואידום dictyostelium להיות מניפולציה על ידי גנטיקה מולקולרית, ללא קשר אם זן זה יגדל axenically במדיום נוזלי או לא. היתרון השני של טכניקה זו הוא שהיא מהירה ופשוטה. יש לבצע חילוף של תאים עם פלסמיד אקסוכרומוזומלי לפני שמתחילים לערבב דיקטיוסטליום.התוצאות כבר ניתן לאמת יומיים לאחר transfection באמצעות מיקרוסקופיה. זה יוצא דופן לעבוד עם תאי דיסטיוסטליום והשעיית חיידקים. הדמיה תעזור לתת לנסיינים מושג כיצד מבוצעים השלבים השונים של הפרוטוקולים.הדגמת ההליך איתי תהיה סודבה אימניקיה, פוסט-דוק מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להכין 1000 מיליליטר של חיץ סורנסן עובד פתרון עבודה עם מגנזיום כלורי סידן כלורי על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, השתמש במושבה אחת של K aerogenes כדי לחסן ליטר אחד של מדיום LB.אפשר לחיידקים לגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. לסובב את התאים למטה בשני צינורות צנטריפוגה 500 מיליליטר כדי לקצור את התאים. לאחר מכן, לשטוף את החיידקים פעם אחת עם 500 מיליליטר של חיץ.תן שימוש חוזר לכדור ב-20 מיליליטר של חיץ. השתמש photometer כדי לבדוק את הצפיפות האופטית של המדגם לדלל את המדגם עם חיץ עד הצפיפות האופטית היא כ 100. לאחר מכן, הכן את מאגר האלקטרופולציה H40 בהתאם לפרוטוקול הטקסט.לגדל K aerogenes כדי לאנסף אמצעי SM לילה בטמפרטורת החדר. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של מתלים חיידקיים לצלחת אגר SM ומפיצים אותה באופן שווה. לאחר מכן, לקחת לולאה סטרילית לחסן אותו עם תאים דיקטיוסטליום ולהפיץ את התאים בקצה אחד של הצלחת.הדגירה את הצלחת ב 22 מעלות צלזיוס במשך יומיים, כדי להבטיח את אזורי הצמיחה גדולים מספיק עבור transfection. הוסיפו 10 מיליליטר של השעיית K aerogene לצלחת פטרי שטופלה בתרבות רקמה של 10 ס"מ. לאחר מכן, השתמש בלולאת חיסון חד פעמית 10 microliter כדי לגרד תאים אזורי הצמיחה של צלחת התרבות.העבר את התאים לצינור 1.5 מיליליטר, המכיל חיץ H40 קר כקרח. סובב את התאים לשתי שניות בכבידה של פי 10000. לאחר מכן, השלך את העל-טבעי והתן מחדש את התאים במאגר H40.לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של התאים לצינור המכיל אחד עד שני מיקרוגרם של DNA. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ולהעביר את תערובת הדנ"א של התאים לקעת אלקטרופורציה מצוננת מראש. אין להוסיף יותר משני מיקרוגרם דנ"א.ריכוז דנ"א גבוה יותר רעיל לתאים ומפחית את היעילות. לאחר אלקטרופורציה, מיד להעביר את התאים לצלחת פטרי מוכן 10 ס"מ ולאפשר לתאים להתאושש במשך חמש שעות. כדי לבחור transfectant עבור נוקאאוט, נוק-אין, או מעשה חמש לדפוק ב, לנתק את התאים מן צלחת פטרי על ידי צינור נוזל על פני השטח.לאחר מכן, הגדר שלושה דילולים של הסוכן הסלקטיבי על פי פרוטוקול הטקסט. לבסוף, להפיץ 150 microliters של דילול מוכן לתוך כל באר של 96 גם שטוח למטה רקמות צלחות תרבות. בפרוטוקול זה, הוכחה מערכת פלסמיד חוץ-כרומוזומלית של כתב כפול.32 שעות לאחר ההיתוך, רוב התאים הביעו שני חלבוני היתוך פלואורסצנטיים. כמו כן נוסו נוקאאוט דובדבנים של מערכה 5 M ו-NC4. שתי להקות הושגו לאחר הפעלת העיכול על ג'ל אגרוז.רצועת זוג הבסיס 4127 מכילה את המבנה הרצוי. הדנ"א המטוהר שימש להתרה של תאי NC4. שני שיבוטים של ההמרה NC4 נותחו באמצעות PCR ושניהם הראו את דפוסי הלהקה החזויים.כתם דרומי שימש אז כדי לאמת את התוצאות של PCR. NC4 גדל מהר יותר על מדשאות חיידקים מאשר תאים Ax2. לאחר ארבע שעות, יותר של תאים NC4 הצליחו לזחול מתחת agarose מאשר תאים Ax2.תאי ה-NC4 היו מהירים יותר והראו תגובה כימוטקטית חזקה יותר לאפולאט מאשר לתאי ה-Ax2. השתמש תמיד בתאים מצלחות SM שהגדירו זה את זה. לעולם אל תשתמש בתאים מעל ארבעה ימים, אחרת היעילות תרד.זני HAP לבנים ומבודדים טריים משמשים בדרך כלל לטיפול בשאלות הנוגעות להתנהגות רועמת או חברתית של דיקסטיוסטליום. שלנו מאפשר ליישם גנטיקה מולקולרית דרך מבודדים אלה.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

עיצוב ושימוש בעלות נמוכה, אוטומטי Morbidostat עבור Adaptive אבולוציה מהירה של חיידקים תחת אנטיביוטי והתרופות בחירה

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

ניתוחים פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה משימוש במסד הנתונים OpenProt לחשוף את הרומן חלבונים מתורגם ממסגרות קאנונית קריאה פתוחה

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...