Name: genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00
Duration: 6 min 8 s
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저자가이 방법에 대 한 입력에 대 한 케이 연구소와는 LMB 현미경 흐름 cytometry 시설과 우수한 과학 및 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품은 의료 연구 위원회 그랜트 MC_U105115237 R. R. 케이, BBSRC (생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회)를 부여 BB/K009699/1 R. R. 케이 의해 투자 되었다, 암 연구 영국 R. H. Insall, Wellcome 신뢰 수석 친목을 A15672 부여 202867/Z/16/Z 조나단 R 첩, 및 MRC UCL에서 MRC LMCB 대학 단위 (MC_U12266B)을 자금.

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저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

비 axenic, 야생-타입 Dictyostelium 세포를 사용 하 여 분자 연구에 지금까지 매우 제한 되었습니다. 이러한 긴장의 유전 공학에 대 한 사용할 수 있는 방법을 신뢰성과 효율23, 그들의 일반적인 채용 방지 부족 있다. 액체 매체에서 성장 능력의 독립적인 어떤 디 discoideum 긴장에 대 한 생성 된 자료와 여기에 제시 된 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 그것은이 프로토콜 NC4 파생 셀 라인에 대 한 최적화는 언급 되어야 합니다. 우리가 전에 관찰 하 고 V12M2 및 WS21628,9여기에 표시 됩니다 야생에서 갓 고립 된 긴장에 대 한 transfection 효율 NC4에서 다. Electroporation 조건 특히 transfection 효율성에 상당한 영향을 미칠 것이 고 약간 긴장에 대 한 최적화 더 필요할 수 있습니다. 일반적으로, transfectants의 충분 한 양은 보여주는이 메서드는 실행할 수 있는 지금까지 테스트 모든 긴장에서 관찰 되었습니다. 긍정적인 transfectants NC4 파생 된 종자를 사용 하 여 얻을 수 다른 비 axenic 야생-타입 긴장 하지만 모든 경우에 비해 높은, transfectants의 충분 한 숫자 추가 실험에 대 한 있도록 얻습니다. 플러스, 우리의 프로토콜의 단순은 이전 시도8,9에 비해 주요 개선 이다.
이러한 새로운 비-axenic 프로토콜 모든 표준 유전 절차를 커버 하 고 transfections 수 있습니다 신속 하 고 효율적으로 동시에 수행할 수 있기 때문에 더 이점은 추가 합니다. 긍정적인 복제품은 성장 박테리아 반쪽에 사단 시간 이후 주, 보다는 오히려 일에 얻어질 수 있다. 새로 설립된 된 플라스 미드는 또한 axenic 조건 하에서 작동 하 고 수 있습니다 일상적으로 사용 모두 성장 조건 하에서이 methology22의 또 다른 발전은. 프로토콜에 도입, 플라스 미드 박테리아에 선택에 사용 되는 transfection의 성공에 대 한 중요 한 특별 한 요구 사항이 있다. 특히, 식 및 저항 카세트를 운전 하는 발기인은 성공적인 transfection 중요 합니다. 구동 저항 또는 식 카세트 자주 사용된 act6 (걸 6) 발기인24 세포는 박테리아에 성장 될 때 효율성을 결여 된다. 플라스 미드 시스템에서 높은 활성 act15 (말라 15) 발기인 드라이브 모든 식 카세트, 저항 카세트 coA (coactosin A) 발기인, 모두는 axenic 조건 및 활성의 통제는 성장 박테리아에 셀입니다. 노크에 뿐만 아니라 리포터의 표현에 대 한 요구 사항을 생성 하 고 노크 아웃 구문 그것 우리의 플라스 미드 레 퍼 토리를 사용 해야 하지만 불행히도 이미 만든 비효율적인 act6 발기인을 사용 하는 벡터의 사용을 제한.
모터 효율성은 정확한 genomic 소재 시에 단일 통합 이벤트에 의존 하는 transfections에 대 한 특히 중요 합니다. 저항 유전자 발현을 운전 하는 발기인의 우리의 개선으로 인해 충분 한 저항 단백질 단일 로커 스 통합에서 생산 됩니다. 주요 관심사 때 hygromycin 또는 G418 설명 된 대로 사용 하 여 게놈에 여러 통합의 선호 했다. 여러 통합의 애 용 관찰 되었습니다 지금까지 이전 G418 선택 이전 발기인 시스템25를 사용 하 여에 대 한 보고. 즉 모두 hygromycin G418 있으며 적당 한 선택 가능한 마커 깨끗 한 노크-아웃 및 노크 기능 생성에 대 한 불행히도, 선택 가능한 마커 blasticidin axenic 비 조건에서 작동 하지 않습니다. 이것은 우리의 방법의 주요 불리 blasticidin 저항 카세트는 정기적으로 디 discoideum에 노크 아웃 구문을 생성 하는 데 사용 됩니다. Blasticidin 저항 카세트와 이미 생성 된 구문을 실행할 수 있는 선택 가능한 마커 중 하나를 사용 하 여 rederived 될 필요 합니다. 이 제한을 극복 하기 위해 또 다른 가능성은 최근에 설립 된 axenic D. discoideum CRISPR 결합이 transfection 프로토콜26기술. 적당 한, 단일 가이드 RNAs (sgRNAs)의 생성은 간단 하 고 완전 한 노크 아웃 구문의 재건 보다 빠르게. 미래 방향, 가능성에 대 한 다중 노크 아웃 생성의 CRISPR/Cas9 결합이 transfection 프로토콜을 사용 하 여 매력적 이며 Dictyostelium 지역 사회에서 많은 연구원을 위한 길을 닦은 수 있습니다. 그러나, CRISPR/Cas9 axenic 재배 셀에 사용 되는 설립된 과도 식 시스템의 가공은 신중 하 게 시험 되어야 한다.
시스템에서 노크 act5 제시 유사 사이트에 다른 유기 체22설립의 D. discoideum 에서 안정적인 셀 라인의 세대에 대 한 안정적이 고 안전한 통합 시스템을 제공 합니다. 그것은 또한 그리고 게놈에 있는 단일 통합 이벤트에 따라 다른 연구 방향에 대 한 많은 가능성을 제공 합니다. Act5 발기인 강력 하 게 활성화 하 고 거의 균일 식27 재배 조건의 독립 보장. 형광 기자 단백질 설계 대상 플라스 미드를 사용 하 여이 안전한 피난처 로커 스에 쉽게 통합 될 수 있습니다. 이 유용할 수 있습니다, 예를 들어 셀 추적 목적을 위해 혼합 실험에서 그림과 같이. 셀 표시 최소 셀 식 가변성, 추적 하는 자동화 된 셀에는 도움을 줄 수 있습니다. 중요 한 것은, 5 행동궤적으로 원하는 시퀀스의 삽입 phenotypically 중립28,29나타납니다. 로 식 임의의 integrants 또는 extrachromosomal 벡터 베어링 셀 라인에서 보듯이 단백질 식이 유지 하기 위해 선택 가능한 표식에 의존 하지 않는, act5 시스템 구조 실험을 위해 유용할 수 있습니다. 셀 라인 균질 성 때문에, 모든 세포를 분석할 수 있습니다. 이것에 상당한이 질 식에서 식에 대 한 extrachromosomal 플라스 미드를 사용 하 여 불가능 합니다.
모든 변종에 대 한 이러한 일반적인 개선 뿐만 아니라 분자 연구에 대 한 비 axenic 야생-타입 셀을 사용할 수는 현재 실험실 긴장에 축적 된 돌연변이의 효과의 평가 수 있습니다. 이전에 게시 microarray 분석26여 같이 여러 유전자 재배열 1970 년에, Ax2 스트레인의 채택 이후 발견 되었습니다. 합성 고기 이러한 변이의 존재 때문에 관찰 된다. 예를 들어 보고 phg2 돌연변이 한 실험실 긴장 배경 및 다른3에 증가 접착 줄된 접착을 보여줍니다. 이러한 충돌 데이터 (이 경우, DdB)에서 일반적인 조상 스트레인에 실험을 반복 하 여 이제 해결할 수 있습니다. 이 접근 방법의 강도 최근 작은 GTPase RasS30,31표시 되었습니다.
어떤 디 discoideum 긴장에서 유전자 실험을 수행 하는 능력 특히 그 사회 진화, 킨 인식과 성적 사이클22사건 야생 격리의 사용에 의존 하는 새로운 연구 방향의 잠재력을 확장 합니다.

Dictyostelium 속은 주로 박테리아에 피드 토양 생활 사회 아메바. 문 Amoebozoa에에서 배치 되 고, 많은 종 고립 되어가 4 개의 다른 clades1로 그룹화 할 수 있습니다. 종 Dictyostelium discoideum (D. discoideum) 먹어서 셀 마이그레이션 등 복잡 한 세포질 과정을 공부 하는 인기 모델 유기 체 되고있다. 제어 하 고 표준화 실험 조건, 박테리아2의 부재에 복잡 하거나 정의 된 액체 매체에서 성장할 수 있다 axenic 셀 라인 개발 되었습니다. 특별 한 중요성의 Ax2, Ax3, 그리고 Ax4 종자를 모두 1970 년대에 생성 된 단일 야생에서 궁극적으로 파생 된 격리 NC43. 유전 공학에 대 한 도구는 결과 19874,5에서 첫 번째 게시 된 녹아웃에이 axenic 긴장에서 개발 되었다. 프로토콜 추가 개발 하 고 axenic 조건6,7에서 사용 하기 위해 최적화 되었다.
적응 야생-타입 디 discoideum 에 이러한 프로토콜 변종 액체 국물에서 성장할 수 있는 여러 실험실에 의해 시도 되었습니다. 그러나이 되지 완전히 성공적인 transfection 프로토콜 복잡 한 박테리아의 용량 선택 시 약8,9에 대 한 싱크 역할을 때문에 효율성 부족 때문. 그 결과, D. discoideum 에 기본적으로 모든 분자 데이터 단일 야생-타입 분리의 자손에서 온다. 우리가이 한계를 극복 하 고 유전자 액체 매체에서 성장 하는 그들의 능력의 독립적인 D. discoideum 셀을 수정 하는 방법을 개발 싶 었 어 요. 그러한 방법에 대 한 필요 axenic 확장할 수 변이 주로 중립 이었던 과거에 생각 했다을 세포 생리학을 손상 하지 않았다 관찰 설명할 수 있습니다. 이 가정은 단지 부분적으로 정확. 일반적으로, 거기 두 가지 주목할 만한 차이점이; 첫째, 다른 사이 고립 된 axenic 긴장, 및 두 번째 때 이러한 axenic 변종 비 axenic 야생 격리8,9와 비교 됩니다.
아마도 가장 중요 한 요소가 이다 주요 axenic 유전자, 도끼B, RasGAP n f 1로 최근 확인 했다. Ras 활동3를 억제 하는 RasGAP으로 n f 1의 주요 기능이입니다. 모든 axenic 긴장에서 효소의 삭제 큰 활성 Ras 패치 형성으로 서 각 성 하는 과도 한 Ras 활동 이끌어 낸다. 이러한 확대 Ras 패치 원형질 막에 PIP3의 축적으로 이어질. PIP3 및 활성 Ras의 동시적인 나타나는 패치는 결국 닫히고 macropinosomes10의 형성에 이르게 하는 원형 주름의 형성에 대 한 서식 파일. 결과는 macropinocytic 활동에 과도 한 증가 이다. Macropinocytosis는 말라 기반 프로세스입니다. Macropinosomes 또는 pseudopods의 형성에 대 한 cytoskeletal 구성 요소에 대 한 경쟁 결과입니다. 셀 행동에 미치는 영향 folate11식물 세포의 chemotaxis의 거의 완전 한 예방에 반영 됩니다. 대규모 확대 PIP3 패치는 아주 영구 있습니다. 굶 어 셀 에서도 PIP3 패치 남아 있으며 pseudopods, 캠프 chemotaxis에 대 한 연구를 해석 하는 문제가 발생할 수 있습니다으로 잘못 해석 될 수 있다.
경우에 따라 n f 1 돌연변이 실험적으로 유용 합니다. 이것은 우리가 bacterially 성장된 디 discoideum transfection 방법 개발에 대 한 두 번째 동기 부여 세포, axenic 세포 macropinocytosis 속도 있는 증가 게 유용한이 과정12의 근본적인 측면을 조사 하 고 이후 . 그러나, macropinocytosis, Ras 및 PI3 kinases10, 등에 필요한 유전자에 있는 돌연변이 박테리아에 성장을 통해 이러한 세포를 조작 하는 데 필요한 그것을 만드는 axenic 성장을 폐지 거의 있다. 귀중 한 박테리아 기반 transfections를 렌더링 하는 또 다른 이유는 멀티 cellularity13,14, 친척 인식15,16, 진화에서 질문을 탐구 하는 Dictyostelids의 사용 증가 그리고 주로 갓 격리 된 야생-타입의 사용에 의존 하는 타 적인 세포 행동 격리17. 모든 연구 분야는 비 axenic 액체 국물에서 성장 하지 않습니다 야생 격리의 유전자 조작에 대 한 효율적인 방법으로 촉진 될 수 있다 언급 했다.
우리의 프로토콜 설명된 한계의 극복을 위한 수 있습니다. 합쳐, 그것으로 인해 선택 과정의 단지 증가 속도 빠릅니다 경우에 디 discoideum 셀 보유 혜택 모든 Dictyostelium 연구원, 대 한 성장 하는 박테리아와 유전자 조작의 가능성 axenic 미디어 (10 h)에 시간을 두 배로 성장에 비해 박테리아에 아메바 (4 h 배로 시간)의 성장.

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		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">12823252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EP6331000025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gene Pulser X Cell, including CE &#38; PC modules</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Safety Cabinet Foruna - SCANLAF</td>
			<td style="width:184px;">Labogene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BioPhotometer Plus</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CLSM 710</td>
			<td style="width:184px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Media &#38; Agaroses</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LoFlo Medium</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LF0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:184px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Low EEO Agarose</td>
			<td style="width:184px;">BioGene</td>
			<td style="width:119px;">300-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Purified Agar</td>
			<td style="width:184px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SM broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">SMB0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2x LB broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LBD0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Chemicals</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HEPES free acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">391340 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">P/4800/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">Na2HPO4 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2 * 6 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">5982 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">CaCl2 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">442909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KOH</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">26668.263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cultur Dishes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5</td>
			<td style="width:184px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:119px;">P50G-1.5-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Geneticin G418-sulphate</td>
			<td style="width:184px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hygromycin B Gold</td>
			<td style="width:184px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Additional Consumables</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2mm gap electroporation cuvettes, long electrode</td>
			<td style="width:184px;">Geneflow Limited</td>
			<td style="width:119px;">E6-0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10 &#181;l Inoculating Loop, Blue 10 Micro L</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">129399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Spreader, L-shaped, sterile</td>
			<td style="width:184px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">730190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Combitips advanced 5 ml</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf BIOPUR</td>
			<td style="width:119px;">30089669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Kits</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ZR Plasmid Miniprep Classic</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D4016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Quick DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zymoclean DNA Recovery Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Enzymes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0482L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td style="width:184px;">TakaraBio</td>
			<td style="width:119px;">R045A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria

Dictyostelium discoideum 개발, 세포 신호, 및 다른 중요 한 세포 생물학 질문 중 세포 분화 과정의 연구에 대 한 흥미로운 모델 유기 체 이다. Dictyostelium 세포를 유전자 조작에 사용할 수 있는 기술 개발은. Transfections는 다른 선택 가능한 마커 및 마커 다시 사이클링, 동종 재결합 하 고 insertional mutagenesis 포함을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 잘 주석 게놈에 의해 지원 됩니다. 그러나, 이러한 접근 axenic 셀 라인 액체 문화에서 성장에 대 한 최적화 하 고 박테리아에만 먹이 비 axenic 야생-타입 셀에 적용 하기 어려운. Axenic 긴장에 있는 변이 Ras 신호, 수 유에 필요한 과도 한 macropinocytosis를 일으키는 방해 하 고 손상 세포 마이그레이션, 신호 변환 및 그 변종에 chemotaxis 실험의 해석을 혼동 한다. 이전 비 axenic 세포를 유전자 조작 하려고 효율과 필요한 복잡 한 실험 절차 부족 했습니다. 우리는 처음으로 이러한 한계를 극복 하는 간단한 transfection 프로토콜을 개발 했습니다. Dictyostelium 분자 유전학에 큰 개선의 그 시리즈 야생-타입 표준 실험실 긴장으로 쉽게 조작할 수를 셀 수 있습니다. 손상 되지 않은 신호 및 운동 성 프로세스를 공부에 대 한 장점 이외에 macropinocytosis 기반 성장 방해 돌연변이 이제 쉽게 격리 수 있습니다. 또한, 전체 transfection 워크플로 크게 가속, 일 보다는 오히려 주에 생성 될 수 있는 재조합 세포. 또 다른 장점은 분자 유전학 더 갓 격리 된 야생-타입 Dictyostelium 샘플 환경에서 수행할 수 있습니다. 이 연구 분야에서 사용 하는 방법의 범위를 확장 시킬 수 있습니다.

Extrachromosomal 플라스 미드 기자 연구, 셀 또는 돌연변이 세포의 세포질 구조에 변경 내 특정 단백질의 지 방화를 식별 하는 데 사용 됩니다. 세포 주기의 모니터링 등 많은 방법을 동시에 두 기자를 표현 하기 위해 중요 하다. 이것은 지금 우리의 듀얼 기자 extrachromosomal 플라스 미드 시스템 (표 1)를 사용 하 여입니다. 하루에 1, 5 h (그림 1) 후 선택 가능한 마커 G418를 추가 하기 전에 셀 페 했다. 예, NC4, DdB, Ax2, 및 독립적으로 파생된 야생 격리 V12M2 및 WS2162 (보충 표 1) microtubules 및 mCherry-PCNA, 즉 단백질 마커 GFP TubulinA에 인코딩하는 플라스 미드 pPI289와 페 했다 세포 주기 (그림 2A) 모니터링을 위해 사용. 32 h 후 세포는 현미경 관찰 되었다. 대부분의 세포 표현 모두 형광 표시 된 융해 단백질 일관 이전으로 보고 그 표현의 동일한 플라스 미드 쇼 유사한 식 수준에서 두 기자 두 개의 다른 플라스 미드 를 사용 하는 경우는 거의 불가능 하다 18,19. 대표 셀 각 셀 라인 (NC4, DdB, Ax2, V12M2, 및 WS2162) 원하는 듀얼 기자 표현 그림 2B에 표시 됩니다. Transfection 효율 그림2 C에 요약 되어 있습니다. NC4 파생 셀 라인 최고의 transfection 효율을 보여줍니다. 그러나, 셀 라인 V12M2 및 WS2162, transfectants의 상당히 높은 수 얻은 했다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig2.jpg"> 그림 2 : Extrachromosomal 플라스 미드의 식. (A) Extrachromosomal 플라스 미드 원형 형태로 직접 페는. 예를 들어, 듀얼 기자 pPI289 표시 됩니다. NgoMIV 사이트의 두 번째 기자 extrachromosomal 식 플라스 미드에 삽입을 나타냅니다. (B) Z-프로젝션 GFP-TubulinA (세포질)와 mCherry-PCNA (주로 핵) 5 개의 서로 다른 야생-타입 셀 라인 사용 (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162)에 대 한 대표적인 셀의. (B)에서 그림 5 셀 라인 (C)는 transfection 효율 계산 했다. 표시 된 두 실험의 의미가 이다. 오차 막대 표시 ± sd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
지정 된 genomic 소재 시에 대상 벡터의 통합 더 도전 이며 생성 된 셀 라인의 더 주의 깊은 분석이 필요 합니다. 그림 3에서는 act5mCherry NC4에 기를 시도 합니다. 첫째, 플라스 미드 transfection 다음 재결합 사건의 빈도를 늘릴 오는지 해야 합니다. 이 위해, 플라스 미드 pDM1514 NgoMIV를 잘라입니다. 2 개의 악대는 agarose 젤에 다이제스트를 실행 한 후 얻을 수 있습니다. 4127 bp 밴드는 원하는 구문을 (그림 3)에 포함 되어 있습니다. Transfection, 소화 DNA 및 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여 정화 젤에서 추출 해야 합니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig3.jpg"> 그림 3 : Transfection act5 노크 및 DNA의 준비. 5 행동노크에는의 사용의 예를 들어 플라스 미드 pDM1514 표시 됩니다. 준비 하는 단계는 다음과 같이 나열 됩니다. (A) 지정 된 NgoMIV 사이트를 사용 하 여 플라스 미드를 선형화 electroporation, 전에. (B, C) 두 예상된 밴드는 제대로 분리 될 때까지 agarose 젤에 컷된 플라스 미드를 실행 합니다. 재결합 팔, mCherry, 그리고 저항-카세트, 4127 bp 밴드를 잘라 하 고 DNA를 추출 하는 젤. DNA는 이제 transfection에 대 한 준비가 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
순화 된 DNA NC4 세포의 transfection 사용 되었다. 5-6 일 후 선택, 클론 획득 했다. 여러 act5 노크 시도 대 한 긍정적인 확인 된 클론의 양과 대표 transfection 효율 표 3에 요약 되어 있습니다. NC4 transfection의 두 클론 선택 무작위로 되었고 PCR(그림 4)에 의해 분석 그리고 둘 다 보여주었다 예측된 밴드 패턴 노크에서의 예상 및 단일 통합 되도록 남쪽 오 점 분석 검증 추가 했다 게놈20로 구성의 이벤트. 오 점 원하는 act5 로커 스 (그림 4B)에 명확한 단일 통합을 보여 줍니다. 생성 된 NC4::act5 mCherry 셀 라인 이제 실험에 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig4.jpg"> 그림 4 : Act5-mCherry NC4에 KIs의 유효성 검사. (A) 및 제어 PCRs act5 로커 스에 긍정적인 통합의 유효성 검사에 대 한. 표시 된 뇌관은 두 개의 독립적인 클론 부모를 분석 하 사용 되었다. 두 클론 부모의 스트레인에 존재 하지 않는 저항-카세트 및 다운스트림 (P1) 또는 업스트림 뇌관 (P2)에 대 한 예상된 밴드를 표시 합니다. 뇌관 조합 (P1/P2) act5 로커 스에 mCherry 및 저항 카세트의 올바른 통합을 확인합니다. 야생-타입 NC4 두 기 클론이이 밴드를 부족 하 고 대신 큰 1400 기본적인 쌍에 대 한 PCR 제품을 표시 하는 동안 예상된 2800 bp 밴드를 보여줍니다. 사용된 제한 다이제스트 및 남쪽 오 점 (B) 체계. 5 행동로커 스 구성의 통합의 결과, 특히 추가 Bclhygromycin 저항 카세트에 사이트 모두 노크 클론 보여 작은 3400 bp 밴드. 야생-타입 컨트롤 쇼 두 다운스트림 위치 Bcl에서 발생 예상된 5.8 kb 사이트. 오 점 자른 고 선명도 대 한 접합. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>act5 로커 스에 대상된 구성</td>
			<td>플라스 미드 이름</td>
			<td>점령된 우물의 수</td>
			<td>선택 된 클론의 수</td>
			<td>긍정적인 복제품</td>
			<td>올바른 클론 (%)</td>
			<td>Dictyostelium 변형 사용</td>
			<td>transfection 효율 (transfectants / 2 x 10 ^6/1 µ g의 DNA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-mCherry</td>
			<td>pPI226</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>14.2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-GFP</td>
			<td>pPI227</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>5</td>
			<td>41.6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>6 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>66.6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>66</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td>55.5</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.3 x 10 ^-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>221</td>
			<td>12</td>
			<td>10</td>
			<td>83.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.1 x 10 ^-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>85.7</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>70</td>
			<td>DdB</td>
			<td>5 x 10 ^-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>240</td>
			<td>12</td>
			<td>11</td>
			<td>91.6</td>
			<td>DdB</td>
			<td>1.2 x 10 ^-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>320</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>100</td>
			<td>NC4</td>
			<td>1.6 x 10 ^-4</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3:의 양과 Transfection 효율의 세대에 대 한 긍정적인 transfectants을 얻은 act5 다른 변형 배경에서 KIs 22 .
5 행동로커 스 통합된 기자21의 상대적으로 균질 성 표현을 제공합니다. 생성 된 NC4::act5 mCherry 셀 혼합 실험을 다른 act5 노크 기능 GFP 등 다른 형광 단백질을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 시스템의 가장 큰 장점은 강조 Ax2::act5 GFP 와 혼합 실험 표시 됩니다. 비 axenic 야생-타입 셀 transfect에 무 능력 때문에이 종류의 접근 전에 수행 되지 수 없습니다. 그들은 다른 세포 라인 동일 실험 조건 발생 사이 직접적인 비교를 허용 하기 때문에 혼합 실험 셀 동작 분석을 중요 한 도구입니다. NC4 셀 Ax2 셀 (그림 5A) 보다 세균 잔디에 빨리 성장 한다. 이 phagocytose 박테리아 또는 이동 하 고 식량을 향해 chemotaxis를 표시 향상 된 능력을 더 높은 용량이 원인일 수 있습니다. -한 천 엽 산 chemotaxis 분석 결과 사용 하 여, NC4::act5-mCherry 및 Ax2::act5 GFP 의 인구의 직접 비교 수행 되었다, NC4::act5-mCherry 는 훨씬 더 효율적인 folate 감지에 보여주는. 4 h 후 NC4::act5 mCherry 셀 agarose Ax2::act5 GFP 셀 (그림 5B) 보다 아래에 크롤 링을 수 있었다. Chemotaxis는 agarose에서 마이그레이션 셀의 표준 통계 분석 밝혔다 NC4::act5 mCherry 셀 빨리 했다 Ax2::act5 GFP 셀 (그림 5C-E 보다 강한 혈 응답을 보여주었다 ).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig5.jpg"> 그림 5 : 5 행동KIs를 사용 하 여 이미지 기반 chemotaxis 믹스 실험. (A) NC4::act5 mCherry 그리고 Ax2::act5 GFP 표현 행동5 로커 스에서 표시 된 형광 단백질 세균성 잔디에 성장 하는 능력에 대 한 분석 했다. 4 일 후 독방 도금된 Dictyostelium 세포에서 발현 패 직경 측정 되었다. 비 axenic act5:: NC4 셀 만들기 axenic Ax2::act5 GFP 세포 보다 훨씬 더 큰 플 라크 (± SD, 의미 * * * p < 0.0001, n = 3, 5 mm 바 확장). (B) 아래 agarose folate chemotaxis의 사용22 NC4::act5-mCherry Ax2::act5-GFP (a) 사용의 혈 능력을 직접 비교 분석 결과, 위해 박테리아 amoebae 두 종자의 성장 했다 혼합 50: 50 비율. 세포는 agarose 아래에 크롤 링을 허용 되었다. 4 h, 후 엽 산 그라디언트를 마이그레이션 했다 셀 confocal 현미경을 사용 하 여 몇 군데 있었다. NC4::act5-mCherry 및 Ax2::act5 GFP 셀 수 다음 결정 했다. NC4::act5-mCherry 셀 folate를 감지에 더 효율적 이었다. 10 더 많은 NC4::act5 mCherry 에 대 한 셀 Ax2::act5 GFP 셀에 비해 발견 했다 (± SD, 의미 * * * p < 0.0001, n = 6, 눈금 막대 100 µ m). (C, D) 세포는 60 분 동안 촬영 되었다 하 고 그들의 속도 혈 인덱스 계산 했다. (만 그는 agarose에서 마이그레이션) 가장 chemotactically 반응 셀의 사전 선택, 후 Ax2::act5 GFP 세포 셀 속도 chemotaxis에 대 한 낮은 값을 보였다. 셀 라인 당 50 셀 분석 되었다. (평균 ± SD, * p < 0.01, n = 3). (E) NC4::act5 mCherry Ax2::act5 GFPact5 노크 ins의 트랙 60 분 이상, NC4::act5-mCherry 세포의 chemoattractent 소스 쪽으로 더 감독된 움직임을 보여주는 플롯 (평균 ± SD, * * * p < 0.0001, n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
Act5 노크 셀 라인 cytometry에 사용할 수 있습니다. 성장 박테리아에, 것과 같이 axenic 긴장과 비 axenic 야생-종류 사이 개발에 주요 다름이 있다. 개발 후 NC4 셀의 fruiting 몸은 대략 두번 그 만큼 큰 Ax2 셀에서 파생 된. 셀 혼합 되 면, 중간 크기의 fruiting 몸은 얻은 것입니다. 두 셀 라인의 기여를 더 양적 분석, cytometry 사용 되었다. 이러한 분석 두 셀 라인에서 공헌의 다른 수준 때문에 중간 크기의 fruiting 시체는 명확 하 게 보여주었다. NC4::act5 mCherry 셀 측정된 포자의 약 75%를 하는 동안, Ax2::act5 GFP 공개 비 axenic 긴장 (그림 6)에 대 한 잠재적인 피트 니스 이용만 25%에 기여. 분석은 줄기 세포 인구를 모니터링 하지 않습니다, 때문에 개발 Ax2 NC4 사이 불균형을 설명 하기 위해 두 가지 가능성이 있다. 1 개의 가능성은 Ax2 셀 스 포어 세포 인구를 입력 하는 것 보다는 줄기 세포 인구에 주로 기여. 또는, 더 NC4 셀 Ax2 상대적으로 지연 된 개발 주기를 입력할 수 있습니다 그리고 그들은 따라서 fruiting 바디의 조립에 기여할 수 있습니다. 비 axenic 야생-타입 셀 transfect 가능성 더 다른 접근을 개발 하 고 실험 절차 간소화.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig6.jpg"> 그림 6: 법5 KIs cytometry 사용 하 여 혼합 실험의 분석 수. (A) NC4::act5 mCherry 및 Ax2::act5 GFP 별도로 또는 비 양분 한 천 배지에서 50: 50 혼합물에서 개발 되었다. NC4::act5-mCherry 셀 Ax2::act5 GFP보다 큰 fruiting 시체를 형성합니다. 믹스 대신 표시는 중간 크기 (5mm 바 스케일). 공초점 형광 가벼운 현미경 검사 법 혼합에서 파생 된 포자 머리에 NC4::act5-mCherry 포자의 더 높은 금액을 제안 합니다. (B)이이 관찰, (a) 혼합 실험에서 cytometry에 의해 분석 되었다 수확 포자에서 포자의 양을 계량. 포자의 약 75% Ax2::act5 GFP 셀에서 25%만 NC4::act5 mCherry 세포에서 유래. 대표적인 유통 흐름 cytometry 분산형에 표시 된 두 셀 라인에서 포자의 (C). 약 0.05% 보여 긍정적인 mCherry 및 GFP 신호, 제안 parasexual 퓨전 프로세스 발생 했 나 포자 서로 숨어 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>셀 라인</td>
			<td>유전자 배경</td>
			<td>참조 번호</td>
			<td>전에 게시</td>
			<td>유형</td>
		</tr>
<tr>
<td>AX2 (카)</td>
			<td></td>
			<td>DBS0235521</td>
			<td>블 룸 필드 외., 2008</td>
			<td>야생 타입</td>
		</tr>
<tr>
<td>NC4 (S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>블 룸 필드 외., 2008</td>
			<td>야생 타입</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::mCherry 복제 5</td>
			<td>NC4</td>
			<td>HM1912</td>
			<td>Paschke 그 외 여러분, 2018</td>
			<td>act5 노크에</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::GFP 복제 2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>HM1930</td>
			<td>Paschke 그 외 여러분, 2018</td>
			<td>act5 노크에</td>
		</tr>
<tr>
<td>V12M2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>블 룸 필드 외., 2008</td>
			<td>야생 타입</td>
		</tr>
<tr>
<td>WS2162</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>블 룸 필드 외., 2008</td>
			<td>야생 타입</td>
		</tr>
</tbody></table>보충 표 1:의 다른 긴장 Dictyostelium 공부.

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Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum 셀 선택에 따라 성장과 박테리아에서의 유전 공학

Dictyostelium discoideum 셀 마이그레이션, endocytosis, 개발 등 복잡 한 세포질 과정을 공부 하는 인기 모델 생물 이다. 생물의 유틸리티 유전자 조작의 가능성에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 transfect Dictyostelium discoideum 세포를 액체 매체에서 자란 셀의 기존 한계를 극복 하는 방법을 제시.

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

이 프로토콜의 가치는 그 균주가 액체 매체에서 도끼로 성장할지 여부에 관계없이 분자 유전학에 의해 조작될 수 있도록 하는 것입니다. 이 기술의 또 다른 장점은 빠르고 간단하다는 것입니다. 디티오스텔라늄을 혼합하기 시작하기 전에 엑조코모솜 플라스미드를 가진 트랜스펙트 세포로 전향한다.결과는 현미경 검사를 사용하여 형질 전환 후 2 일 동안 이미 검증 될 수 있습니다. dictyostelium 세포 와 박테리아 현탁액으로 작동 하는 것은 특이 한. 시각화는 실험자에게 프로토콜의 다양한 단계가 어떻게 수행되는지 에 대한 아이디어를 제공하는 데 도움이 됩니다.나와 함께 절차를 시연하는 것은 수다베 이마니키아, 내 실험실에서 포스트 독이 될 것입니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 따라 염화 마그네슘과 염화칼슘으로 소렌센 완충제 작업 용액 1000밀리리터를 준비하십시오. 그 후, K 에어로게인의 단일 콜로니를 사용하여 LB 배지 의 1리터를 접종한다.박테리아가 흔들림과 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 성장할 수 있도록 하십시오. 세포를 500 밀리리터 원심분리기 튜브 두 개로 감아 세포를 수확합니다. 그런 다음 500 밀리리터의 완충제로 박테리아를 한 번 씻으시다.버퍼의 20 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 광미터를 사용하여 샘플의 광학 밀도를 확인하고 광학 밀도가 약 100이 될 때까지 샘플을 버퍼로 희석시. 그 후 텍스트 프로토콜에 따라 H40 전기기화 버퍼를 준비합니다.K 에어로게인을 성장하여 실온에서 하룻밤 사이에 SM 배지에 합류합니다. SM 한천 플레이트에 세균 현탁액 400마이크로리터를 넣고 균등하게 펴보입니다. 그런 다음 멸균 루프를 가지고 dictyostelium 세포로 접종하고 접시의 한 가장자리에 세포를 확산시다.2일 동안 22도의 플레이트를 배양하여 성장 영역이 트랜스펙트에 충분히 큰지 확인합니다. 10센티미터 조직 배양 처리 페트리 접시에 K 에어로진 서스펜션 10 밀리리터를 추가합니다. 이어서, 배양판의 성장 영역에서 세포를 긁어내는 10 마이크로리터 일회용 접종 루프를 사용한다.얼음 차가운 H40 버퍼를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브로 세포를 전송합니다. 10000배 의 중력으로 2초 간 셀을 회전시다. 그런 다음 상체를 버리고 H40 버퍼에서 셀을 다시 일시 중지합니다.다음으로, 세포의 100 마이크로리터를 DNA 1~2마이크로그램을 포함하는 튜브에 추가합니다. 피펫을 위아래로 사용하여 세포 DNA 혼합물을 미리 냉각된 전기기공큐벳으로 혼합하고 전달합니다. DNA의 2 마이크로그램 이상을 추가하지 마십시오.더 높은 DNA 농도는 세포에 대한 독성과 효율성을 감소. 전기기분기 후, 즉시 준비된 10센티미터 페트리 접시로 세포를 옮기고 세포가 5시간 동안 회복되도록 합니다. 녹아웃, 노크 인 또는 5 개의 노크 인 행위에 대한 변형을 선택하려면 표면 위에 액체를 피펫하여 페트리 접시에서 세포를 분리합니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 선택적 에이전트의 3개의 희석제를 설정합니다. 마지막으로, 준비된 희석제 150마이크로리터를 96웰의 평평한 바닥 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분배한다. 이 프로토콜에서는 이중 기자 엑스트라크로모솜 플라스미드 시스템이 시연되었다.32 회광 후, 세포의 대다수는 형광 표지 융합 단백질을 모두 표현했습니다. 5M 체리 노크인과 NC4도 시도했다. 아가로즈 젤에서 소화를 실행한 후 두 개의 밴드가 얻어졌다.4127 베이스 쌍 밴드에는 원하는 구조가 포함되어 있습니다. 정제된 DNA는 NC4 세포의 전염을 위해 사용되었다. NC4 경질의 2개의 클론은 PCR를 통해 분석되었고 둘 다 예측된 대역 패턴을 보였다.그런 다음 남부 얼룩이 PCR의 결과를 검증하는 데 사용되었습니다. NC4는 Ax2 세포보다 세균성 잔디에서 더 빠르게 성장했습니다. 4시간 후, 더 많은 NC4 세포가 Ax2 세포보다 아가로즈 아래에서 기어갈 수 있었다.NC4 세포는 Ax2 세포보다 엽산에 대한 더 강한 화학 반응으로 더 빨라졌습니다. 항상 갓 설정 SM 플레이트에서 셀을 사용합니다. 4 일 보다 오래 된 세포를 사용 하지 마십시오, 그렇지 않으면 효율성이 떨어질 것 이다.갓 고립 된, nonextenic, 흰색 HAP 균주는 일반적으로 dictyosteliums의 ruching 또는 사회적 행동에 관한 질문을 해결하는 데 사용됩니다. 우리는 그 격리를 통해 분자 유전학을 적용 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

연구

유전학

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Ribosomal DNA에 따라 RNA 샘플에서 DNA 오염 평가

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

게놈 전체 상호 Hemizygosity 분석을 통해 사카로 마이스 효모의 종 간의 열내성 차이의 유전 매핑

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...