Name: genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Os autores agradecer o laboratório Kay para entrada para este método e as LMB microscopia e fluxo cytometry instalações para excelente apoio científico e técnico. Este trabalho foi financiado pela concessão de bolsa MC_U105115237 para R. R. Kay, BBSRC (biotecnologia e ciências biológicas Research Council) Medical Research Council BB/K009699/1, para R. R. Kay, Cancer Research UK conceder A15672 a R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z Jonathan R Chubb, e MRC financiamento (MC_U12266B) para a unidade de Universidade LMCB MRC na UCL.

<ol>
	<li>Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Dictyostelium+discoideum.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum.</a> Development. 138 (3), 387-396 (2011).</li><li>Sussman, R., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Dictyostelium+discoideum+in+axenic+culture.">Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).</li><li>Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+the+Dictyostelium+alpha-actinin+gene+leads+to+an+altered+mRNA+and+lack+of+the+protein.">Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein.</a> The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).</li><li>De Lozanne, A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+Dictyostelium+myosin+heavy+chain+gene+by+homologous+recombination.">Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination.</a> Science. 236, 1086-1091 (1987).</li><li>Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+transient+expression+system+for+Dictyostelium+discoideum.">Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum.</a> Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).</li><li>Knecht, D., Pang, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Dictyostelium+discoideum.">Electroporation of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).</li><li>Wetterauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+strains+of+Dictyostelium+discoideum+can+be+transformed+using+a+novel+selection+cassette+driven+by+the+promoter+of+the+ribosomal+V18+gene.">Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene.</a> Plasmid. 36, 169-181 (1996).</li><li>Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditions+for+the+transformation+of+nonaxenic+Dictyostelium+strains.">Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains.</a> Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).</li><li>Bloomfield, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+controls+macropinocytosis+and+phagocytosis+in+Dictyostelium.">Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP(3)-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Hoeller, O., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+the+absence+of+PIP3+gradients.">Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients.</a> Current Biology. 17, 813-817 (2007).</li><li>Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dictyostelium+RasS+protein+is+required+for+macropinocytosis,+phagocytosis+and+the+control+of+cell+movement.">The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement.</a> Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).</li><li>Schaap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phylogeny+and+evolution+of+morphology+in+the+social+amoebas.">Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas.</a> Science. 314, 661-663 (2006).</li><li>Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+Aggregative+Multicellularity+and+Cell-Cell+Communication+in+the+Dictyostelia.">The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).</li><li>Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+in+social+amoebae+is+mediated+by+allelic+pairs+of+tiger+genes.">Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes.</a> Science. 333 (6041), 467-470 (2011).</li><li>Strassmann, J. E., Queller, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+cooperation+and+control+of+cheating+in+a+social+microbe.">Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).</li><li>Wolf, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+Trade-offs+Result+in+the+Illusion+of+Social+Success.">Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success.</a> Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).</li><li>Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+set+of+small,+extrachromosomal+expression+vectors+for+Dictyostelium+discoideum.">A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum.</a> Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).</li><li>Woznica, D., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under-agarose+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).</li><li>Dubin, M., Nellen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+set+of+tagged+expression+vectors+to+monitor+protein+localisation+and+function+in+Dictyostelium.">A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium.</a> Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).</li><li>de Hostos, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+mutants+lacking+the+cytoskeletal+protein+coronin+are+defective+in+cytokinesis+and+cell+motility.">Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility.</a> Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).</li><li>Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+targeting+of+multiple+genes+in+Dictyostelium.">CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).</li><li>Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+harbours+for+the+integration+of+new+DNA+in+the+human+genome.">Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).</li><li>Rosengarten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaps+and+lulls+in+the+developmental+transcriptome+of+Dictyostelium+discoideum.">Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum.</a> BMC Genomics. 16, 294 (2015).</li><li>Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-mediated+diversification+of+transcriptional+bursting+dynamics+following+gene+duplication.">Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).</li><li>Gebbie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phg2,+a+kinase+involved+in+adhesion+and+focal+site+modeling+in+Dictyostelium.">Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).</li></ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

O uso de células de Dictyostelium não-axénica, selvagem-tipo tem sido muito limitado até agora na investigação molecular. Métodos disponíveis para a engenharia genética destas cepas tem desrespeitado a confiabilidade e eficiência23, impedindo sua aprovação geral. Os materiais gerados e os protocolos aqui apresentados podem ser usados para qualquer tipo de d. discoideum independente de sua capacidade de crescer em meio líquido. Deve ser mencionado que este protocolo é otimizado para linhas celulares NC4-derivado. Eficiências de Transfeccao para recém isoladas estirpes do selvagem diferem NC4, como temos observado antes e são mostrados aqui para V12M2 e WS21628,9. As condições de eletroporação em particular parecem ter uma influência considerável na eficiência do transfection e podem requerer novas otimização para algumas estirpes. Em geral, uma quantidade suficiente de transfectants foram observadas em todas as cepas testadas até o momento, mostrando que esses métodos são praticáveis. O número de transfectants positivos obtidos usando cepas NC4-derivado é superior comparado a outras estirpes de tipo selvagem não-axénica, mas em todos os casos, um número suficiente de transfectants é obtido para permitir novas experiências. Isto, mais a simplicidade do nosso protocolo, é a grande melhoria em comparação com anteriores tentativas8,9.
Estes novos protocolos não-axénica cobrem todos os procedimentos padrão de genéticos e adicionar outras vantagens, já que transfections podem ser realizadas rapidamente e eficientemente em paralelo. Clones positivos podem ser obtidos em dias em vez de semanas, desde que o crescimento em metades de bactérias o tempo de divisão. Os recém-criada plasmídeos também trabalham sob condições axénica e podem ser usados rotineiramente em ambas as condições de crescimento, que é outro avanço esta methology22. Introduzido no protocolo, o plasmídeo utilizado para a seleção de bactérias têm necessidades especiais que são cruciais para o sucesso do transfection. Em particular, os promotores as fitas de expressão e a resistência de condução são importantes para o sucesso do transfection. O promotor usado frequentemente act6 (actina 6)24 para conduzir as fitas de resistência ou expressão carece de eficiência quando as células são cultivadas em bactérias. Em nosso sistema de plasmídeo, o promotor altamente ativo act15 (actina 15) dirige todas as fitas de expressão, enquanto as fitas de resistência estão sob o controle de um promotor de coA (coactosin A), ambos dos quais são ativos em condições axénica e em células cultivadas em bactérias. Requisitos para a expressão da repórter constrói assim como TOC-no e nocaute construções tornam necessário usar nosso repertório do plasmídeo, mas infelizmente limita o uso de vetores já criado que usam o promotor ineficiente act6 .
A eficiência de promotor é especialmente crítica para transfections que dependem de um evento de integração único para o locus genômico correto. Devido a nossa melhoria dos promotores dirigindo a expressão do gene de resistência, proteína suficiente resistência é produzida a partir de integrações único locus. Das principais preocupações foi o favorecimento de múltiplas integrações no genoma da quando usando hptII ou G418 conforme descrito. Não há favorecimento de múltiplas integrações tem sido observado até agora, como relatado anteriormente para seleções de G418 usando de sistemas mais velhos promotor25. Isto significa que tanto hptII e G418 são marcadores selecionáveis apropriados para a geração de nocautes limpos e batida-ins. infelizmente, o marcador selecionável blasticidin não funciona em condições não-axénica. Esta é uma grande desvantagem do nosso método, desde que a fita de resistência blasticidin rotineiramente é usada para gerar construções de mata-mata em d. discoideum. Construções que já foram geradas com fitas de resistência blasticidin precisará ser rederived usando um dos marcadores selecionáveis praticáveis. Outra possibilidade para superar essa limitação é combinar a recém criada axénica d. discoideum CRISPR tecnologia com este protocolo de transfeccao26. A geração de guia apropriada, único RNAs (sgRNAs) é mais simples e mais rápido do que a reconstrução das construções de nocaute completas. Para direções futuras, a possibilidade de gerar vários nocautes usar CRISPR/Cas9 combinado com este protocolo de transfeccao é atraente e pode pavimentar o caminho para muitos pesquisadores na Comunidade Dictyostelium . No entanto, a viabilidade do sistema estabelecido expressão transiente usado para CRISPR/Cas9 em células cultivadas axénica deve ser cuidadosamente examinada.
O act5 bater no sistema apresentado oferece um sistema de integração confiável e seguro para a geração de linhas de células estáveis em d. discoideum, com a vantagem de sites semelhantes estabelecidos em outros organismos22. Isso também depende de um evento de integração único no genoma e oferece muitas possibilidades para as direções de pesquisa diferente. O promotor de act5 é fortemente ativo e garante a expressão quase homogênea27 independente das condições de cultivo. Proteínas fluorescentes repórter podem ser facilmente integradas neste locus de porto seguro usando o plasmídeo engenharia de direcionamento. Isso pode ser útil, por exemplo, para fins de rastreamento de celular, como mostrado aqui em um experimento de mistura. As células mostram a variabilidade de expressão mínima de célula para célula, que pode auxiliar na célula automatizada de rastreamento. Importante, a inserção de uma sequência desejada para o locus agir5 aparece fenotipicamente neutro28,29. Como a expressão não depende de um marcador selecionável para manter a expressão da proteína, como pode ser visto em interagentes aleatório ou linhas de células extracromossômico vector-rolamento, o sistema de act5 pode ser útil para experimentos de resgate, também. Desde que as linhas de célula são homogêneas, todas as células podem ser analisadas. Isso não é possível usar um plasmídeo extracromossômico para expressão, em que há considerável heterogeneidade na expressão.
Além dessas melhorias gerais para todas as estirpes, a capacidade de usar células não-axénica do selvagem-tipo para a investigação molecular permite uma avaliação dos efeitos das mutações acumuladas em cepas de laboratório atual. Vários rearranjos genéticos foi encontrado desde a adopção da estirpe Ax2 em 1970, como mostrado por microarray previamente publicado análises26. Fenótipos sintéticos são observados devido à presença destas mutações. Por exemplo, um mutante relatado phg2 mostra diminuição da adesão em um plano de estirpe de laboratório e adesão aumentada em mais3. Tais dados conflitantes podem ser resolvidos agora, repetindo o experimento na estirpe ancestral comum (no caso, DdB). A força desta abordagem tem sido mostrada recentemente para a pequena GTPase RasS30,31.
A capacidade de realizar experiências genéticas em qualquer estirpe de d. discoideum expande o potencial de novas direções de pesquisa que dependem da utilização de isolados silvestres, notadamente aqueles que envolvem o ciclo sexual22, reconhecimento de parentesco e evolução social.

O gênero Dictyostelium são solo-vida ameba social que se alimenta principalmente de bactérias. Sendo colocado no filo Amoebozoa, um grande número de espécies têm sido isolado que podem ser agrupadas em quatro clados diferentes1. A espécie Dictyostelium discoideum (d. discoideum) tornou-se um organismo modelo popular para o estudo de complexos processos celulares, tais como a migração celular e fagocitose. Para controlar e padronizar condições experimentais, a célula axénica desenvolveram-se as linhas que são capazes de crescer em meio líquido complexo ou definido na ausência de bactérias2. De particular importância são o Ax2, Ax3, e Ax4 tensões, que foram todos geradas na década de 1970 e, finalmente, derivadas de uma única selvagem isolar NC43. Ferramentas para engenharia genética foram desenvolvidas nestas cepas axénica, resultando na primeira fase publicado em 19874,5. Protocolos adicionais foram desenvolvidos e otimizados para uso sob condições axénica6,7.
Adaptação desses protocolos para o selvagem-tipo d. discoideum cepas que não são capazes de crescer em caldo líquido foram tentadas por vários laboratórios. No entanto, isto não se tornou totalmente bem sucedido desde que os protocolos de transfeccao são complexos e faltam de eficiência, em parte devido a capacidade das bactérias para agir como um dissipador para o seletivo reagentes8,9. Como resultado, essencialmente tudo moleculares dados sobre d. discoideum vem de descendentes de um único isolado do tipo selvagem. Nós queríamos superar essa limitação e desenvolver um método para modificar geneticamente as células de d. discoideum independentes de sua capacidade de crescer em meio líquido. A necessidade de tal método pode ser explicada pela observação que foi assumido no passado que as mutações permitindo crescimento axénica eram principalmente neutras e não prejudicar a fisiologia celular. Esta suposição é apenas parcialmente correta. Em geral, existem duas diferenças notáveis; em primeiro lugar, isolaram entre as diferentes cepas axénica e segundo, quando estas cepas axénica são comparadas com estirpes selvagens não-axénica8,9.
Talvez o fator mais crítico é o chave axénica gene, MachadoB, que foi identificado recentemente como RasGAP NF1. A função principal da NF1 como um RasGAP é conter Ras atividade3. A exclusão da enzima em todas as cepas de axénica leva a excessiva atividade de Ras que se manifesta como a formação de grandes manchas de Ras ativas. Estes patches de Ras alargadas levam ao acúmulo de PIP3 na membrana plasmática. As manchas aparecendo uma coincidência de PIP3 e Ras ativo são um modelo para a formação de um plissado circular que eventualmente fecha e leva à formação de macropinosomes10. A consequência é um aumento excessivo na atividade macropinocytic. Macropinocitose é um processo orientado por actina. Uma competição para componentes do citoesqueleto para a formação de macropinosomes ou pseudopods é o resultado. Seu impacto sobre o comportamento da célula é refletido na prevenção quase completa da quimiotaxia de células vegetativas de folato11. Os patches PIP3 massivamente alargados são muito persistentes. Mesmo em células de fome, os patches PIP3 permanecem em podem ser interpretados como pseudopods, que podem causar problemas de interpretação de estudos na quimiotaxia para o acampamento.
Em alguns casos, a mutação de NF1 é experimentalmente úteis. Isso nos leva a uma segunda motivação para o desenvolvimento de um método de Transfeccao para modo adulto d. discoideum células, uma vez que o aumento da taxa de macropinocitose faz com que células axénica valioso para investigar aspectos fundamentais deste processo12 . No entanto, a mutação nos genes necessários para macropinocitose, tais como Ras e PI3-quinase10, quase aboliram axénica crescimento, tornando-se necessário para manipular estas células através do crescimento de bactérias. Outro motivo que processa baseado em bactérias transfections valiosa é a crescente utilização de Dictyostelids para explorar questões na evolução da celularidade multi13,14, reconhecimento de parentesco15,16, e altruísta comportamento celular, que dependem principalmente da utilização do selvagem-tipo recentemente isolado isola17. Todas mencionadas áreas de investigação podem ser facilitadas por métodos eficientes para a manipulação genética dos isolados selvagens, que são não-axénica e não cresce em caldo líquido.
Nossos protocolos permitem a superação das limitações descritas. Tomados em conjunto, a possibilidade de realizar manipulações genéticas com bactérias crescidas d. discoideum benefícios de suspensões de células para todos os investigadores Dictyostelium , mesmo se é apenas o aumento de velocidade do processo de seleção, devido ao rápido crescimento de ameba (tempo de duplicação de 4h) sobre as bactérias em comparação com o crescimento em meios axénica (10 h tempo de duplicação).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:820px;" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Equipment</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-400-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">12823252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EP6331000025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gene Pulser X Cell, including CE &#38; PC modules</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Safety Cabinet Foruna - SCANLAF</td>
			<td style="width:184px;">Labogene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BioPhotometer Plus</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CLSM 710</td>
			<td style="width:184px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Media &#38; Agaroses</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LoFlo Medium</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LF0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:184px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Low EEO Agarose</td>
			<td style="width:184px;">BioGene</td>
			<td style="width:119px;">300-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Purified Agar</td>
			<td style="width:184px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SM broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">SMB0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2x LB broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LBD0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Chemicals</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HEPES free acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">391340 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">P/4800/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">Na2HPO4 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2 * 6 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">5982 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">CaCl2 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">442909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KOH</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">26668.263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cultur Dishes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5</td>
			<td style="width:184px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:119px;">P50G-1.5-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Geneticin G418-sulphate</td>
			<td style="width:184px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hygromycin B Gold</td>
			<td style="width:184px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Additional Consumables</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2mm gap electroporation cuvettes, long electrode</td>
			<td style="width:184px;">Geneflow Limited</td>
			<td style="width:119px;">E6-0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10 &#181;l Inoculating Loop, Blue 10 Micro L</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">129399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Spreader, L-shaped, sterile</td>
			<td style="width:184px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">730190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Combitips advanced 5 ml</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf BIOPUR</td>
			<td style="width:119px;">30089669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Kits</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ZR Plasmid Miniprep Classic</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D4016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Quick DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zymoclean DNA Recovery Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Enzymes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0482L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td style="width:184px;">TakaraBio</td>
			<td style="width:119px;">R045A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria

Dictyostelium discoideum é um intrigante organismo modelo para o estudo de processos de diferenciação celular durante o desenvolvimento, sinalização celular e outras questões importantes de biologia celular. As tecnologias disponíveis para manipular geneticamente células de Dictyostelium são bem desenvolvidas. Transfections podem ser realizadas usando diferentes marcadores selecionáveis e marcador re-ciclismo, incluindo recombinação homóloga e mutagênese insercional. Isto é suportado por um genoma bem anotado. No entanto, essas abordagens são otimizadas para linhas de célula axénica crescendo em culturas líquidas e são difíceis de aplicar às células de tipo selvagem não-axénica, que se alimenta apenas de bactérias. As mutações que estão presentes em cepas axénica perturbam Ras sinalização, causando excessiva macropinocitose necessários para a alimentação e prejudicam a migração celular, o que confunde a interpretação de transdução de sinal e quimiotaxia experimentos nessas cepas. Tentativas anteriores de manipular geneticamente células não-axénica tem desrespeitado eficiência e procedimentos experimentais complexos necessários. Nós desenvolvemos um protocolo de transfeccao simples que, pela primeira vez, supera estas limitações. Essas séries de grandes melhorias de genética molecular de Dictyostelium permitam selvagem-tipo pilhas ser manipulada tão facilmente como cepas padrão de laboratório. Além das vantagens para estudar processos de sinalização e motilidade incorrupto, mutantes que interrompem o crescimento baseado em macropinocitose agora podem ser facilmente isolados. Além disso, o fluxo de trabalho inteiro do transfection é grandemente acelerado com células recombinantes que podem ser geradas em dias em vez de semanas. Outra vantagem é que genética molecular mais podem ser realizadas com amostras de Dictyostelium selvagem-tipo recentemente isoladas do ambiente. Isso pode ajudar a alargar o âmbito das abordagens utilizadas nestas áreas de investigação.

Extracromossômico plasmídeos são utilizados para estudos de repórter, que visam identificar a localização de certas proteínas dentro de uma célula ou alterações na estrutura celular das células mutantes. Para muitas abordagens, tais como controlo do ciclo celular, é fundamental expressar dois repórteres ao mesmo tempo. Isso agora é possível usando o nosso sistema de plasmídeo extracromossômico repórter dual (tabela 1). No dia 1, as células foram transfectadas antes de adicionar o marcador selecionável G418 após 5 h (Figura 1). No exemplo, NC4, DdB, Ax2 e os isolados selvagens independentemente derivados, V12M2 e WS2162 (complementar a tabela 1) foram transfectadas com o plasmídeo pPI289, que codifica para GFP-TubulinA, um marcador para microtúbulos e mCherry-PCNA, uma proteína que é usado para o monitoramento do ciclo celular(Figura 2). Após 32 h, as células foram observadas ao microscópio. A maioria das células expressa de ambas as proteínas da fusão fluorescente-etiquetadas, consistente com as anteriores relatórios essa expressão de dois jornalistas dos mesmo plasmídeo mostra expressão níveis semelhantes, que é quase impossível quando usando dois diferentes plasmídeos 18,19. Uma célula representativa para cada linha de celular (NC4, DdB, Ax2, V12M2 e WS2162), expressar o repórter dual desejado é mostrado na Figura 2B. As eficiências de transfeccao estão resumidas na Figura2C. NC4-derivado de célula linhas mostram as melhores eficiências de transfeccao. No entanto, para linhas de células V12M2 e WS2162, obteve-se um número consideravelmente elevado de transfectants.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig2.jpg"> Figura 2 : Expressão de um plasmídeo extracromossômico. (A) extracromossômico plasmídeos são diretamente transfectados em forma circular. Por exemplo, é mostrado o repórter dual pPI289. Os sites MIV ONGindicam a inserção do segundo repórter no plasmídeo de expressão extracromossômico. (B) Z-projeção de uma célula representante expressando GFP-TubulinA (citoplasmática) e mCherry-PCNA (em grande parte nuclear) para cinco linhas diferentes selvagem-tipo de pilha usada (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C) o transfeccao eficiências para as linhas de cinco célula retratadas em (B) foram calculadas. É mostrada a média dos dois experimentos. Barras de erro indicam ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Integração de um vetor de direcionamento em um locus genômico especificado é mais desafiador e exige uma análise mais cuidadosa da linhagem celular gerada. Na Figura 3, um act5- mCherry KI em NC4 é tentada. Primeiro, o plasmídeo deve ser linearizado para aumentar a frequência de eventos de recombinação seguindo do transfection. Por isso, o pDM1514 de plasmídeo é cortado com ONGMIV. Duas bandas são obtidas depois de executar o resumo em um gel de agarose. A banda de 4127 bp contém a construção desejada (Figura 3). Para transfeccao, o DNA digerido deve ser extraído do gel e purified usando um kit de extração de gel seguindo as instruções do fabricante.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig3.jpg"> Figura 3 : Preparação de act5 bater e DNA para transfeccao. Um exemplo do uso de um agir5 bata no pDM1514 o plasmídeo é mostrado. As etapas de preparação estão listadas a seguir. (A) antes de eletroporação, linearizar o plasmídeo usando os sites MIV ONGindicados. (B, C) Execute o plasmídeo cortado em um gel de agarose, até que as duas bandas esperadas são devidamente separadas. Cortar a banda de bp 4127 contendo o brasão de recombinação, mCherry e a resistência-gaveta, e gel de extrair o DNA. O DNA está agora pronto para transfeccao. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O DNA purificado foi usado para transfeccao de células NC4. Depois de 5-6 dias de seleção, foram obtidos clones. Representante do transfection eficiências e a quantidade de clones identificados positivos para vários act5 bater-em tentativas estão resumidos na tabela 3. Dois clones de transfection NC4 foram aleatoriamente escolhidos e analisados por PCR(Figura 4), e ambos mostraram os padrões de banda prevista esperado de um batida-no e mais foram validados com análise de Southern blot para garantir uma integração única evento da construção para o genoma de20. O Borrão mostra uma integração clara único no locus a desejada act5 (Figura 4B). A linha de celular gerada NC4::act5-mCherry agora pode ser usada em experimentos.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig4.jpg"> Figura 4 : Validação de act5- mCherry KIs no NC4. (A) esquema e controle PCRs para a validação das integrações positivas em act5 locus. Os primers indicados foram usados para analisar dois clones independentes e o pai. Ambos os clones mostram as bandas esperadas para a resistência-gaveta e a jusante (P1) ou montante da primeira demão (P2), que não estão presentes na estirpe parental. A combinação da primeira demão (P1/P2) confirma a integração correta de gaveta mCherry e resistência para o locus act5 . O selvagem-tipo NC4 mostra a banda de bp de 2800 esperado, enquanto os dois clones KI faltam essa banda e em vez disso, exibir um produto PCR cerca de 1400 maiores de pares de bases. (B) esquema para a restrição usados digest e Southern blot. Ambos os clones de bater-se em mostram a menor banda de bp 3400, que é o resultado da integração da construção para o locus agir5, especificamente adicionais do Bcleu site na gaveta hptII resistência. Os shows do selvagem-tipo controle o esperado kb 5,8 resultantes de dois localizado a jusante Bclde sites. O Borrão foi cortado e emendado pela clareza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>construção orientada para o locus act5</td>
			<td>nome do plasmídeo</td>
			<td>número de ocupados poços</td>
			<td>número de clones verificados</td>
			<td>Clones positivos</td>
			<td>Corretas clones (%)</td>
			<td>Dictyostelium estirpes utilizadas</td>
			<td>eficiência de transfeccao (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µ. g DNA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-mCherry</td>
			<td>pPI226</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>14.2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-GFP</td>
			<td>pPI227</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>5</td>
			<td>41,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>6 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>66,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1,5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1,5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>66</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td>55,5</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.3 x 10 ^ -5</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>221</td>
			<td>12</td>
			<td>10</td>
			<td>83,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.1 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1,5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>85,7</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>70</td>
			<td>DdB</td>
			<td>5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>240</td>
			<td>12</td>
			<td>11</td>
			<td>91,6</td>
			<td>DdB</td>
			<td>1.2 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>320</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>100</td>
			<td>NC4</td>
			<td>1.6 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Transfection eficiências e a quantidade de obtidos transfectants positivo para a geração de act5 KIs em fundos de estirpe diferente 22 .
O locus de agir5 oferece a expressão relativamente homogênea do repórter integrada21. As células de NC4::act5-mCherry geradas permitam experiências de mistura com outros act5 batida-ins usando uma proteína fluorescente diferente como GFP. Para enfatizar a grande vantagem deste sistema, são mostrados experimentos misturando com Ax2::act5-GFP . Devido à impossibilidade de transfect não-axénica selvagem-tipo pilhas, este tipo de abordagem não pôde ser realizado antes. Experimentos de mistura são uma ferramenta importante para analisar o comportamento da célula, porque eles permitem uma comparação direta entre linhas de células diferentes, experimentando condições experimentais idênticas. NC4 células crescem mais rápido em gramados bacterianos do que células Ax2 (Figura 5A). Isto pode ser devido a uma maior capacidade de fagocitar bactérias ou melhorada capacidade de mover e mostrar a quimiotaxia para uma fonte de alimento. Usando um ensaio do chemotaxis de folato Under agar, comparação direta de uma população de NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP foi realizada, mostrando que a NC4::act5-mCherry são muito mais eficientes na detecção de ácido fólico. Após 4 h, mais NC4::act5-mCherry de células foram capazes de rastejar sob o agarose de células Ax2::act5-GFP (Figura 5B). Analisar métricas padrão da quimiotaxia das células migrando sob o agarose revelou que as células de NC4::act5-mCherry foram mais rápido e mostraram resposta quimiotático mais forte do que células Ax2::act5-GFP (Figura 5C-E ).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig5.jpg"> Figura 5 : Usando o KIs agir5 para experiências de mistura de quimiotaxia baseada em imagem. (A) NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP expressando a proteína fluorescente indicada do locus agir5 foram analisados para a capacidade de crescer em um gramado bacteriano. Após 4 dias, foram medidos o diâmetro de placa surgido a partir de células de Dictyostelium chapeadas solitárias. Non-axénica act5:: NC4 células fazer placas significativamente maiores do que axénica células de Ax2::act5-GFP (média ± DP, * * * p < 0,0001, n = 3, escala bar 5 mm). (B) para uso da quimiotaxia de folato sob-agarose ensaio22 para comparar diretamente as habilidades Quimiotáticos dos NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP usado no (A), bactérias-crescido amibas de ambas as cepas foram misturadas na proporção de 50: 50. As células foram autorizadas a rastejar sob o agarose. Após 4 h, as células que estavam migrando para o gradiente de folato foram fotografadas usando um microscópio confocal. O número de células de NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP foi então determinado. NC4::act5-mCherry células foram mais eficientes na detecção de ácido fólico. Sobre 10 vezes mais NC4::act5-mCherry células foram encontradas em comparação com as células Ax2::act5-GFP (média ± DP, * * * p < 0,0001, n = 6, escala bar 100 µm). (C, D) As células foram filmadas por 60 min, e sua velocidade e índice de quimiotático foram calculados. Após a pré-selecção das células chemotactically mais responsivos (somente aqueles que migraram sob o agarose), Ax2::act5-GFP células apresentaram valores inferiores para velocidade de célula e quimiotaxia. Foram analisadas 50 células por linha celular. (média ± DP, * 0,01 < p, n = 3). (E) as faixas de NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFPact5 bate-ins são plotadas mais de 60 min, mostrando o movimento mais direcionado para a fonte de chemoattractent das células NC4::act5-mCherry (média ± DP, * * * p < 0,0001, n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As linhas de batida-na célula act5 também podem ser usadas por citometria de fluxo. Com o crescimento de bactérias, existem grandes diferenças de desenvolvimento entre cepas axénica e selvagem-tipos não-axénica. Após o desenvolvimento, os corpos frutíferos dos NC4 as células são aproximadamente duas vezes tão grandes quanto aqueles derivados de células Ax2. Se as células são misturadas, um corpo de frutificação tamanho intermediário é obtido. Para analisar a contribuição de ambas as linhas celulares mais quantitativamente, citometria de fluxo foi usada. Essas análises mostraram claramente que os corpos frutíferos de tamanho intermediário são devido aos diferentes níveis de contribuição de ambas as linhas de célula. Enquanto as células de NC4::act5-mCherry é composta por cerca de 75% dos esporos medidos, Ax2::act5-GFP contribuiu com apenas 25%, revelando uma potencial vantagem de aptidão para estirpes não-axénica (Figura 6). Desde que a análise não monitora a população da pilha de haste, existem duas possibilidades para explicar o desequilíbrio no desenvolvimento entre Ax2 e NC4. Uma possibilidade é que células Ax2 contribuam principalmente para a população da pilha de haste, ao invés de inserir a população celular do esporo. Como alternativa, mais células NC4 podem entrar no ciclo de desenvolvimento, com Ax2 relativamente atrasado, e são consequentemente incapazes de contribuir para a montagem de um corpo frutífero. A possibilidade de transfect não-axénica selvagem-tipo pilhas desenvolve ainda outras abordagens e simplifica procedimentos experimentais.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig6.jpg"> Figura 6: ato5 KIs permitem a análise das experiências de mistura usando citometria de fluxo. (A) NC4::act5-mCherry e Ax2::act5-GFP foram desenvolvidos separadamente ou em uma mistura de 50: 50 em placas de ágar não-nutriente. NC4::act5-mCherry células formam corpos frutíferos maiores do que Ax2::act5-GFP. Em vez disso, o mix mostra um tamanho intermediário (escala bar 5 mm). Microscopia de fluorescência confocal luz sugere uma maior quantidade de esporos de NC4::act5-mCherry nas cabeças dos esporos derivados de misturas. (B) para quantificar esta observação, os montantes de esporos no spore colhido cabeças da mistura experimental no (A) foram analisadas por citometria de fluxo. Cerca de 75% dos esporos originou-se de células de NC4::act5-mCherry , com apenas 25% de células Ax2::act5-GFP . (C) representante distribuição de esporos de ambas as linhas de célula mostradas em uma dispersão de citometria de fluxo. Cerca de 0,05% mostrar positivo mCherry e GFP sinaliza, sugerindo que os processos de fusão parassexuais ocorreram ou que esporos são colam uns aos outros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Linha celular</td>
			<td>Geneticamente, fundo</td>
			<td>Número de referência</td>
			<td>Publicado antes</td>
			<td>Tipo</td>
		</tr>
<tr>
<td>AX2 (Ka)</td>
			<td></td>
			<td>DBS0235521</td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>tipo selvagem</td>
		</tr>
<tr>
<td>NC4 (S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>tipo selvagem</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::mCherry Clone 5</td>
			<td>NC4</td>
			<td>HM1912</td>
			<td>Paschke et al, 2018</td>
			<td>batida-em act5</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::GFP 2 Clone</td>
			<td>AX2</td>
			<td>HM1930</td>
			<td>Paschke et al, 2018</td>
			<td>batida-em act5</td>
		</tr>
<tr>
<td>V12M2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>tipo selvagem</td>
		</tr>
<tr>
<td>WS2162</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>tipo selvagem</td>
		</tr>
</tbody></table>Suplementares tabela 1: diferentes cepas de Dictyostelium estudou.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Engenharia genética de células de Dictyostelium discoideum com base na seleção e crescimento de bactérias

Dictyostelium discoideum é um organismo modelo popular para o estudo de complexos processos celulares como migração celular, endocitose e desenvolvimento. O utilitário do organismo está dependente da viabilidade de manipulação genética. Aqui, apresentamos métodos para transfect células de Dictyostelium discoideum que superar limitações existentes de cultivo de células em meio líquido.

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

O valor deste protocolo é que permite que quase qualquer cepa de dictyostelium discoideum seja manipulada pela genética molecular, independentemente de essa cepa crescer axenicamente em meio líquido ou não. A outra vantagem dessa técnica é que ela é rápida e simples. Transponha para transfectar células com um plasmídeo exocromosomal antes de começar a misturar dictyosteliums.Os resultados já podem ser validados dois dias após a transfecção usando microscopia. É incomum trabalhar com células de dictyostelium e suspensão de bactérias. A visualização ajudará a dar aos experimentadores uma ideia de como as diferentes etapas dos protocolos são realizadas.Demonstrando o procedimento comigo será Soudabeh Imanikia, um pós-doutor do meu laboratório. Para começar, prepare 1000 mililitros de solução de trabalho tampão sorensen com cloreto de magnésio e cloreto de cálcio de acordo com o protocolo de texto. Depois disso, use uma única colônia de k aerogenes para inocular um litro de meio LB.Permita que as bactérias cresçam durante a noite a 37 graus celsius com tremor. Gire as células em dois tubos de centrífuga de 500 mililitros para colher as células. Em seguida, lave as bactérias uma vez com 500 mililitros de tampão.Resuspende a pelota em 20 mililitros de tampão. Use um fotômetro para verificar a densidade óptica da amostra e diluir a amostra com buffer até que a densidade óptica seja de cerca de 100. Depois disso, prepare o tampão de eletroporação H40 de acordo com o protocolo de texto.Cresça aerogenes K para confluência de um meio SM durante a noite à temperatura ambiente. Adicione 400 microliters de suspensão bacteriana a uma placa de ágar SM e espalhe-a uniformemente. Em seguida, pegue um laço estéril e inocula-o com células de dictyostelium e espalhe as células em uma borda da placa.Incubar a placa a 22 graus Celsius por dois dias, para garantir que as zonas de crescimento sejam grandes o suficiente para transfecção. Adicione 10 mililitros de suspensão de aerogene K a uma placa de Petri tratada com cultura de tecido de 10 centímetros. Em seguida, use um laço de inoculação descartável de 10 microliter para raspar as células das zonas de crescimento da placa de cultura.Transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro, contendo tampão H40 gelado. Gire as células por dois segundos a 10.000 vezes a gravidade. Em seguida, descarte o supernasciente e resuspenque as células no buffer H40.Em seguida, adicione 100 microliters das células a um tubo contendo um a dois microgramas de DNA. Pipeta para cima e para baixo para misturar e transferir a mistura de DNA celular para um cuvette de eletroporação pré-refrigerado. Não adicione mais de dois microgramas de DNA.Maior concentração de DNA são tóxicas para as células e reduzem a eficiência. Após a eletroporação, transfira imediatamente as células para uma placa de Petri preparada de 10 centímetros e permita que as células se recuperem por cinco horas. Para selecionar um transfetante para um knock-out, knock-in, ou um ato cinco knock-in, desprender as células da placa de Petri por pipetizar líquido sobre a superfície.Em seguida, configure três diluições do agente seletivo de acordo com o protocolo de texto. Finalmente, distribua 150 microliters das diluições preparadas em cada poço de 96 placas de cultura de tecido de fundo plano. Neste protocolo, foi demonstrado um sistema plasmídeo extracromosomal de repórter duplo.32 horas após a transfecção, a maioria das células expressou ambas as proteínas de fusão rotuladas fluorescentes. Um ato de cinco M cherry knock-in e um NC4 também foi tentado. Duas bandas foram obtidas depois de executar o digestão em um gel de agarose.A banda de par de base 4127 contém a construção desejada. O DNA purificado foi usado para a transfecção de células NC4. Dois clones da transfecção NC4 foram analisados via PCR e ambos mostraram os padrões de banda previstos.A mancha sulista foi então usada para validar os resultados da PCR. O NC4 cresceu mais rápido em gramados bacterianos do que as células Ax2. Depois de quatro horas, mais células NC4 foram capazes de rastejar sob a agarose do que as células Ax2.As células NC4 eram mais rápidas e apresentavam resposta quimotactica mais forte ao folato do que as células Ax2. Use sempre células de placas SM recém-configuradas. Nunca use células com mais de quatro dias, caso contrário a eficiência cairá.Cepas de HAP brancas recém-isoladas, não atenuantes, são comumente usadas para abordar questões relativas a um comportamento ruching ou social de dictyosteliums. Nossa permite aplicar genética molecular através desses isolados.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Engenharia genética de um fermento Unconventional para Renewable Biofuel e Produção Biochemical

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Genética

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Avaliação da contaminação de DNA em amostras de RNA com base no ADN ribossómico

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Espectrometria de massa-baseado Proteomics análises usando banco de dados OpenProt para desvendar novas proteínas traduzidas de Frames de leitura abertos não-canônicos

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...