Name: genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00
Duration: 6 min 8 s
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Los autores agradecen el laboratorio Kay para la entrada a este método y la LMB microscopia y flujo cytometry para excelente apoyo científico y técnico. Este trabajo fue financiado por beca de Medical Research Council grant MC_U105115237 a R. R. Kay, BBSRC (biotecnología y Consejo de investigación de ciencias biológicas) BB/K009699/1 R. R. Kay, Cancer Research UK otorgar A15672 a R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z Jonathan R Chubb, y MRC (MC_U12266B) la financiación de la unidad MRC LMCB Universidad de UCL.

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	<li>Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Dictyostelium+discoideum.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum.</a> Development. 138 (3), 387-396 (2011).</li><li>Sussman, R., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Dictyostelium+discoideum+in+axenic+culture.">Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).</li><li>Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+the+Dictyostelium+alpha-actinin+gene+leads+to+an+altered+mRNA+and+lack+of+the+protein.">Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein.</a> The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).</li><li>De Lozanne, A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+Dictyostelium+myosin+heavy+chain+gene+by+homologous+recombination.">Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination.</a> Science. 236, 1086-1091 (1987).</li><li>Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+transient+expression+system+for+Dictyostelium+discoideum.">Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum.</a> Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).</li><li>Knecht, D., Pang, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Dictyostelium+discoideum.">Electroporation of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).</li><li>Wetterauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+strains+of+Dictyostelium+discoideum+can+be+transformed+using+a+novel+selection+cassette+driven+by+the+promoter+of+the+ribosomal+V18+gene.">Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene.</a> Plasmid. 36, 169-181 (1996).</li><li>Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditions+for+the+transformation+of+nonaxenic+Dictyostelium+strains.">Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains.</a> Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).</li><li>Bloomfield, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+controls+macropinocytosis+and+phagocytosis+in+Dictyostelium.">Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP(3)-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Hoeller, O., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+the+absence+of+PIP3+gradients.">Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients.</a> Current Biology. 17, 813-817 (2007).</li><li>Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dictyostelium+RasS+protein+is+required+for+macropinocytosis,+phagocytosis+and+the+control+of+cell+movement.">The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement.</a> Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).</li><li>Schaap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phylogeny+and+evolution+of+morphology+in+the+social+amoebas.">Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas.</a> Science. 314, 661-663 (2006).</li><li>Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+Aggregative+Multicellularity+and+Cell-Cell+Communication+in+the+Dictyostelia.">The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).</li><li>Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+in+social+amoebae+is+mediated+by+allelic+pairs+of+tiger+genes.">Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes.</a> Science. 333 (6041), 467-470 (2011).</li><li>Strassmann, J. E., Queller, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+cooperation+and+control+of+cheating+in+a+social+microbe.">Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).</li><li>Wolf, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+Trade-offs+Result+in+the+Illusion+of+Social+Success.">Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success.</a> Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).</li><li>Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+set+of+small,+extrachromosomal+expression+vectors+for+Dictyostelium+discoideum.">A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum.</a> Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).</li><li>Woznica, D., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under-agarose+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).</li><li>Dubin, M., Nellen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+set+of+tagged+expression+vectors+to+monitor+protein+localisation+and+function+in+Dictyostelium.">A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium.</a> Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).</li><li>de Hostos, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+mutants+lacking+the+cytoskeletal+protein+coronin+are+defective+in+cytokinesis+and+cell+motility.">Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility.</a> Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).</li><li>Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+targeting+of+multiple+genes+in+Dictyostelium.">CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).</li><li>Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+harbours+for+the+integration+of+new+DNA+in+the+human+genome.">Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).</li><li>Rosengarten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaps+and+lulls+in+the+developmental+transcriptome+of+Dictyostelium+discoideum.">Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum.</a> BMC Genomics. 16, 294 (2015).</li><li>Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-mediated+diversification+of+transcriptional+bursting+dynamics+following+gene+duplication.">Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).</li><li>Gebbie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phg2,+a+kinase+involved+in+adhesion+and+focal+site+modeling+in+Dictyostelium.">Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

El uso de células de Dictyostelium no axénicos, tipo salvaje ha sido hasta ahora muy limitado en la investigación molecular. Métodos disponibles para la ingeniería genética de las cepas han carecía de fiabilidad y eficiencia23, previniendo su adopción general. Los materiales generados y protocolos aquí presentados pueden utilizarse para cualquier cepa de D. discoideum independiente de su capacidad para crecer en medio líquido. Cabe mencionar que este protocolo está optimizado para las líneas celulares derivadas de NC4. Eficacias de transfección para las cepas recién aisladas de la naturaleza difieren de NC4, como han observado antes y se muestran aquí para V12M2 y WS21628,9. Las condiciones de la electroporación en particular parecen tener una influencia considerable en la eficiencia de transfección y requieran más optimización para algunas cepas. En general, una cantidad suficiente de transfectants se han observado en todas las cepas probadas hasta ahora, demostrando que estos métodos son viables. El número de positivos transfectants obtenidos utilizando cepas derivadas de NC4 superior en comparación con otras cepas de tipo salvaje no axénicos, pero en todos los casos, se obtiene un número suficiente de transfectants para permitir experimentos adicionales. Esto, además de la simplicidad de nuestro protocolo, es la importante mejora en comparación con anteriores intentos de8,9.
Estos nuevos protocolos no axénicos cubren todos los procedimientos genéticos estándar y añadir otras ventajas, transfecciones pueden realizarse rápidamente y eficientemente en paralelo. Clones positivos pueden obtenerse en días en lugar de semanas, desde el crecimiento en las mitades de las bacterias al tiempo de la división. El flamante plásmidos también trabajar bajo condiciones axénicos y puede usarse sistemáticamente en ambas condiciones de crecimiento, que es otro avance de esta metodología22. Introducidas en el protocolo, el plásmido utilizado para la selección de bacterias tienen necesidades especiales que son cruciales para el éxito de la transfección. En particular, los promotores de los cassettes de expresión y resistencia de conducción son importantes para la exitosa transfección. El uso frecuente act6 (actina 6) promotor24 para la conducción de los cassettes de resistencia o expresión carece de eficacia cuando las células se cultivan en las bacterias. En nuestro sistema de plásmido, el promotor altamente activa act15 (actina 15) impulsa los cassettes de expresión, mientras que los cassettes de resistencia están bajo el control de un promotor de la coA (coactosin A), ambos que son activos en condiciones axénicos y en células cultivadas en las bacterias. Requisitos para la expresión del reportero construye así como knock-in y knock-out construcciones hacen necesario utilizar nuestro repertorio de plásmido, pero lamentablemente limita el uso de vectores ya creado uso ineficiente act6 promotor.
Eficiencia del promotor es especialmente crítico para transfecciones que dependen de un evento de integración individual en el locus genómico correcto. Debido a la mejora de promotores conduce la expresión de genes de resistencia, se produce suficiente proteína de resistencia de integraciones de locus único. Una de las principales preocupaciones era favorecer integraciones múltiples en el genoma con Higromicina G418 como se describe. No favoreciendo de integraciones múltiples se ha observado hasta ahora, según lo divulgado previamente para G418 selecciones con mayor promotor de sistemas25. Esto significa que tanto Higromicina y G418 son convenientes marcadores seleccionables para la generación de limpia knock-out y knock-pulg por desgracia, no funciona el marcador seleccionable blasticidin condiciones no axénicos. Esto es una desventaja importante de nuestro método, puesto que los cassettes de resistencia de blasticidin se utiliza habitualmente para generar constructos de knock-out en D. discoideum. Construcciones que ya se generaron con cintas de resistencia de blasticidin deberá ser rederived utilizando uno de los marcadores seleccionables realizables. Otra posibilidad para superar esta limitación es combinar el recientemente establecido axénicos D. discoideum CRISPR tecnología con este protocolo de la transfección del26. La generación de adecuados, solo guía RNAs (sgRNAs) es más simple y más rápido que la reconstrucción de construcciones de knock-out completadas. Para las direcciones futuras, la posibilidad de generar múltiples knock-outs usando CRISPR/Cas9 combinado con este protocolo de la transfección es atractiva y puede allanar el camino para muchos investigadores en la comunidad de Dictyostelium . Sin embargo, la viabilidad del sistema de expresión transitoria establecida por CRISPR/Cas9 en células cultivadas axénicos debe examinarse cuidadosamente.
El act5 knock-in sistema presentado ofrece un sistema de integración fiable y seguro para la generación de líneas celulares estables de D. discoideum, con la ventaja de sitios similares en otros organismos22. También depende de un evento de integración única en el genoma y ofrece muchas posibilidades para las direcciones de investigación. El promotor act5 fuertemente activo y garantiza la expresión casi homogénea27 independiente de las condiciones de cultivo. Las proteínas fluorescentes reportero pueden integrarse fácilmente en este lugar de refugio utilizando la ingeniería dirigida a plásmidos. Esto puede ser útil, por ejemplo, para propósitos de seguimiento de la célula, como se muestra aquí en un experimento de mezcla. Las células muestran variabilidad mínima expresión de célula a célula, que puede ayudar en el seguimiento automatizado de la célula. Lo importante, la inserción de una secuencia deseada en el lugar geométrico de actuar5 aparece fenotípicamente neutro28,29. Como la expresión no depende de un marcador seleccionable para mantener la expresión de la proteína, como se ve en integrantes al azar o Extracromosómica vector teniendo líneas de celulares, el sistema act5 puede ser útil para experimentos de rescate. Puesto que las líneas celulares son homogéneas, todas las células pueden ser analizadas. Esto no es posible utilizar un plásmido extracromosómico de expresión, en el que hay una gran heterogeneidad en la expresión.
Además de estas mejoras en general para todas las cepas, la capacidad para utilizar las células de tipo salvaje no axénicos de investigación molecular permite una evaluación de los efectos de las mutaciones acumuladas en cepas de laboratorio actuales. Los cambios genéticos múltiples se ha encontrado desde la adopción de la cepa Ax2 en 1970, como muestra de análisis de microarrays previamente publicados26. Se observan fenotipos sintéticos debido a la presencia de estas mutaciones. Por ejemplo, un mutante divulgado phg2 muestra disminución de la adherencia en un fondo de cepa de laboratorio y mayor adherencia en otros3. Estos datos contradictorios pueden resolverse ahora repitiendo el experimento en la cepa de antepasado común (en este caso, DdB). La fuerza de este enfoque se ha demostrado recientemente para el GTPase RasS pequeño30,31.
La capacidad para realizar experimentos genéticos en cualquier cepa de D. discoideum amplía el potencial de nuevas direcciones de investigación que depende del uso de cepas salvajes, en particular los relacionados con la evolución social, reconocimiento de kin y el22del ciclo sexual.

El género Dictyostelium son ameba social suelo-que viven que se alimenta principalmente de bacterias. Ser colocado en el phylum Amoebozoa, han aislado un gran número de especies que se pueden agrupar en cuatro clados diferentes1. La especie discoideum de Dictyostelium (D. discoideum) se ha convertido en un organismo popular modelo para estudiar los complejos procesos celulares tales como la migración celular y la fagocitosis. Controlar y estandarizar las condiciones experimentales, axénico celular han desarrollado líneas que son capaces de crecer en medio líquido complejo o definido en la ausencia de bacterias2. De particular importancia son el Ax2, Ax3, y cepas de Ax4, que fueron todos generadas en la década de 1970 y en última instancia deriva de un salvaje solo aislar NC43. Se desarrollaron herramientas para la ingeniería genética en estas cepas axénicos, resultando en la primera eliminatoria Publicada en 19874,5. Protocolos más fueron desarrollados y optimizados para el uso bajo condiciones axénicos6,7.
Adaptación de estos protocolos a tipo salvaje D. discoideum cepas que no son capaces de crecer en caldo líquido se han intentado por varios laboratorios. Sin embargo, no esto es totalmente acertado ya que los protocolos de la transfección son complejos y carecen de eficacia, en parte debido a la capacidad de las bacterias al actuar como un sumidero para los reactivos selectivos8,9. Como resultado, esencialmente todo moleculares datos sobre D. discoideum provienen de descendientes de una sola cepa de tipo salvaje. Hemos querido superar esta limitación y desarrollar un método para modificar genéticamente células de D. discoideum independientes de su capacidad para crecer en medio líquido. La necesidad de un método puede explicarse por la observación que fue asumido en el pasado que las mutaciones permitiendo el crecimiento axénico eran principalmente neutrales y no afectar a fisiología de la célula. Esta suposición sólo es parcialmente correcta. En general, hay dos diferencias notables; en primer lugar, entre los diferentes aislaron axénicos cepas y en segundo lugar, cuando estas cepas axénicos se compararon con aislamientos salvajes no axénicos8,9.
Tal vez el factor más crítico es el clave gen axénico, hachaB, que fue identificado recientemente como RasGAP NF1. La principal función de NF1 como un RasGAP es refrenar Ras actividad3. La supresión de la enzima en todas las cepas axénicos conduce a excesiva actividad de Ras que se manifiesta como la formación de grandes manchas de Ras activadas. Estos parches de Ras ampliados conducen a la acumulación de PIP3 en la membrana plasmática. Los parches que aparecen coincidentes de PIP3 y Ras activa son una plantilla para la formación de una colmena circular que eventualmente se cierra y conduce a la formación de macropinosomes10. La consecuencia es un aumento excesivo de actividad macropinocytic. Macropinocitosis es un proceso impulsado por la actina. Un concurso para citoesqueleto componentes para la formación de pseudópodos o macropinosomes es el resultado. Su impacto en el comportamiento celular se refleja en la casi completa prevención de Quimiotaxis de células vegetativas a folato11. Los parches de PIP3 masivamente agrandados son muy persistentes. Incluso en células hambrientos, los parches de PIP3 quedan y pueden ser malinterpretados como pseudópodos, que pueden causar problemas de interpretación de estudios sobre quimiotaxis al campo.
En algunos casos, la mutación de NF1 es experimentalmente útil. Esto nos lleva a una segunda motivación para el desarrollo de un método de transfección para bacteriano crecido D. discoideum las células, puesto que el aumento en tasa de macropinocitosis hace valiosa para la investigación de los aspectos fundamentales de este proceso12 células axénicos . Sin embargo, la mutación en los genes necesarios para la macropinocitosis, como Ras y PI3 quinasas10, casi han abolido crecimiento axénico, lo que es necesario manipular estas células a través del crecimiento de las bacterias. Otra razón que hace valioso transfecciones basados en bacterias es el creciente uso de Dictyostelids para explorar cuestiones de la evolución de multi-celularidad13,14, reconocimiento kin15,16, y altruista comportamiento celular, que depende principalmente del uso del recientemente aisladas de tipo salvaje17. Todos mencionados investigación puede facilitarse mediante métodos eficientes para la manipulación genética de aislados silvestres, que son no axénicos y no crecen en caldo líquido.
Nuestros protocolos permiten la superación de las limitaciones descritas. Tomados en conjunto, la posibilidad de realizar manipulaciones genéticas con bacteriano crecido beneficios de D. discoideum las células sostiene para todos los investigadores de Dictyostelium , incluso si es sólo el aumento de la velocidad del proceso de selección debido al más rápido crecimiento de la ameba (tiempo de duplicación de 4 h) de bacterias en comparación con el crecimiento en medios axénicos (10 h tiempo de duplicación).

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	<tbody>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-400-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">12823252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EP6331000025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gene Pulser X Cell, including CE &#38; PC modules</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652660</td>
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Safety Cabinet Foruna - SCANLAF</td>
			<td style="width:184px;">Labogene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BioPhotometer Plus</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CLSM 710</td>
			<td style="width:184px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Media &#38; Agaroses</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LoFlo Medium</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LF0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:184px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Low EEO Agarose</td>
			<td style="width:184px;">BioGene</td>
			<td style="width:119px;">300-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Purified Agar</td>
			<td style="width:184px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SM broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">SMB0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2x LB broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LBD0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Chemicals</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HEPES free acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">391340 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">P/4800/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">Na2HPO4 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2 * 6 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">5982 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">CaCl2 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">442909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KOH</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">26668.263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cultur Dishes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5</td>
			<td style="width:184px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:119px;">P50G-1.5-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Geneticin G418-sulphate</td>
			<td style="width:184px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hygromycin B Gold</td>
			<td style="width:184px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Additional Consumables</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2mm gap electroporation cuvettes, long electrode</td>
			<td style="width:184px;">Geneflow Limited</td>
			<td style="width:119px;">E6-0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10 &#181;l Inoculating Loop, Blue 10 Micro L</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">129399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Spreader, L-shaped, sterile</td>
			<td style="width:184px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">730190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Combitips advanced 5 ml</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf BIOPUR</td>
			<td style="width:119px;">30089669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Kits</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ZR Plasmid Miniprep Classic</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D4016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Quick DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zymoclean DNA Recovery Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Enzymes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0482L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td style="width:184px;">TakaraBio</td>
			<td style="width:119px;">R045A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria

Discoideum de Dictyostelium es un intrigante organismo modelo para el estudio de procesos de diferenciación celular durante el desarrollo, señalización de la célula y otras preguntas de biología celular importante. Las tecnologías disponibles para manipular genéticamente células de Dictyostelium están bien desarrolladas. Transfecciones pueden realizarse utilizando diferentes marcadores seleccionables y reciclaje, incluyendo recombinación homóloga y mutagénesis de insertional del marcador. Esto es apoyada por un genoma bien anotado. Sin embargo, estos enfoques están optimizados para líneas celulares axénicos de crecimiento en cultivos líquidos y son difíciles de aplicar a las células de tipo salvaje no axénicos, que sólo se alimentan de bacterias. Las mutaciones que están presentes en cepas axénicos molestar Ras señalización, causando excesiva macropinocitosis, necesaria para la alimentación y afectan la migración celular, que confunde la interpretación de los experimentos de quimiotaxis en esas tensiones y transduction de la señal. Intentos anteriores para manipular genéticamente células no axénicos han carecido de eficiencia y requiere procedimientos experimentales complejos. Hemos desarrollado un protocolo de la transfección simple que, por primera vez, supera estas limitaciones. Ésos serie de grandes mejoras en genética molecular de Dictyostelium permite a las células de tipo salvaje ser manipulado tan fácilmente como las cepas estándar de laboratorio. Además de las ventajas para el estudio de procesos de señalización y motilidad incorruptos, mutantes que interrumpen el crecimiento basado en la macropinocitosis ahora pueden ser fácilmente aislados. Además, el flujo de trabajo de transfección todo se aceleró considerablemente, con células recombinantes que pueden generarse en días en lugar de semanas. Otra ventaja es que genética molecular más puede realizarse con muestras de Dictyostelium tipo salvaje recién aisladas del ambiente. Esto puede ayudar a extender el alcance de los enfoques utilizados en estas áreas de investigación.

Plásmidos extracromosómicos se utilizan para estudios de reportero, que tienen como objetivo identificar la localización de ciertas proteínas dentro de una celda o cambios en la estructura celular de las células mutantes. Para muchos enfoques, tales como control del ciclo celular, es crucial expresar dos periodistas al mismo tiempo. Esto es ahora posible usando nuestro sistema de plásmidos extracromosómicos de reportero dual (tabla 1). El día 1, las células fueron transfectadas antes de añadir el marcador seleccionable G418 después de 5 h (figura 1). En el ejemplo, NC4, DdB, Ax2 y los aislamientos salvajes independientemente derivados V12M2 y WS2162 (complementario tabla 1) fueron transfectadas con el plásmido pPI289, que codifica para GFP-TubulinA, un marcador de microtúbulos y mCherry-PCNA, una proteína que es utilizado para el control del ciclo celular (figura 2A). Después de 32 h, las células fueron observadas bajo el microscopio. La mayoría de células expresa dos proteínas de fusión marcado con fluorescente, consistente con anteriores informes de que la expresión de dos periodistas del mismo plásmido espectáculos similares niveles de expresión, que es casi imposible cuando se utiliza dos diferentes plásmidos 18,19. Una célula representativa para cada línea celular (NC4, DdB, Ax2, V12M2 y WS2162) expresando el reportero dual deseado se muestra en la figura 2B. Las eficacias de transfección se resumen en la figura2C. Líneas celulares derivadas de NC4 muestran las mejores eficacias de transfección. Sin embargo, las líneas celulares V12M2 y WS2162, se obtuvo un número considerablemente alto de transfectants.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig2.jpg"> Figura 2 : Expresión de un plásmido extracromosómico. (A) plásmidos extracromosómicos directamente son transfectadas en forma circular. Por ejemplo, se muestra el reportero doble pPI289. Los sitios MIV ONGindican inserción del segundo reportero en el plásmido de expresión Extracromosómica. (B) Z-proyección de una célula representativa expresando GFP-TubulinA (citoplasmática) y mCherry-PCNA (en gran parte nuclear) para cinco líneas de diferentes células de tipo salvaje utilizado (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). Se calculó la eficiencia (C) la transfección de líneas cinco celulares en (B). Es el promedio de dos experimentos. Barras de error indican ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Integración de un vector que apunta en un locus genómico especificado es más difícil y requiere un análisis más cuidadoso de la línea celular generada. En la figura 3, se trató de un act5- mCherry KI en NC4. En primer lugar, el plásmido debe ser linealizado para aumentar la frecuencia de eventos de recombinación tras la transfección. Para esto, se corta el plásmido pDM1514 con ONGMIV. Dos bandas se obtienen después de ejecuta el compendio en un gel de agarosa. La banda de 4127 bp contiene la estructura deseada (figura 3). Para la transfección, la DNA digerida debe extraerse el gel y purificada utilizando un kit de extracción de gel siguiendo las instrucciones del fabricante.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig3.jpg"> Figura 3 : Preparación de act5 knock y ADN para transfección. Se muestra un ejemplo del uso de un actuar5 golpes en el plásmido pDM1514. A continuación se enumeran los pasos para la preparación. (A) antes de la electroporación, alinear el plásmido usando los sitios indicados de MIV de ONG. (B, C) Ejecutar el plásmido cortado en un gel de agarosa hasta que las dos bandas que se separan correctamente. Cortar la banda de bp 4127 que contiene los brazos de recombinación, mCherry y los cassettes de resistencia, y extracto de gel de la DNA. El ADN está listo para la transfección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El ADN purificado se utilizó para la transfección de células NC4. Después de 5-6 días de la selección, se obtuvieron clones. Eficacias de transfección representativos y la cantidad de clones identificados positivos para act5 varios knock-en intentos se resumen en la tabla 3. Dos clones de la transfección de NC4 aleatoriamente elegidos y analizados por PCR (figura 4A), y demostró los patrones predichos banda espera que de un golpe y se validaron más con el análisis de Southern blot para asegurar una integración única evento de la construcción en el genoma20. La mancha muestra una integración clara sola en el lugar deseado act5 (figura 4B). La línea de celular NC4::act5-mCherry generada puede utilizarse ahora en experimentos.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig4.jpg"> Figura 4 : Validación de act5- mCherry KIs en NC4. (A) esquema y control PCRs para la validación de integración positiva en act5 locus. Los iniciadores indicados fueron utilizados para analizar dos clones independientes y el padre. Ambos clones muestran las bandas esperadas para la resistencia del cassette y aguas abajo (P1) o primer upstream (P2), que no están presentes en la cepa parental. La combinación de la cartilla (P1/P2) confirma la correcta integración de cassettes mCherry y resistencia en el locus act5 . El tipo salvaje NC4 muestra la esperada banda 2800 de bp, mientras que ambos clones KI carecen de esta banda y en su lugar mostrar un producto PCR sobre 1400 pares más grandes. (B) esquema para el Resumen de restricción utilizado y Southern blot. Ambos clones knock-en Mostrar la menor banda 3400 de bp, que es el resultado de la integración de la construcción en el lugar geométrico del acto5, específicamente el adicional Bclsitio en los cassettes de resistencia Higromicina. La muestra de control de tipo salvaje el kb 5,8 esperado resultantes de los dos situados aguas abajo Bclsitios. La mancha blanca /negra fue recortada y empalmada para mayor claridad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>construcción específica en el locus act5</td>
			<td>nombre de plásmido</td>
			<td>número de pozos ocupados</td>
			<td>número de clones facturados</td>
			<td>Clones positivos</td>
			<td>Clones correcto (%)</td>
			<td>Dictyostelium cepa utilizada</td>
			<td>eficiencia de transfección (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 μg ADN)</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-mCherry</td>
			<td>pPI226</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>14.2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-GFP</td>
			<td>pPI227</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>5</td>
			<td>41.6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>6 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>66.6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>66</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td>55.5</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.3 x 10 ^ -5</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>221</td>
			<td>12</td>
			<td>10</td>
			<td>83.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.1 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>85.7</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>70</td>
			<td>DdB</td>
			<td>5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>240</td>
			<td>12</td>
			<td>11</td>
			<td>91.6</td>
			<td>DdB</td>
			<td>1.2 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>320</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>100</td>
			<td>NC4</td>
			<td>1.6 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: eficacia de transfección y la cantidad de obtengan transfectants positivo para la generación de Act5 KIs en fondos de cepa diferente 22 .
El lugar geométrico de actuar5 ofrece expresión relativamente homogénea de la reportera integrado21. Las células NC4::act5-mCherry generadas permiten experimentos de mezcla se realizará con otros act5 knock-ins utilizando una proteína fluorescente diferente como GFP. Para enfatizar la gran ventaja de este sistema, se muestran experimentos de mezcla con Ax2::act5-GFP . Debido a la incapacidad para transfectar las células de tipo salvaje no axénicos, este tipo de enfoque no podría realizarse antes. Experimentos de mezcla son una herramienta importante para analizar el comportamiento de la célula, ya que permiten una comparación directa entre diferentes líneas celulares experimentan idénticas condiciones experimentales. NC4 células crecen más rápido en el césped bacteriano que Ax2 las células (figura 5A). Esto puede ser debido a una mayor capacidad para fagocitar bacterias o mayor capacidad para mover y muestran quimiotaxis hacia una fuente de alimento. Mediante un ensayo de Quimiotaxis de folato bajo agar, comparación directa de una población de NC4::act5-mCherry y Ax2::act5-GFP fue realizada, demostrando que NC4::act5 mCherry son mucho más eficientes en la detección de ácido fólico. Después de 4 h, más células NC4::act5 mCherry pudieron arrastrarse por debajo de la agarosa de las células Ax2::act5-GFP (figura 5B). Analizar métricas estándar de Quimiotaxis de las células que migran en la agarosa reveló que las células NC4::act5-mCherry fueron más rápido y mostraron mayor respuesta quimiotáctica de las células Ax2::act5-GFP (figura 5C-E ).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig5.jpg"> Figura 5 : Usando KIs actuar5 para los experimentos de mezcla de quimiotaxis basada en imágenes. (A) NC4::act5-mCherry y Ax2::act5-GFP expresando la proteína fluorescente indicada desde el locus actúan5 se analizaron para que la capacidad de crecer sobre un césped bacteriano. Después de 4 días, se midió el diámetro de la placa de células de Dictyostelium plateadas solitarias. No axénicos act5:: NC4 células hacen placas significativamente mayores que las células de Ax2::act5-GFP axénicos (media ± SD, *** p < 0.0001, n = 3, la escala de la barra 5 mm). (B) para uso de los chemotaxis de folato bajo agarosa ensayo22 comparar directamente las capacidades quimiotácticas del mCherry NC4::act5 y Ax2::act5-GFP en (A), bacterias-crecido amebas de ambas cepas se mezclaron en una proporción de 50: 50. Las células podían arrastrarse por debajo de la agarosa. Después de 4 h, las células que fueron migrando hacia arriba el gradiente de folato fueron fotografiadas utilizando un microscopio confocal. Luego se determinó el número de células NC4::act5-mCherry y Ax2::act5-GFP . NC4::Act5-mCherry células eran más eficientes en la detección de ácido fólico. Sobre 10 veces más NC4::act5 mCherry se encontraron células en comparación con las células Ax2::act5-GFP (media ± SD, *** p < 0.0001, n = 6, escala de la barra 100 μm). (C, D) Las células fueron filmadas durante 60 min, y se calcularon su velocidad e índice quimiotáctico. Después de la preselección de las células más chemotactically sensibles (sólo los que emigraron bajo el agarosa), Ax2::act5-GFP células mostraron valores más bajos para la velocidad del celular y la quimiotaxis. Se analizaron cincuenta células por línea celular. (media ± SD, * p < 0.01, n = 3). (E) las pistas de NC4::act5-mCherry y Ax2::act5-GFPact5 knock-ins se trazan sobre 60 minutos, mostrando el movimiento más dirigido hacia la fuente de chemoattractent de las células NC4::act5-mCherry (media ± SD, ** * p < 0.0001, n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Las líneas de precipitación en celulares act5 pueden también usarse para citometría de flujo. Como con el crecimiento de bacterias, existen grandes diferencias de desarrollo entre axénicos cepas y wild-tipos no axénicos. Después del desarrollo, la fructificación de NC4 células son aproximadamente dos veces tan grande como los derivados de células Ax2. Si las células se mezclan, se obtiene un cuerpo fructífero tamaño intermedio. Para analizar la contribución de las dos líneas celulares más cuantitativo, se utilizó la citometría de flujo. Estos análisis demostraron claramente que la fructificación de tamaño intermedio son debido a los diferentes niveles de contribución de ambas líneas celulares. Mientras que las células NC4::act5-mCherry compone alrededor del 75% de las esporas medidos, Ax2::act5-GFP contribuyó sólo el 25%, mostrando una ventaja de aptitud potencial para cepas no axénicos (figura 6). Puesto que el análisis no controlar la población de célula de tallo, hay dos posibilidades para explicar el desequilibrio en desarrollo entre Ax2 y NC4. Una posibilidad es que las células Ax2 contribuyen principalmente a la población de célula de tallo, en lugar de entrar en la población de la célula de la espora. Alternativamente, más NC4 células entren en el ciclo de desarrollo, con Ax2 relativamente retrasada, y en consecuencia no pueden contribuir a la Asamblea de un cuerpo fructífero. La posibilidad de transfectar las células de tipo salvaje no axénicos desarrolla además otros enfoques y simplifica enormemente los procedimientos experimentales.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig6.jpg"> Figura 6: ley5 KIs permite análisis de experimentos de mezcla usando el flujo cytometry. (A) NC4::act5-mCherry y Ax2::act5-GFP se desarrollaron por separado o en una mezcla de 50: 50 en placas de agar del no-alimento. NC4::Act5 mCherry células formar grandes cuerpos fructíferos que Ax2::act5-GFP. La mezcla en su lugar muestra un tamaño intermedio (escala de la barra 5 mm). Microscopía confocal de fluorescencia indica una mayor cantidad de esporas NC4::act5 mCherry en las cabezas de espora derivadas de mezclas. (B) para cuantificar esta observación, las cantidades de esporas esporas recolectadas cabezas del experimento mezcla en (A) se analizaron por citometría de flujo. Alrededor del 75% de las esporas originado de las células NC4::act5-mCherry , con sólo el 25% de las células Ax2::act5-GFP . (C) distribución representativa de esporas de ambas líneas celulares que se muestra en una dispersión de citometría de flujo. Aproximadamente 0.05% muestran positivo señales mCherry y GFP, lo que sugiere que se han producido procesos de fusion parasexual o que las esporas están pegando uno al otro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Línea celular</td>
			<td>Fondo genético</td>
			<td>Número de referencia</td>
			<td>Publicado antes de</td>
			<td>Tipo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ax2 (Ka)</td>
			<td></td>
			<td>DBS0235521</td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>tipo salvaje</td>
		</tr>
<tr>
<td>NC4 (S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>tipo salvaje</td>
		</tr>
<tr>
<td>Act5::mCherry 5 clon</td>
			<td>NC4</td>
			<td>HM1912</td>
			<td>Paschke et al., 2018</td>
			<td>Act5 knock-in</td>
		</tr>
<tr>
<td>Act5::GFP clon 2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>HM1930</td>
			<td>Paschke et al., 2018</td>
			<td>Act5 knock-in</td>
		</tr>
<tr>
<td>V12M2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>tipo salvaje</td>
		</tr>
<tr>
<td>WS2162</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>tipo salvaje</td>
		</tr>
</tbody></table>Complementario tabla 1: diferentes cepas de Dictyostelium estudiado.

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Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Ingeniería genética de Dictyostelium discoideum las células basada en selección y crecimiento de las bacterias

Dictyostelium discoideum es un organismo popular modelo para estudiar los complejos procesos celulares tales como la migración celular, la endocitosis y el desarrollo. La utilidad del organismo depende de la viabilidad de la manipulación genética. Aquí, presentamos métodos para transfectar células de Dictyostelium discoideum que superaran las limitaciones existentes de cultivo de células en medios líquidos.

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

El valor de este protocolo es que permite que casi cualquier cepa de dictyostelium discoideum sea manipulada por genética molecular, independientemente de si dicha cepa crecerá axíricamente en medio líquido o no. La otra ventaja de esta técnica es que es rápida y sencilla. Transponer a células transfectales con un plásmido exocromosomal antes de comenzar a mezclar dictyostelios.Los resultados ya se pueden validar dos días después de la transfección mediante microscopía. Es inusual trabajar con células de dictyostelio y suspensión de bacterias. La visualización ayudará a dar a los experimentadores una idea de cómo se realizan los diferentes pasos de los protocolos.Demostrar el procedimiento conmigo será Soudabeh Imanikia, un postdoctorado de mi laboratorio. Para empezar, preparar 1000 mililitros de solución de trabajo de soensen tampón con cloruro de magnesio y cloruro de calcio de acuerdo con el protocolo de texto. Después de esto, utilice una sola colonia de K aerogenes para inocular un litro de medio LB.Permita que las bacterias crezcan durante la noche a 37 grados centígrados con temblores. Gire las células hacia abajo en dos tubos centrífugos de 500 mililitros para cosechar las células. Luego, lave las bacterias una vez con 500 mililitros de tampón.Resuspender el pellet en 20 mililitros de tampón. Utilice un fotómetro para comprobar la densidad óptica de la muestra y diluir la muestra con búfer hasta que la densidad óptica sea de aproximadamente 100. Después de esto, prepare el búfer de electroporación H40 de acuerdo con el protocolo de texto.Crecer K aerogenes para confluir un medio SM durante la noche a temperatura ambiente. Añadir 400 microlitros de suspensión bacteriana a una placa de agar SM y extenderlo uniformemente. Luego, tome un lazo estéril e inocularlo con células de dictyostelio y extienda las células en un borde de la placa.Incubar la placa a 22 grados centígrados durante dos días, para asegurar que las zonas de crecimiento sean lo suficientemente grandes para la transfección. Agregue 10 mililitros de suspensión de a aerogene K a un plato de Petri tratado con cultivo de tejido de 10 centímetros. A continuación, utilice un bucle de inoculación desechable de 10 microlitrotros para raspar las células de las zonas de crecimiento de la placa de cultivo.Transfiera las células a un tubo de 1,5 mililitros, que contiene un tampón H40 helado. Gire las células durante dos segundos a 10000 veces la gravedad. A continuación, deseche el sobrenadante y resusppend las celdas en el búfer H40.A continuación, agregue 100 microlitros de las células a un tubo que contenga de uno a dos microgramos de ADN. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar y transferir la mezcla de ADN celular a una cubeta de electroporación preenfriada. No añada más de dos microgramos de ADN.Una mayor concentración de ADN es tóxica para las células y reduce la eficiencia. Después de la electroporación, transfiera inmediatamente las células a una placa Petri preparada de 10 centímetros y permita que las células se recuperen durante cinco horas. Para seleccionar un transfectante para un knock-out, knock-in, o un acto cinco knock-in, separar las células de la placa Petri pipeteando líquido sobre la superficie.A continuación, configure tres diluciones del agente selectivo de acuerdo con el protocolo de texto. Por último, distribuya 150 microlitros de las diluciones preparadas en cada pocillo de placas de cultivo de tejido plano de 96 pocillos. En este protocolo, se demostró un sistema de plásmido extracromosomico de reportero dual.32 horas después de la transfección, la mayoría de las células expresaban ambas proteínas fluorescentes de fusión etiquetadas. Un acto cinco M cherry knock-in y un NC4 también se intentó. Se obtuvieron dos bandas después de ejecutar el digestor en un gel de agarosa.La banda de par base 4127 contiene la construcción deseada. El ADN purificado se utilizó para la transfección de células NC4. Dos clones de la transfección NC4 fueron analizados a través de PCR y ambos mostraron los patrones de banda predichos.La mancha meridional se utilizó entonces para validar los resultados de la PCR. El NC4 creció más rápido en céspedes bacterianos que las células Ax2. Después de cuatro horas, más de las células NC4 fueron capaces de arrastrarse bajo la agarosa que las células Ax2.Las células NC4 fueron más rápidas y mostraron una respuesta quimiotáctica más fuerte al folato que las células de Ax2. Utilice siempre las células de las placas SM recién configuradas. Nunca utilice celdas de más de cuatro días, de lo contrario la eficiencia disminuirá.Las cepas de HAP blancas, recién aisladas y no extensitivas se utilizan comúnmente para abordar preguntas relacionadas con un ruching o comportamiento social de los dictyosteliums. Nuestro permite aplicar la genética molecular a través de esos aislados.

Research

JoVE Journal

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