Name: genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Forfatterne takker Kay lab for inngang til denne metoden og LMB mikroskopi og flyt cytometri fasiliteter for utmerket vitenskapelig og teknisk støtte. Dette arbeidet ble finansiert av Medical Research Council grant MC_U105115237 til R. R. Kay, BBSRC (bioteknologi og Biological Sciences Research Council) grant BB/K009699/1 til R. R. Kay, kreftforskning Storbritannia gi A15672 til R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z Jonathan R Chubb og MRC finansiering (MC_U12266B) til MRC LMCB University enheten på UCL.

<ol>
	<li>Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Dictyostelium+discoideum.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum.</a> Development. 138 (3), 387-396 (2011).</li><li>Sussman, R., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Dictyostelium+discoideum+in+axenic+culture.">Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).</li><li>Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+the+Dictyostelium+alpha-actinin+gene+leads+to+an+altered+mRNA+and+lack+of+the+protein.">Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein.</a> The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).</li><li>De Lozanne, A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+Dictyostelium+myosin+heavy+chain+gene+by+homologous+recombination.">Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination.</a> Science. 236, 1086-1091 (1987).</li><li>Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+transient+expression+system+for+Dictyostelium+discoideum.">Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum.</a> Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).</li><li>Knecht, D., Pang, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Dictyostelium+discoideum.">Electroporation of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).</li><li>Wetterauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+strains+of+Dictyostelium+discoideum+can+be+transformed+using+a+novel+selection+cassette+driven+by+the+promoter+of+the+ribosomal+V18+gene.">Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene.</a> Plasmid. 36, 169-181 (1996).</li><li>Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditions+for+the+transformation+of+nonaxenic+Dictyostelium+strains.">Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains.</a> Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).</li><li>Bloomfield, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+controls+macropinocytosis+and+phagocytosis+in+Dictyostelium.">Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP(3)-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Hoeller, O., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+the+absence+of+PIP3+gradients.">Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients.</a> Current Biology. 17, 813-817 (2007).</li><li>Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dictyostelium+RasS+protein+is+required+for+macropinocytosis,+phagocytosis+and+the+control+of+cell+movement.">The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement.</a> Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).</li><li>Schaap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phylogeny+and+evolution+of+morphology+in+the+social+amoebas.">Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas.</a> Science. 314, 661-663 (2006).</li><li>Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+Aggregative+Multicellularity+and+Cell-Cell+Communication+in+the+Dictyostelia.">The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).</li><li>Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+in+social+amoebae+is+mediated+by+allelic+pairs+of+tiger+genes.">Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes.</a> Science. 333 (6041), 467-470 (2011).</li><li>Strassmann, J. E., Queller, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+cooperation+and+control+of+cheating+in+a+social+microbe.">Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).</li><li>Wolf, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+Trade-offs+Result+in+the+Illusion+of+Social+Success.">Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success.</a> Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).</li><li>Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+set+of+small,+extrachromosomal+expression+vectors+for+Dictyostelium+discoideum.">A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum.</a> Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).</li><li>Woznica, D., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under-agarose+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).</li><li>Dubin, M., Nellen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+set+of+tagged+expression+vectors+to+monitor+protein+localisation+and+function+in+Dictyostelium.">A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium.</a> Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).</li><li>de Hostos, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+mutants+lacking+the+cytoskeletal+protein+coronin+are+defective+in+cytokinesis+and+cell+motility.">Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility.</a> Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).</li><li>Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+targeting+of+multiple+genes+in+Dictyostelium.">CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).</li><li>Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+harbours+for+the+integration+of+new+DNA+in+the+human+genome.">Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).</li><li>Rosengarten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaps+and+lulls+in+the+developmental+transcriptome+of+Dictyostelium+discoideum.">Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum.</a> BMC Genomics. 16, 294 (2015).</li><li>Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-mediated+diversification+of+transcriptional+bursting+dynamics+following+gene+duplication.">Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).</li><li>Gebbie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phg2,+a+kinase+involved+in+adhesion+and+focal+site+modeling+in+Dictyostelium.">Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).</li></ol>

Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.

Bruk av ikke-axenic, vill-type Dictyostelium celler har vært svært begrenset så langt i molekylær forskning. Metoder for genteknologi av disse stammer har manglet pålitelighet og effektivitet23, hindrer deres generelle adopsjon. Genererte materialer og protokoller presenteres her kan brukes for D. discoideum belastning uavhengig av dens evne til å vokse i flytende medium. Det bør nevnes at denne protokollen er optimalisert for NC4-avledet cellelinjer. Hva effektivitet for fersk isolert stammer fra naturen skiller seg fra NC4, som vi har sett før, og er vist her over for V12M2 og WS21628,9. Electroporation forholdene synes spesielt å ha en betydelig innflytelse på transfection effektivitet og kan kreve ytterligere optimalisering for noen stammer. Generelt, en tilstrekkelig mengde transfectants har blitt observert i alle stammer testet så langt viser at disse metodene er gjennomførbar. Antall positive transfectants får NC4-avledet stammer er høyere enn andre ikke-axenic vill-type stammer, men i alle tilfeller, hentes tilstrekkelig antall transfectants slik at videre studier. Dette, samt enkelheten av våre protokollen, er den store forbedringen i forhold til tidligere forsøk8,9.
Disse nye protokoller for ikke-axenic dekker alle standard genetisk prosedyrer og legge ytterligere fordeler, siden transfections kan utføres raskt og effektivt parallelt. Positiv kloner kan fås i dager i stedet for uker, siden vekst på bakterier halvdeler divisjon tiden. Nyetablerte plasmider også arbeide under axenic forhold og kan rutinemessig brukes under begge vekst betingelsene, som er en annen avansement dette methology22. Som introdusert i protokollen, plasmider brukes til valg på bakterier har spesielle krav som er avgjørende for suksess for transfection. Spesielt er arrangørene kjøring uttrykk og motstand kassettene viktig for vellykket transfection. De brukte act6 (begrepsordbok 6) promoter24 for kjøring motstand eller uttrykk kassettene mangler effektivitet når celler er dyrket på bakterier. I systemet vårt plasmider kjører svært aktiv act15 (begrepsordbok 15) selskapet alle uttrykk kassetter, mens motstand kassettene er under kontroll av en coA (coactosin A) promoter, som begge er aktiv under axenic forhold og i celler dyrket på bakterier. Krav for uttrykket av reporteren konstruerer og banke i og Bank-out konstruksjoner gjør det nødvendig å bruke plasmider repertoaret, men dessverre begrenser bruken av vektorer allerede opprettet som bruker ineffektiv act6 promoter.
Promotoren effektivitet er spesielt viktig for transfections som en enkelt integrering hendelse i riktig genomisk locus. På grunn av våre forbedring av arrangørene kjøring genuttrykk motstand, produseres nok motstand protein enkelt locus integrasjoner. En stor bekymring var favoriserer av flere integrasjoner i genomet når du bruker hygromycin eller G418 som beskrevet. Ingen favorisering av flere integrasjoner har observert så langt, som rapportert tidligere for G418 valg med eldre promoter systemer25. Dette betyr at både hygromycin og G418 er egnet valgbar markører for generering av ren fortrenging og knock-ins. Dessverre, valgbar markør blasticidin fungerer ikke under ikke-axenic forhold. Dette er en stor ulempe av vår metode, siden blasticidin motstand kassetten er rutinemessig brukes til å generere knock-out konstruksjoner i D. discoideum. Konstruksjoner som var allerede generert med blasticidin motstand kassetter må være rederived med en av gjennomførbar valgbar markører. En annen mulighet å overkomme denne begrensningen er å kombinere de nylig etablerte axenic D. discoideum CRISPR teknologi med denne transfection protokollen26. Generering av egnet, enkelt guide RNAs (sgRNAs) er enklere og raskere enn gjenoppbyggingen av fullført banke ut konstruksjoner. For fremtidige retninger, muligheten til å generere flere fortrenging bruker CRISPR/Cas9 kombinert med denne transfection protokollen er tiltalende og kan bane vei for mange forskere i Dictyostelium samfunnet. Imidlertid bør workability av etablerte forbigående uttrykk brukt for CRISPR/Cas9 i axenic voksen celler bli nøye undersøkt.
Act5 bank i systemet presentert tilbyr en pålitelig og sikker integrering system for generering av stabil cellelinjer i D. discoideum, med fordelen av lignende nettsteder i andre organismer22. Også avhengig av en enkelt integrering hendelse i genomet og tilbyr mange muligheter for forskjellige forsknings-retninger. Act5 selskapet er sterkt aktiv og garanterer nesten homogen uttrykk27 uavhengig av dyrking. Fluorescerende reporter proteiner kan enkelt integreres i denne trygg havn locus bruker utviklet målretting plasmider. Dette kan være nyttig, for eksempel for celle-sporing formål, som vist her i en blanding eksperiment. Cellene viser minimal celle til celle uttrykk variasjon, som kan hjelpe i automatiserte celle sporing. Viktigere, vises innsetting av en ønsket rekkefølge i handle5 locus svært nøytral28,29. Som uttrykket ikke avhenger på merketråd valgbar å opprettholde protein uttrykk, sett i tilfeldig baneformasjonene eller extrachromosomal vektor-bærende linjer, kan act5 systemet være nyttig for redning eksperimenter, også. Siden cellelinjer homogen, kan alle celler analyseres. Dette er ikke mulig å bruke en extrachromosomal plasmider uttrykk, der det er betydelig heterogenitet i uttrykk.
I tillegg til disse generelle forbedringer for alle stammer gir muligheten til å bruke ikke-axenic vill-type celler for molekylær forskning en vurdering av effektene av akkumulert mutasjoner i gjeldende laboratorium stammer. Flere genetiske rearrangements har blitt funnet siden innføringen av den Ax2 stammen i 1970, som vist av tidligere publiserte microarray analyser26. Syntetisk fenotyper er observert på grunn av disse mutasjonene. For eksempel viser en rapporterte phg2 mutant redusert vedheft i én laboratorium belastning bakgrunn og økt vedheft i en annen3. Slike motstridende data kan nå løses ved å gjenta eksperimentet i felles stamfar belastningen (i dette tilfellet DdB). Styrken i denne tilnærmingen har nylig vist for de små GTPase RasS30,31.
Muligheten til å utføre genetiske eksperimenter i D. discoideum belastning utvider potensialet i nye forsknings-retninger som avhenger av bruken av vill isolert, spesielt de som involverer sosiale utviklingen, kin anerkjennelse og seksuell syklus22.

Dictyostelium slekten er jord-levende sosiale amoeba som hovedsakelig lever bakterier. Plasseres i rekken Amoebozoa, et stort antall arter har vært isolert som kan grupperes i fire forskjellige klader1. Arten Dictyostelium discoideum (D. discoideum) har blitt en populær modell organisme å studere komplekse cellulære prosesser som celle migrasjon og fagocytose. Kontrollere og standardisere eksperimentelle forhold, axenic cellen linjer har blitt utviklet som kan vokse i komplekse eller definert flytende medium i fravær av bakterier2. Av særlig betydning er Ax2, Ax3, Ax4 stammer, som ble alle generert i 1970 og stammer fra en enkelt vill isolere NC43. Verktøy for genetisk engineering ble utviklet i disse axenic stammer, som resulterer i første publiserte knockout i 19874,5. Protokollene ble ytterligere utviklet og optimalisert for bruk under axenic forhold6,7.
Tilpasning av disse protokollene å vill-type D. discoideum stammer som ikke kan vokse i flytende kjøttkraft forsøkt av flere laboratorier. Men har dette ikke blitt fullt vellykket siden transfection protokollene er komplekse og mangler effektivitet delvis på grunn av antall bakterier som vask for selektiv reagenser8,9. Som et resultat, kommer i hovedsak alle molekylære data på D. discoideum fra etterkommere av en enkelt vill-type isolere. Vi ønsket å overkomme denne begrensningen og utvikle en metode for å endre genetisk D. discoideum celler uavhengig av deres evne til å vokse i flytende medium. Behovet for slik metode kan forklares av observasjon at det ble antatt i fortiden som mutasjoner tillater axenic vekst var hovedsakelig nøytrale og ikke svekke celle fysiologi. Denne antagelsen er bare delvis riktig. Generelt finnes det to bemerkelsesverdige forskjeller; først isolerte mellom forskjellige axenic stammer, og andre, når disse axenic stammer sammenlignes med ikke-axenic vill isolerer8,9.
Kanskje er den mest kritiske faktoren viktige axenic genet, øksB, som ble identifisert nylig som RasGAP NF1. NF1 som en RasGAP viktigste funksjon er å hindre Ras aktivitet3. Sletting av enzymet i alle axenic stammer fører til overdreven Ras aktivitet manifestert som dannelsen av store aktive Ras patcher. Disse forstørret Ras-oppdateringene føre til Oppsamling av PIP3 i plasma membranen. De vises tilfeldige flekker av PIP3 og aktive Ras er en mal for dannelsen av en sirkulær krusning som til slutt lukker og fører til dannelse av macropinosomes10. Konsekvensen er overdreven økning i macropinocytic aktivitet. Macropinocytosis er en begrepsordbok-drevet prosess. En konkurranse for cellen cytoskjelett komponenter for dannelsen av macropinosomes eller eukaryotene er resultatet. Dens innvirkning på celle atferd gjenspeiles i den nesten komplette forebygging av chemotaxis av vegetative celler folat11. Svær forstørret PIP3 patcher er meget vedvarende. Selv i starved celler, PIP3 patcher fortsatt og kan feiltolkes som eukaryotene, hvilke kanne anledning problemer tolke studier på chemotaxis til leiren.
I noen tilfeller er NF1 mutasjon eksperimentelt nyttig. Dette fører oss til en andre motivasjon for å utvikle en transfection metode for bacterially vokste D. discoideum celler, siden økningen i macropinocytosis rate gjør axenic celler verdifulle for å undersøke grunnleggende sider ved denne prosessen12 . Imidlertid mutasjon i genene kreves for macropinocytosis, for eksempel Ras- og PI3-kinaser10, har nesten avskaffet axenic vekst, noe som gjør det nødvendig å manipulere disse cellene gjennom vekst på bakterier. En annen grunn som gjengir bakterier-baserte transfections verdifulle er den økende bruken av Dictyostelids å utforske spørsmål i utviklingen av flere cellularity13,14, kin anerkjennelse15,16: og altruistiske mobilnettet atferd, som hovedsakelig avhenger av bruken av fersk isolert vill-type isolerer17. Alle nevnte forskningsområder kan ordnes med effektive metoder for genetisk manipulering av vill isolert, som er ikke-axenic og vokser ikke i flytende kjøttkraft.
Våre protokoller brukes overvinne beskrives begrensningene. Til sammen har muligheten til å utføre genetisk manipulasjon med bakteriell vokst D. discoideum celler har fordeler for alle Dictyostelium forskere, selv om det er bare økte hastigheten på utvelgelsesprosessen grunn raskere veksten av amoeba (4 h dobling tid) på bakterier i forhold til veksten i axenic medier (10 h dobling tid).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:820px;" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Equipment</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-400-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">12823252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EP6331000025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gene Pulser X Cell, including CE &#38; PC modules</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Safety Cabinet Foruna - SCANLAF</td>
			<td style="width:184px;">Labogene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BioPhotometer Plus</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CLSM 710</td>
			<td style="width:184px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Media &#38; Agaroses</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LoFlo Medium</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LF0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:184px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Low EEO Agarose</td>
			<td style="width:184px;">BioGene</td>
			<td style="width:119px;">300-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Purified Agar</td>
			<td style="width:184px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SM broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">SMB0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2x LB broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LBD0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Chemicals</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HEPES free acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">391340 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">P/4800/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">Na2HPO4 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2 * 6 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">5982 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">CaCl2 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">442909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KOH</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">26668.263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cultur Dishes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5</td>
			<td style="width:184px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:119px;">P50G-1.5-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Geneticin G418-sulphate</td>
			<td style="width:184px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hygromycin B Gold</td>
			<td style="width:184px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Additional Consumables</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2mm gap electroporation cuvettes, long electrode</td>
			<td style="width:184px;">Geneflow Limited</td>
			<td style="width:119px;">E6-0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10 &#181;l Inoculating Loop, Blue 10 Micro L</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">129399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Spreader, L-shaped, sterile</td>
			<td style="width:184px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">730190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Combitips advanced 5 ml</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf BIOPUR</td>
			<td style="width:119px;">30089669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Kits</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ZR Plasmid Miniprep Classic</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D4016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Quick DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zymoclean DNA Recovery Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Enzymes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0482L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td style="width:184px;">TakaraBio</td>
			<td style="width:119px;">R045A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria

Dictyostelium discoideum er en spennende modell organisme for studier av celle differensiering prosesser under utvikling, celle signalisering og andre viktige mobilnettet biologi spørsmål. Teknologien å manipulere genetisk Dictyostelium celler er godt utviklet. Transfections utføres med ulike valgbare markører og markør re sykling, inkludert homologe rekombinasjon og insertional mutagenese. Dette støttes av et godt kommentert genom. Men disse tilnærmingene er optimalisert for axenic cellelinjer vokser i flytende kulturer og er vanskelig å bruke for ikke-axenic vill-type celler, som beiter på bakterier. Den mutasjoner som finnes i axenic stammer forstyrre Ras signalering, forårsaker overdreven macropinocytosis kreves for fôring, og svekke celle migrasjon, som forundrer tolkningen av signaltransduksjon og chemotaxis eksperimenter i disse stammer. Tidligere forsøk på å manipulere genetisk ikke-axenic celler har manglet effektivitet og nødvendige komplekse eksperimentelle prosedyrer. Vi har utviklet en enkel transfection protokoll som, for første gang, overvinner disse begrensningene. Disse rekke store forbedringer Dictyostelium molekylær arvelighetsforskning gjør at vill-type celler kan manipuleres like enkelt som standard laboratorium stammer. I tillegg til fordelene for å studere uskadet signalisering og motilitet prosesser, kan mutanter som forstyrrer macropinocytosis-baserte vekst nå være lett isolert. Videre er hele hva arbeidsflyten betraktelig, med rekombinant celler som kan genereres i dager i stedet for uker. En annen fordel er at molekylær arvelighetsforskning videre kan utføres med fersk isolert vill-type Dictyostelium prøver fra miljøet. Dette kan bidra til å utvide omfanget av tilnærminger brukt i disse forskningsområder.

Extrachromosomal plasmider brukes for reporter studier, som mål å identifisere lokaliseringen av visse proteiner i en celle eller endringer i cellestruktur mutant celler. For mange tilnærminger, slik som overvåking av cellen syklus, er det avgjørende å uttrykke to journalister samtidig. Dette er nå mulig å bruke dual reporter extrachromosomal plasmider systemet (tabell 1). På dag 1, celler var transfekterte før du legger til valgbar markøren G418 etter 5t (figur 1). I eksemplet, NC4, DdB, Ax2 og uavhengig avledede vill isolert V12M2 og WS2162 (supplerende tabell 1) var transfekterte med plasmider pPI289, som koder for GFP-TubulinA, en markør for piskehale som henger og mCherry-PCNA, et protein som er brukes for overvåking cellen syklus (figur 2A). Etter 32 h, ble cellene observert under mikroskopet. Fleste cellene uttrykte begge fluorescerende-merket fusion proteiner, rapporter konsekvent med tidligere uttrykket av to journalister fra samme plasmider viser lignende uttrykk nivå, som er nesten umulig ved to forskjellige plasmider 18,19. En representant celle for hver celle linje (NC4, DdB, Ax2, V12M2 og WS2162) uttrykker ønsket dobbelt reporteren er vist i figur 2B. Hva effektiviteten oppsummeres i figur2 C. NC4-avledet cellelinjer viser beste transfection effektiviteten. Men for cellelinjer V12M2 og WS2162, ble en stor rekke transfectants oppnådd.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig2.jpg"> Figur 2 : Uttrykk for en extrachromosomal plasmider. (A) Extrachromosomal plasmider er direkte transfekterte i sirkulær form. Som et eksempel vises dobbelt reporter pPI289. NgoMIV nettsteder viser innsetting av andre reporteren extrachromosomal uttrykk plasmider. (B) Z-projeksjon av en representant celle uttrykke GFP-TubulinA (cytoplasmatiske) og mCherry-PCNA (hovedsakelig kjernefysisk) for fem ulike vill-type cellelinjer brukes (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C) på transfection effektivitet for de fem linjene i (B) ble beregnet. Vist er gjennomsnittet av to eksperimenter. Feilfelt viser ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Integrering av en målretting vektor i et angitt genomisk locus er mer utfordrende og krever mer forsiktig analyse av genererte cellen linje. I Figur 3forsøkes en act5- mCherry KI i NC4. Først må plasmider være linearized for å øke frekvensen av rekombinasjon hendelser etter hva. For dette kuttes plasmider pDM1514 med NgoMIV. To band er innhentet etter running sammendraget på en agarose gel. 4127 bp bandet inneholder den ønskede konstruksjonen (Figur 3). Hva, fordøyd DNA må trekkes fra gel og renset med en gel utvinning utstyr følger produsentens instruksjoner.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig3.jpg"> Figur 3 : Utarbeidelse av act5 bank-i og DNA for transfection. Et eksempel på bruk av en handle5 knock plasmider pDM1514 vises. Trinnene for forberedelse er oppført som følger. (A) før electroporation, linearize plasmider bruker angitt NgoMIV områdene. (B, C) Løpe det kutt plasmider på en agarose gel til de to forventede bandene er riktig atskilt. Kuttet ut 4127 bp bandet inneholder rekombinasjon armene, mCherry og motstand-kassetten, og gel ekstra DNA. DNA er nå klar for hva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Renset DNA ble brukt for hva NC4 celler. Etter 5-6 dager utvalg, ble kloner innhentet. Representant transfection effektivitet og hvor mye positiv identifiserte kloner for flere act5 banke-forsøk oppsummeres i tabell 3. To kloner av NC4 hva var tilfeldig valgt og analyseres av PCR (Figur 4A), og viste begge spådd bandet mønstrene forventet av et banke og ble ytterligere godkjent med sørlige blot analyse for å sikre en enkel integrering hendelse av Konstruer i genomet20. Blot viser en klar eneste integrering i ønsket act5 locus (Figur 4B). Generert NC4::act5-mCherry celle linjen kan nå brukes i eksperimenter.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig4.jpg"> Figur 4 : Validering av act5- mCherry KIs i NC4. (A) ordningen og kontroll PCRene for validering av positiv integrasjoner i act5 locus. De angitte primerne ble brukt til å analysere to uavhengige kloner og foreldre. Begge kloner viser forventet bandene for motstand-kassett og nedstrøms (P1) eller oppstrøms primer (P2), som ikke finnes i foreldrenes belastningen. Primer kombinasjonen (P1/P2) bekrefter riktig integrering av mCherry og motstand kassett i act5 locus. Vill-type NC4 viser det forventede 2800 bp bandet, mens både KI kloner mangler dette bandet og i stedet vise et PCR-produkt om 1400 base parene større. (B) ordningen for brukte begrensning fordøye og sørlige blot. Begge knock-kloner Vis mindre 3400 bp bandet, som er et resultat av integrasjonen av Konstruer i handle5 locus, spesielt den ekstra Bcljeg området i hygromycin motstand kassetten. Vill-type kontroll viser forventet 5,8 kb som følge av de to nedstrøms ligger Bcljeg nettsteder. Blot ble beskåret og skjøtes klarhet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>målrettet konstruksjon i act5 locus</td>
			<td>plasmider navn</td>
			<td>antall okkuperte brønner</td>
			<td>Antall merkede kloner</td>
			<td>Positiv kloner</td>
			<td>Riktig kloner (%)</td>
			<td>Dictyostelium belastning brukes</td>
			<td>Hva effektivitet (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µg DNA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-mCherry</td>
			<td>pPI226</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>14.2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3,5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-GFP</td>
			<td>pPI227</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>5</td>
			<td>41,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>6 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>66,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>66</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td>55,5</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.3 x 10 ^-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>221</td>
			<td>12</td>
			<td>10</td>
			<td>83.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.1 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>85.7</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3,5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>70</td>
			<td>DEGRAVS</td>
			<td>5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>240</td>
			<td>12</td>
			<td>11</td>
			<td>91,6</td>
			<td>DEGRAVS</td>
			<td>1.2 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>320</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>100</td>
			<td>NC4</td>
			<td>1.6 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Transfection effektivitet og mengden oppnådd positive transfectants for generering av act5 KIs i forskjellige belastning bakgrunner 22 .
Handle5 locus tilbyr relativt homogene uttrykk for integrert reporter21. Generert NC4::act5-mCherry cellene tillate blanding eksperimenter utført med andre act5 banke-moduler ved hjelp av et annet fluorescerende protein som GFP. For å understreke den store fordelen av dette systemet, vises blande eksperimenter med Ax2::act5-GFP . På grunn av manglende evne til å transfect ikke-axenic vill-type celler, kan denne type tilnærming ikke utføres før. Mix eksperimenter er et viktig verktøy for å analysere celle oppførsel, fordi de tillater en direkte sammenligning mellom forskjellige linjer har identiske eksperimentelle forhold. NC4 celler vokse raskere på bakteriell plener enn Ax2 celler (figur 5et). Dette kan skyldes en høyere kapasitet til å phagocytose bakterier eller forbedret evne til å flytte og vise chemotaxis mot en matkilde. Bruker under agar folat chemotaxis analysen, ble direkte sammenligning av en befolkning på NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-GFP utført, viser at NC4::act5-mCherry er mye mer effektiv i folat sensing. Etter 4 h kunne flere NC4::act5-mCherry -celler krype under agarose enn Ax2::act5-GFP celler (figur 5B). Analysere standard beregninger av chemotaxis for cellene migrerer under agarose avslørt at NC4::act5-mCherry celler var raskere og viste sterkere chemotactic respons enn Ax2::act5-GFP celler (figur 5C-E ).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig5.jpg"> Figur 5 : Bruke handle5 KIs for avbildningsbasert chemotaxis blanding eksperimenter. (A) NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-GFP uttrykke angitt fluorescerende protein fra handle5 locus ble analysert mulighet til å vokse på en bakteriell plen. Etter 4 dager, plakk diameter oppstått fra enslig belagt Dictyostelium celler ble målt. Non-axenic act5:: NC4 celler gjøre betydelig større plaketter enn axenic Ax2::act5-GFP -celler (mener ± SD, *** p < 0,0001, n = 3, skalere bar 5 mm). (B) For bruk av under agarose folat chemotaxis analysen22 direkte sammenligne chemotactic evnene av NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-GFP brukes i (A), bakterier-vokst amoebae av både stammer ble blandet en 50/50 mellom. Cellene kunne krype under agarose. Etter 4 h, ble celler som var migrere opp folat forløpningen fotografert med AC confocal mikroskop. Antall NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-GFP celler ble deretter bestemt. NC4::act5-mCherry celler var mer effektive i sensing folat. Om 10 ganger mer NC4::act5-mCherry celler ble funnet i forhold til Ax2::act5-GFP celler (mener ± SD, *** p < 0,0001, n = 6, skala bar 100 µm). (C, D) Cellene ble filmet for 60 min, og deres fart og chemotactic indeksen ble beregnet. Etter pre utvalg av de mest chemotactically forståelsesfull cellene (bare de overført under agarose), celler Ax2::act5-GFP viste lavere verdier for både celle fart og chemotaxis. Femti celler per celle linje ble analysert. (gjennomsnittlig ± SD, * p < 0,01, n = 3). (E) spor fra NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-GFPact5 knock-ins tegnes over 60 min., viser mer rettet bevegelse mot kilden chemoattractent NC4::act5-mCherry -celler (gjennomsnittlig ± SD, ** * p < 0,0001, n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Act5 bank i cellen linjene kan også brukes til flowcytometri. Som med vekst på bakterier, er det store forskjeller i utvikling mellom axenic stammer og ikke-axenic wild-typer. Etter utvikling, frukt likene av NC4 celler er nesten dobbelt så stor som avledet fra Ax2 celler. Hvis celler er blandet, er en middels størrelse frukt kroppen oppnådd. Analysere bidraget både cellen linjer mer kvantitativt, ble flowcytometri brukt. Disse analysene viste tydelig at middels størrelse frukt organer er på grunn av ulike nivåer av bidrag fra begge linjer. Mens NC4::act5-mCherry celler består av ca 75% av målt spores, bidro Ax2::act5-GFP bare 25%, avslører en potensiell fitness fordel for ikke-axenic stammer (figur 6). Siden analysen ikke overvåker befolkningen stilk cellen, er det to muligheter til å forklare ubalansen i utvikling mellom Ax2 og NC4. En mulighet er at Ax2 celler bidrar hovedsakelig til befolkningen stilk cellen, i stedet for å skrive inn spore celle befolkningen. Eventuelt flere NC4 celler kan angi utviklingsmessige syklusen, med Ax2 relativt forsinket, og de er dermed ikke bidra til montering av en frukt kroppen. Muligheten til å transfect ikke-axenic vill-type celler ytterligere utvikler andre tilnærminger og forenkler eksperimentelle prosedyrer.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig6.jpg"> Figur 6: Act5 KIs tillater analyse av blanding eksperimenter ved hjelp av flowcytometri. (A) NC4::act5-mCherry og Ax2::act5-GFP ble utviklet separat eller i en 50/50 blanding på ikke-næringsstoffer agar plater. NC4::act5-mCherry cellene danner større koloniform enn Ax2::act5-GFP. Mix viser en middels størrelse (skala bar 5 mm). AC confocal fluorescens * lys antyder et høyere beløp av NC4::act5-mCherry sporer i spore hodene avledet fra mikser. (B) å kvantifisere denne observasjonen, mengder sporer i høstet spore hoder blande eksperimentet i (A) ble analysert av flowcytometri. Ca 75% av spores stammer fra NC4::act5-mCherry celler, med kun 25% fra Ax2::act5-GFP celler. (C) representant distribusjon av sporer fra begge linjer i et flow cytometri scatter. Omtrent 0,05% viser positiv mCherry og GFP signaler, antyder at parasexual fusion prosesser har skjedd eller at sporer stikker til hverandre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Cellen linje</td>
			<td>Genetisk bakgrunn</td>
			<td>Referansenummeret</td>
			<td>Publisert før</td>
			<td>Type</td>
		</tr>
<tr>
<td>AX2 (Ka)</td>
			<td></td>
			<td>DBS0235521</td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>Wild type</td>
		</tr>
<tr>
<td>NC4 (S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>Wild type</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::mCherry klone 5</td>
			<td>NC4</td>
			<td>HM1912</td>
			<td>Paschke et al., 2018</td>
			<td>act5 bank-i</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::GFP klone 2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>HM1930</td>
			<td>Paschke et al., 2018</td>
			<td>act5 bank-i</td>
		</tr>
<tr>
<td>V12M2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>Wild type</td>
		</tr>
<tr>
<td>WS2162</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>Wild type</td>
		</tr>
</tbody></table>Supplerende tabell 1: annerledes belastninger av Dictyostelium studerte.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genteknologi Dictyostelium discoideum cellene basert på valget og vekst på bakterier

Dictyostelium discoideum er en populær modell organisme å studere komplekse cellulære prosesser som celle migrasjon, endocytose og utvikling. Nytten av organismen er avhengig av muligheten for genetisk manipulasjon. Her presenterer vi metoder for å transfect Dictyostelium discoideum celler som eksisterende begrensningene av dyrking celler i flytende medier.

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Verdien av denne protokollen er at den gjør at nesten enhver stamme av dictyostelium discoideum kan manipuleres av molekylær genetikk, uavhengig av om den belastningen vil vokse akenisk i flytende medium eller ikke. Den andre fordelen med denne teknikken er at den er rask og enkel. Transponere til transfect celler med en exochromosomal plasmid før du begynner å blande diktytyostelier.Resultatene kan allerede valideres to dager etter transinfeksjon ved hjelp av mikroskopi. Det er uvanlig å arbeide med dictyostelium celler og bakterier suspensjon. Visualisering vil bidra til å gi eksperimenterere en idé om hvordan de ulike trinnene i protokollene utføres.Demonstrere prosedyren med meg vil være Soudabeh Imanikia, en postdoc fra laboratoriet mitt. Til å begynne med, forberede 1000 milliliter av sorensen buffer arbeidsløsning med magnesiumklorid og kalsiumklorid i henhold til tekstprotokollen. Etter dette, bruk en enkelt koloni av K aerogenes for å inokulere en liter LB medium.La bakteriene vokse over natten ved 37 grader celsius med risting. Spinn cellene ned i to 500 milliliter sentrifugerør for å høste cellene. Vask deretter bakteriene en gang med 500 milliliter buffer.Resuspend pellet i 20 milliliter buffer. Bruk et fotometer til å kontrollere den optiske tettheten til prøven og fortynne prøven med buffer til den optiske tettheten er ca. 100. Etter dette klargjør du H40-elektroporasjonsbufferen i henhold til tekstprotokollen.Vokse K aerogenes å samløpet en SM medium over natten ved romtemperatur. Tilsett 400 mikroliter bakteriell suspensjon til en SM agar plate og spre den jevnt. Deretter tar du en steril løkke og inokulerer den med diktyostelceller og sprer cellene på den ene kanten av platen.Inkuber platen ved 22 grader Celsius i to dager, for å sikre at vekstsonene er store nok til transfeksjon. Tilsett 10 milliliter K aerogen suspensjon til en 10 centimeter vev kulturbehandlet Petri parabolen. Deretter bruker du en 10 mikroliter disponibel inokulasjonssløyfe for å skrape celler fra vekstsonene til kulturplaten.Overfør cellene til et 1,5 milliliter rør, som inneholder iskald H40-buffer. Spinn cellene i to sekunder ved 10000 ganger tyngdekraften. Deretter forkaster du de overnaturante og bruker cellene på ny i H40-bufferen.Deretter legger du til 100 mikroliter av cellene til et rør som inneholder ett til to mikrogram DNA. Pipetten opp og ned for å blande og overføre celle DNA-blandingen til en pre-kjølt elektroporasjon cuvette. Ikke tilsett mer enn to mikrogram DNA.Høyere DNA-konsentrasjon er giftig for cellene og reduserer effektiviteten. Etter elektroporasjon overfører du umiddelbart cellene til en forberedt 10 centimeter petriskål og lar cellene gjenopprette i fem timer. Hvis du vil velge et transfectant for en knock-out, knock-in eller en handling fem knock-in, løsner du cellene fra petriskålen ved å pipettere væske over overflaten.Deretter setter du opp tre fortynninger av selektive midler i henhold til tekstprotokollen. Til slutt distribuerer du 150 mikroliter av de tilberedte fortynningene i hver brønn på 96-brønns flatbunnsvevskulturplater. I denne protokollen ble en dobbel reporter ekstrakromosomal plasmid system demonstrert.32 timer etter transfeksjon uttrykte de fleste cellene både fluorescerende merkede fusjonsproteiner. En handling fem M kirsebær knock-in og en NC4 ble også forsøkt. To band ble oppnådd etter å ha kjørt sammendraget på en agarose gel.4127 base pair band inneholder ønsket konstruksjon. Det rensede DNA-et ble brukt til transinfeksjon av NC4-celler. To kloner av NC4 transfection ble analysert via PCR og begge viste de spådde bånd mønstre.Southern blot ble deretter brukt til å validere resultatene av PCR. NC4 vokste raskere på bakterielle plener enn Ax2-celler. Etter fire timer kunne flere av NC4-cellene krype under agarose enn Ax2-cellene.NC4-cellene var raskere og viste sterkere chemotaktisk respons på folat enn Ax2-cellene. Bruk alltid celler fra nydest konfigurerte SM-plater. Bruk aldri celler eldre enn fire dager, ellers vil effektiviteten falle.Nyisolerte, ikke-eksisterende, hvite HAP-stammer brukes ofte til å ta opp spørsmål om en ruching eller sosial oppførsel av diktytyostelier. Vår gjør det mulig å bruke molekylær genetikk gjennom disse isolatene.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Genetic Engineering av en ukonvensjonell gjær for fornybar Biodrivstoff og biokjemiske Produksjon

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Design og bruk av en lav pris, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bakterier Under Antibiotika Drug Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugerbare Mating Analyser for sekvens-spesifikk analyse av Transfer proteiner involvert i Konjugasjon

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering av DNA forurensning i RNA eksempler basert på Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Enkelt Molecule Analyse av Laser Lokalisert psoralen addukter

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Utvalgsavhengig og uavhengig generasjon av CRISPR / Cas9-medierte Gene Knockouts i mammale celler

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering og karakterisering MicroRNA-baserte genetisk modifisering av menneskelig Dental hårsekken stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Masse massespektrometri-baserte Proteomikk analyser bruker OpenProt databasen å avsløre romanen proteiner oversatt fra ikke-kanoniske åpent lesing rammer

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Samlede CRISPR-baserte genetiske skjermer i pattedyrceller

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetisk kartlegging av Thermotolerance forskjeller mellom arter av Saccharomyces gjær via Genova-bredt gjensidige Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...