Name: genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Författarna tackar Kay lab för indata till denna metod och LMB mikroskopi och flöde flödescytometri faciliteter för utmärkt vetenskapligt och tekniskt stöd. Detta arbete finansierades av medicinska forskningsrådet grant MC_U105115237 R. R. Kay, BBSRC (bioteknik och biologiska Sciences Research Council) grant BB/K009699/1 R. R. Kay, Cancer Research UK bevilja A15672 till R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z till Jonathan R Chubb och MRC finansiering (MC_U12266B) till MRC LMCB universitet enheten vid UCL.

<ol>
	<li>Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Dictyostelium+discoideum.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum.</a> Development. 138 (3), 387-396 (2011).</li><li>Sussman, R., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Dictyostelium+discoideum+in+axenic+culture.">Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).</li><li>Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+the+Dictyostelium+alpha-actinin+gene+leads+to+an+altered+mRNA+and+lack+of+the+protein.">Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein.</a> The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).</li><li>De Lozanne, A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+Dictyostelium+myosin+heavy+chain+gene+by+homologous+recombination.">Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination.</a> Science. 236, 1086-1091 (1987).</li><li>Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+transient+expression+system+for+Dictyostelium+discoideum.">Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum.</a> Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).</li><li>Knecht, D., Pang, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Dictyostelium+discoideum.">Electroporation of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).</li><li>Wetterauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+strains+of+Dictyostelium+discoideum+can+be+transformed+using+a+novel+selection+cassette+driven+by+the+promoter+of+the+ribosomal+V18+gene.">Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene.</a> Plasmid. 36, 169-181 (1996).</li><li>Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditions+for+the+transformation+of+nonaxenic+Dictyostelium+strains.">Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains.</a> Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).</li><li>Bloomfield, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+controls+macropinocytosis+and+phagocytosis+in+Dictyostelium.">Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP(3)-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Hoeller, O., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+the+absence+of+PIP3+gradients.">Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients.</a> Current Biology. 17, 813-817 (2007).</li><li>Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dictyostelium+RasS+protein+is+required+for+macropinocytosis,+phagocytosis+and+the+control+of+cell+movement.">The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement.</a> Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).</li><li>Schaap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phylogeny+and+evolution+of+morphology+in+the+social+amoebas.">Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas.</a> Science. 314, 661-663 (2006).</li><li>Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+Aggregative+Multicellularity+and+Cell-Cell+Communication+in+the+Dictyostelia.">The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).</li><li>Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+in+social+amoebae+is+mediated+by+allelic+pairs+of+tiger+genes.">Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes.</a> Science. 333 (6041), 467-470 (2011).</li><li>Strassmann, J. E., Queller, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+cooperation+and+control+of+cheating+in+a+social+microbe.">Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).</li><li>Wolf, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+Trade-offs+Result+in+the+Illusion+of+Social+Success.">Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success.</a> Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).</li><li>Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+set+of+small,+extrachromosomal+expression+vectors+for+Dictyostelium+discoideum.">A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum.</a> Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).</li><li>Woznica, D., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under-agarose+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).</li><li>Dubin, M., Nellen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+set+of+tagged+expression+vectors+to+monitor+protein+localisation+and+function+in+Dictyostelium.">A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium.</a> Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).</li><li>de Hostos, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+mutants+lacking+the+cytoskeletal+protein+coronin+are+defective+in+cytokinesis+and+cell+motility.">Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility.</a> Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).</li><li>Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+targeting+of+multiple+genes+in+Dictyostelium.">CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).</li><li>Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+harbours+for+the+integration+of+new+DNA+in+the+human+genome.">Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).</li><li>Rosengarten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaps+and+lulls+in+the+developmental+transcriptome+of+Dictyostelium+discoideum.">Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum.</a> BMC Genomics. 16, 294 (2015).</li><li>Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-mediated+diversification+of+transcriptional+bursting+dynamics+following+gene+duplication.">Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).</li><li>Gebbie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phg2,+a+kinase+involved+in+adhesion+and+focal+site+modeling+in+Dictyostelium.">Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter avslöja.

Användning av icke-axenic, vildtyp Dictyostelium celler har varit mycket begränsad hittills i molekylär forskning. Tillgängliga metoder för genetisk modifiering av dessa stammar har saknat tillförlitlighet och effektivitet23, hindrar deras allmänna antagandet. De genererade material och protokoll som presenteras här kan användas för någon D. discoideum stam oberoende av dess förmåga för att växa i flytande medium. Det bör nämnas att detta protokoll är optimerad för NC4-derived cellinjer. Transfection effektivitetsvinster för färska isolerade stammar från vilt skiljer sig från NC4, så vi har iakttagits före och visas här för V12M2 och WS21628,9. Elektroporation villkoren i synnerhet verkar ha ett avsevärt inflytande på transfection effektivitetsvinster och kan kräva ytterligare optimering för vissa stammar. I allmänhet, en tillräcklig mängd av transfectants har observerats i alla stammar testat hittills visar att dessa metoder är fungerande. Antalet positiva transfectants som erhållits med NC4-derived stammar är högre jämfört med andra icke-axenic vildtyp-stammar, men i alla fall, erhålls tillräckligt antal transfectants för att tillåta att ytterligare experiment. Detta, plus enkelheten i våra protokoll, är det stor förbättring jämfört med tidigare försök8,9.
Dessa nya icke-axenic protokoll täcka alla genetiska standardförfaranden och lägga till ytterligare fördelar, eftersom transfections kan utföras snabbt och effektivt parallellt. Positiva kloner kan erhållas i dagar i stället för veckor, eftersom tillväxt på bakterier halvor division tiden. De nyinrättade plasmidsna också arbeta under axenic förhållanden och kan rutinmässigt användas under båda tillväxt villkorar, som är en annan befordran av denna metodik22. Införts i protokollet plasmiden används för selektion på bakterier har särskilda krav som är avgörande för framgången för transfection. I synnerhet är tillskyndarna körning uttrycket och motstånd korgarna viktiga för framgångsrik transfection. Används ofta act6 (aktin 6) arrangören24 för körning motstånd eller uttryck korgarna saknar effektivitet när cellerna odlas på bakterier. I vårt plasmid system kör högaktiv act15 (aktin 15) arrangören alla uttryck kassetter, medan motstånd kassetterna är under kontroll av en coA (coactosin A) arrangören, som båda är aktiva under axenic förhållanden och celler odlas på bakterier. Krav för uttrycket av reporter konstruerar samt inpressning och knock-out konstruktioner gör det nödvändigt att använda vår plasmid repertoar, men tyvärr begränsar användningen av vektorer som redan skapats som använder ineffektiva act6 arrangören.
Arrangören effektivitetsvinsterna är särskilt kritiska för transfections som beror på en enda integration händelse till den rätta genomisk locus. På grund av vår förbättring av initiativtagare körning uttrycket motstånd genen, produceras tillräckligt motstånd med protein från single locus integrationer. Ett stort bekymmer var den gynnar av flera integrationer i genomet när du använder hygromycin eller G418 som beskrivs. Ingen gynnar av flera integrationer har observerats hittills, som tidigare rapporterats för G418 val med hjälp av äldre arrangören system25. Detta innebär att både hygromycin och G418 är lämplig valbara markörer för generering av ren knock-outs och knock-ins. Tyvärr, den valbara markör blasticidin fungerar inte på icke-axenic villkor. Detta är en stor nackdel med vår metod, eftersom blasticidin motstånd kassett används rutinmässigt för att generera knock-out konstruktioner i D. discoideum. Konstruktioner som genererades redan med blasticidin motstånd kassetter kommer att behöva vara rederived med en av de fungerande valbara markörerna. En annan möjlighet att övervinna denna begränsning är att kombinera den nyligen inrättade axenic D. discoideum CRISPR teknik med denna transfection protokoll26. Generering av lämplig, enda guide RNAs (sgRNAs) är enklare och snabbare än återuppbyggnaden av fullständig knock-out konstruktioner. För framtida inriktningar, möjligheten att generera flera knock-outs med hjälp av CRISPR/Cas9 kombinerat med detta transfection protokoll är tilltalande och kan bana väg för många forskare inom gemenskapens Dictyostelium . Användbarheten av den etablerade övergående uttryck system för CRISPR/Cas9 i axenic odlade celler bör dock undersökas noggrant.
Act5 inpressning systemet presenteras erbjuder en pålitlig och säker integration system för generering av stabil cellinjer i D. discoideum, med fördelen av liknande platser i andra organismer22. Det också beror på en enda integration händelse i genomet och erbjuder många möjligheter till olika forskningsinriktningar. Act5 arrangören är starkt aktiva och garanterar nästan homogent uttryck27 oberoende av odling villkor. Fluorescerande reporter proteiner kan enkelt integreras i denna fristad locus använder de bakåtkompilerade inriktning plasmidsna. Detta kan vara användbart, exempelvis för cell-spårning ändamål, som visas här i en mix experiment. Cellerna visar minimal cell till cell uttryck variationer, som kan bistå i automatiserade cell tracking. Ännu viktigare, visas införandet av en önskad sekvens till det agera5 locus fenotypiskt neutrala28,29. Som uttrycket inte beror på en valbar markör att upprätthålla proteinuttryck, som sett i slumpmässiga integrants eller extrachromosomal vector-bärande cellinjer, kan act5 systemet vara användbar för räddning experiment, samt. Eftersom cellinjer är homogen, kan alla celler analyseras. Detta är inte möjligt med en extrachromosomal plasmid för uttryck, där det finns betydande olikheter i uttrycket.
Förutom dessa allmänna förbättringar för alla stammar kan förmågan att använda icke-axenic vildtyp celler för molekylär forskning en bedömning av effekterna av ackumulerade mutationer i nuvarande laboratorie stammar. Flera genetiska rearrangements har hittats sedan antagandet av Ax2 stammen 1970, som framgår av tidigare publicerade microarray analyser26. Syntetiska fenotyper observeras på grund av förekomsten av dessa mutationer. En rapporterad phg2 mutant visar exempelvis minskad friktion i ett laboratorium stam bakgrund och ökad vidhäftning i ytterligare3. Sådana motstridiga uppgifter kan nu lösas genom att upprepa experimentet i gemensamma förfader stam (i detta fall, DdB). Styrkan i detta synsätt har nyligen visat för de små GTPase RasS30,31.
Förmågan att utföra genetiska experiment i någon D. discoideum stam expanderar potentialen i nya forskningsinriktningar som beror på användning av vilda isolat, särskilt de som rör sociala evolution, kin erkännande och den sexuella cykel22.

Släktet Dictyostelium är jord-levande sociala amöba som främst livnär sig på bakterier. Placeras i stammen Amoebozoa, ett stort antal arter har isolerats som kan grupperas i fyra olika klader1. Arten Dictyostelium discoideum (D. discoideum) har blivit en populär modellorganism att studera komplexa cellulära processer såsom cellmigration och fagocytos. Att styra och standardisera försöksbetingelser, axenic cell linjer har utvecklats som kan växa i komplexa eller definierade flytande medium i avsaknad av bakterier2. Särskilt viktiga är Ax2, Ax3, och Ax4 stammar, som alla genereras på 1970-talet och som ytterst härrör från en enda wild isolera NC43. Verktyg för gentekniken utvecklades i dessa axenic stammar, vilket resulterar i den första publicera knockout i 19874,5. Protokoll var ytterligare utvecklad och optimerad för användning under axenic villkor6,7.
Anpassning av dessa protokoll till vildtyp D. discoideum stammar som inte kan växa i flytande buljong har varit försökt flera laboratorier. Detta har dock inte blivit fullt framgångsrik eftersom protokollen transfection är komplexa och saknar effektivitet, delvis på grund av bakterierna förmåga att agera som en diskbänk för selektiva reagens8,9. Som ett resultat, kommer i huvudsak alla molekylär data på D. discoideum från ättlingar till en enda vildtyp-isolat. Vi ville övervinna denna begränsning och utveckla en metod för att genetiskt modifiera D. discoideum celler oberoende av deras förmåga att växa i flytande medium. Behovet av en sådan metod kan förklaras av observationen att det antogs i det förflutna som de mutationer som ger axenic tillväxt var huvudsakligen neutrala och inte försämrar cellfysiologi. Detta antagande är bara delvis korrekt. I allmänhet finns det två anmärkningsvärda skillnader; först, mellan de olika isolerade axenic stammar, och andra, när dessa axenic stammar är jämfört med icke-axenic vilda isolat8,9.
Den mest kritiska faktorn är kanske den viktigaste axenic gen, yxaB, som identifierades nyligen som RasGAP NF1. NF1 som en RasGAP viktigaste funktion är att hindra Ras aktivitet3. Borttagningen av enzym i alla axenic stammar leder till överdriven Ras aktivitet manifesteras som bildandet av stora aktiva Ras fläckar. Dessa utvidgade Ras patchar leda till ansamling av PIP3 i plasmamembranet. Dessa slump visasende fläckar av PIP3 och aktiv Ras är en mall för bildandet av en cirkulär volang som så småningom stänger och leder till bildandet av macropinosomes10. Följden är en överdriven ökning av macropinocytic aktivitet. Macropinocytosis är en aktin-driven process. En tävling för cytoskeletal komponenter för bildandet av antingen macropinosomes eller pseudopods är resultatet. Dess inverkan på cell beteende återspeglas i nästan fullständig förebyggande av chemotaxisna vegetativa celler till folat11. Den kraftigt utvidgade PIP3 fläckar är mycket långlivade. Även i utsvultna celler, PIP3 patchar kvar och kan misstolkas som pseudopods, vilket kan orsaka problem tolka studier på chemotaxis till lägret.
I vissa fall är NF1 mutationen experimentellt användbar. Detta leder oss till en andra motivation för att utveckla en transfection metod för bacterially odlade D. discoideum celler, eftersom ökningen av macropinocytosis hastighet gör axenic celler värdefull för att undersöka grundläggande aspekter av denna process12 . Mutation i de gener som krävs för macropinocytosis, såsom Ras- och PI3-kinaser10, har dock nästan avskaffat axenic tillväxt, vilket gör det nödvändigt att manipulera dessa celler genom tillväxt på bakterier. En annan anledning som återger bakterier-baserade transfections värdefull är den ökande användningen av Dictyostelids att utforska frågor i utvecklingen av flera cellularitet13,14, kin erkännande15,16, och altruistiska cellulära beteende, vilket främst beror på användning av nymalen isolerade vildtyp isolerar17. Alla nämnda forskningsområden kan underlättas genom effektiva metoder för genetisk manipulering av vilda isolat, som är icke-axenic och växer inte i flytande buljong.
Våra protokoll möjliggör att övervinna beskrivna begränsningar. Tillsammans, möjlighet att utföra genetiska manipulationer med bakteriell växt D. discoideum celler rymmer fördelar för alla Dictyostelium forskare, även om det är bara ökad hastighet av urvalsprocessen beror på snabbare tillväxten av amöban (4 h fördubbling tid) på bakterier jämfört med tillväxt i axenic media (10 h fördubbling tid).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:820px;" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Equipment</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-400-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">12823252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EP6331000025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gene Pulser X Cell, including CE &#38; PC modules</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Safety Cabinet Foruna - SCANLAF</td>
			<td style="width:184px;">Labogene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BioPhotometer Plus</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CLSM 710</td>
			<td style="width:184px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Media &#38; Agaroses</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LoFlo Medium</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LF0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:184px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Low EEO Agarose</td>
			<td style="width:184px;">BioGene</td>
			<td style="width:119px;">300-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Purified Agar</td>
			<td style="width:184px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SM broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">SMB0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2x LB broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LBD0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Chemicals</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HEPES free acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">391340 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">P/4800/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">Na2HPO4 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2 * 6 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">5982 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">CaCl2 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">442909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KOH</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">26668.263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cultur Dishes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5</td>
			<td style="width:184px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:119px;">P50G-1.5-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Geneticin G418-sulphate</td>
			<td style="width:184px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hygromycin B Gold</td>
			<td style="width:184px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Additional Consumables</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2mm gap electroporation cuvettes, long electrode</td>
			<td style="width:184px;">Geneflow Limited</td>
			<td style="width:119px;">E6-0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10 &#181;l Inoculating Loop, Blue 10 Micro L</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">129399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Spreader, L-shaped, sterile</td>
			<td style="width:184px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">730190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Combitips advanced 5 ml</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf BIOPUR</td>
			<td style="width:119px;">30089669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Kits</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ZR Plasmid Miniprep Classic</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D4016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Quick DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zymoclean DNA Recovery Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Enzymes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0482L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td style="width:184px;">TakaraBio</td>
			<td style="width:119px;">R045A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria

Dictyostelium discoideum är en spännande modellorganism för att studera cell differentiering processer under utveckling, cell signalering och andra viktiga cellulära biologi-frågor. Teknikerna som finns att genetiskt manipulera Dictyostelium celler är välutvecklade. Transfections kan utföras med olika valbara markörer och markör åter Cykling, inklusive homolog rekombination och insertionsmutationer. Detta stöds av en väl kommenterad genomet. Men dessa metoder är optimerade för axenic cellinjer som växer i flytande kulturer och är svåra att tillämpa icke-axenic vildtyp cellerna, vilket foder endast på bakterier. De mutationer som finns i axenic stammar stör Ras signalering, orsakar överdriven macropinocytosis krävs för utfodring och försämra cellmigration, som förvirrar tolkningen av signaltransduktion och chemotaxisna experiment i dessa stammar. Tidigare försök att genetiskt manipulera icke-axenic celler har saknat effektivitet och krävs komplexa experimentella procedurer. Vi har utvecklat ett enkelt transfection protokoll som, för första gången, övervinner dessa begränsningar. De serier av stora förbättringar till Dictyostelium molekylär genetik tillåta vildtyp celler att manipuleras så enkelt som standard laboratorie stammar. Utöver fördelarna för att studera okorrumperade signalering och motilitet processer, kan mutanter som stör macropinocytosis-baserade tillväxt nu lätt isolerade. Dessutom är hela transfection arbetsflödet avsevärt snabbare, med rekombinant celler som kan genereras i dagar snarare än veckor. En annan fördel är att molekylär genetik ytterligare kan utföras med nymalen isolerade vildtyp Dictyostelium prover från miljön. Detta kan bidra till att utvidga tillämpningsområdet för metoder som används inom dessa forskningsområden.

Extrachromosomal plasmider används för reporter studier, som syftar till att identifiera lokaliseringen av vissa proteiner inuti en cell eller förändringar i cellstruktur av mutanta celler. För många metoder, såsom kontroll av cellcykeln, är det avgörande att uttrycka två reportrar samtidigt. Detta är nu möjligt med hjälp av vår dubbla reporter extrachromosomal plasmid system (tabell 1). Dag 1, var celler transfekterade innan du lägger den valbara markören G418 efter 5 h (figur 1). I exemplet, NC4, DdB, Ax2 och självständigt härledda vilda isolaten V12M2 och WS2162 (kompletterande Tabell1) var transfekterade med de plasmiden pPI289, som kodar för GFP-TubulinA, en markör för mikrotubuli och mCherry-PCNA, ett protein som är används för att övervaka cellcykeln (figur 2A). Efter 32 h observerades cellerna under mikroskopet. Flertalet celler uttrycks både lysrör-märkt fusionsproteinerna, rapporterar konsekvent med tidigare detta uttryck av två reportrar från samma plasmid visar liknande uttryck nivåer, vilket är nästan omöjligt när man använder två olika plasmider 18,19. En representativ cell för varje cellinje (NC4, DdB, Ax2, V12M2 och WS2162) uttrycker önskad dubbla reportern visas i figur 2B. Transfection effektivitetsvinsterna sammanfattas i figur2 C. NC4-derived cellinjer visar de bästa transfection effektivitetsvinsterna. Dock för cellinjer V12M2 och WS2162 erhölls ett betydligt hög antal transfectants.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig2.jpg"> Figur 2 : Uttryck för en extrachromosomal plasmid. (A) Extrachromosomal plasmider är direkt transfekterade i runda form. Som ett exempel visas den dubbla reporter pPI289. NgoMIV webbplatser visar införandet av andra reportern i extrachromosomal uttryck Plasmiden. (B) Z-projektion av en representativ cell uttrycker GFP-TubulinA (Cytoplasmatisk) och mCherry-PCNA (till stor del kärnkraft) för fem olika vildtyp cellinjer används (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C) transfection effektivitetsvinster för de fem cellinjer som avbildas i (B) beräknades. Visas är medelvärdet av två experiment. Felstaplarna visar ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
Integrering av en inriktning vektor i en angiven genomisk locus är mer utmanande och kräver mer noggrann analys av den genererade cell-linjen. I figur 3görs en act5- mCherry KI i NC4. Det första måste plasmiden vara linearized för att öka frekvensen av rekombination händelser efter transfection. För detta skärs de plasmiden pDM1514 med NgoMIV. Två band erhålls efter körs digest på en agarosgel. 4127 bp bandet innehåller den önska bygga (figur 3). För transfection, smält DNA måste extraheras från gelen och renas med en gel utvinning kit följa tillverkarens instruktioner.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig3.jpg"> Figur 3 : Förberedelse av act5 inpressning och DNA för transfection. Ett exempel på användningen av en agera5 inpressning av Plasmiden pDM1514 visas. Anvisningarna för förberedelser är listade enligt följande. (A) innan elektroporation, linjär plasmiden med de angivna NgoMIV sites. (B, C) Kör skär plasmiden på en agarosgel tills de två beräknade banden är korrekt avgränsade. Klipp ut 4127 bp bandet som innehåller rekombination armarna, mCherry och motstånd-kassett och gel extrahera DNA. DNA är nu klar för transfection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Den renade DNA användes för transfection NC4 celler. Efter 5-6 dagar av urval erhölls kloner. Representativa transfection effektivitetsvinster och mängden positiva identifierade kloner för flera act5 inpressning försök sammanfattas i tabell 3. Två kloner av den NC4 transfection var slumpmässigt valt och analyseras med PCR (figur 4A), och båda visade de förutspådda band mönsterna förväntas av en inpressning och validerades ytterligare med Southern blot-analys för att säkerställa en enda integration i händelse av bygga in i genomet20. Blot visar en tydlig inre integration i det önska act5 locus (figur 4B). Den genererade NC4::act5-mCherry -cellinje kan nu användas i experiment.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig4.jpg"> Figur 4 : Validering av act5- mCherry KIs i NC4. (A) system och kontroll primärvården för validering av positiva integrationer till act5 locus. Indikerade primers användes för att analysera två oberoende kloner och förälder. Båda kloner Visa beräknade banden för resistens-kassett och nedströms (P1) eller uppströms primer (P2), som inte är närvarande i föräldrarnas stam. Kombinationen primer (P1/P2) bekräftar korrekt integrering av mCherry och motstånd kassett i det act5 locus. Den vildtyp NC4 visar förväntade 2800 bp bandet, medan både KI kloner saknar detta band och i stället Visa en PCR produkt om 1400 baspar större. (B) system för begagnade begränsning digest och Southern blot. Båda inpressning kloner Visa mindre 3400 bp bandet, som är resultatet av konstruera integreras i det agera5 locus, särskilt den ytterligare Bcljag plats i hygromycin motstånd kassett. Vildtyp kontroll visar den förväntade 5,8 kb som härrör från de två nedströms belägna Bcljag webbplatser. Blot var beskuren och skarvas för tydlighet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>riktade konstruktion i det act5 locus</td>
			<td>plasmid namn</td>
			<td>antal ockuperade brunnar</td>
			<td>antal kontrollerade kloner</td>
			<td>Positiva kloner</td>
			<td>Rätt kloner (%)</td>
			<td>Dictyostelium stam används</td>
			<td>transfection effektivitet (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µg DNA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-mCherry</td>
			<td>pPI226</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>14,2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3,5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-GFP</td>
			<td>pPI227</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>5</td>
			<td>41,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>6 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GOD JORDBRUKARSED</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>66,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1,5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1,5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GOD JORDBRUKARSED</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>66</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td>55,5</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.3 x 10 ^ -5</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>221</td>
			<td>12</td>
			<td>10</td>
			<td>83,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.1 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1,5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>85,7</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3,5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>70</td>
			<td>DdB</td>
			<td>5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>240</td>
			<td>12</td>
			<td>11</td>
			<td>91,6</td>
			<td>DdB</td>
			<td>1,2 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>320</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>100</td>
			<td>NC4</td>
			<td>1.6 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Transfection effektivitetsvinster och mängden erhållna positiva transfectants för generering av act5 KIs i annan stam bakgrunder 22 .
Det agera5 locus erbjuder relativt homogen uttryck av integrerade reporter21. Genererade NC4::act5-mCherry cellerna tillåta blandning experiment kan utföras med andra act5 knock-moduler använder en olika fluorescerande protein såsom god Jordbrukarsed. För att betona den stora fördelen med detta system, visas blandande experiment med Ax2::act5-GFP . På grund av oförmågan att transfect icke-axenic vildtyp celler, kunde denna typ av strategi inte utföras innan. Blanda experiment är ett viktigt verktyg för att analysera cell beteende, eftersom de tillåter en direkt jämförelse mellan olika cellinjer upplever identiska experimentella förhållanden. NC4 cellerna växer snabbare på bakteriell gräsmattor än Ax2 celler (figur 5A). Detta kan bero på en högre kapacitet att phagocytose bakterier eller förbättrad förmåga att flytta och Visa chemotaxis mot en näringskälla. Med en under agar folat chemotaxis-analys, utfördes direkt jämförelse av en befolkning på NC4::act5-mCherry och Ax2::act5-GFP , visar att NC4::act5-mCherry är mycket mer effektiva i folat avkänning. Efter 4 h skulle mer NC4::act5-mCherry celler kunna krypa under Agarens än Ax2::act5-GFP celler (figur 5B). Analysera standardstatistisk av chemotaxisna för cellerna migrerar under Agarens avslöjade att NC4::act5-mCherry celler var snabbare och visade starkare kemotaktisk svar än Ax2::act5-GFP celler (figur 5C-E ).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig5.jpg"> Figur 5 : Använder agera5 KIs för image-baserad chemotaxis mix experiment. (A) NC4::act5-mCherry och Ax2::act5-GFP uttrycker det indikerade fluorescerande proteinet från det agera5 locus analyserades för förmågan att växa på en bakteriell gräsmattan. Efter 4 dagar mättes plack diameter uppstått från ensliga guldpläterade Dictyostelium celler. Icke-axenic act5:: NC4 celler göra betydligt större plack än axenic Ax2::act5-GFP celler (genomsnitt ± SD, *** p < 0,0001, n = 3, skala bar 5 mm). (B) för användning av under-agaros folat chemotaxisna analys22 att direkt jämföra kemotaktisk förmåga av NC4::act5-mCherry och Ax2::act5-GFP används i (A), bakterier-växt endoparasiterna av båda stammar var blandade i förhållandet 50: 50. Celler fick krypa under Agarens. Efter 4 h, var celler som migrera upp folat övertoningen avbildas med confocal Mikroskop. Antalet celler som NC4::act5-mCherry och Ax2::act5-GFP fastställdes därefter. NC4::act5-mCherry cellerna var effektivare i avkänning folat. Om 10-faldig mer NC4::act5-mCherry celler hittades jämfört med Ax2::act5-GFP celler (genomsnitt ± SD, *** p < 0,0001, n = 6, skala bar 100 µm). (C, D) Cellerna har filmats för 60 min och deras hastighet och kemotaktisk index beräknades. Efter första urval av de mest chemotactically lyhörd cellerna (endast de som migrerade under Agarens), celler Ax2::act5-GFP visade lägre värden för både cell hastighet och chemotaxisna. Femtio celler per cell fodrar analyserades. (median ± SD, * p < 0,01, n = 3). (E) spåren av NC4::act5-mCherry och Ax2::act5-GFPact5 knock-ins ritas över 60 min, visar mer riktad rörelse mot den chemoattractent källan för NC4::act5-mCherry cellerna (median ± SD, ** * p < 0,0001, n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
De act5 inpressning cellinjer kan också användas för flödescytometri. Som med tillväxt på bakterier, finns det stora skillnader i utveckling mellan axenic stammar och icke-axenic wild-typer. Efter utveckling, fruktkroppar av NC4 celler är ungefär dubbelt så stor som de härrör från Ax2 celler. Om cellerna blandas, erhålls en mellanliggande storlek fruiting kropp. För att analysera bidrag av både cellinjer mer kvantitativt, användes flödescytometri. Dessa analyser visade tydligt att de mellanliggande medelstora fruktkroppar är på grund av olika nivåer av bidrag från både cellinjer. Medan NC4::act5-mCherry celler består cirka 75% av de uppmätta Sporerna, bidrog Ax2::act5-GFP endast 25%, avslöjar en potentiell fitness fördel för icke-axenic stammar (figur 6). Eftersom analysen inte övervakar stjälken cell befolkningen, finns det två möjligheter att förklara obalansen i utveckling mellan Ax2 och NC4. En möjlighet är att Ax2 celler bidrar främst till stjälk cell befolkningen, i stället för att ange spor cellen befolkningen. Alternativt mer NC4 celler kan ange utvecklingsmässiga cykeln, med Ax2 relativt försenade, och de kan därför inte bidra till montering av en fruiting kropp. Möjlighet att transfect icke-axenic vildtyp celler utvecklar andra tillvägagångssätt och förenklar experimentella rutiner.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig6.jpg"> Figur 6: Act5 KIs möjliggöra analys av mix experiment med flödescytometri. (A) NC4::act5-mCherry och Ax2::act5-GFP har utvecklats separat eller i en 50: 50-blandning på icke-näringsämne agarplattor. NC4::act5-mCherry celler bildar större fruktkroppar än Ax2::act5-GFP. Mixen i stället visar en mellanliggande storlek (skala bar 5 mm). Confocal fluorescens ljusmikroskopi föreslår en större mängd NC4::act5-mCherry sporer i spore huvuden härrör från mixar. (B) att kvantifiera denna observation, mängder sporer i skördade spore huvuden från blandning experimentet i (A) analyserades av flödescytometri. Cirka 75% av sporer härstammar från NC4::act5-mCherry celler, med endast 25% från Ax2::act5-GFP celler. (C) representativ fördelning av sporer från både cellinjer som visas i ett flöde flödescytometri scatter. Om 0,05% visar positiva mCherry och god Jordbrukarsed signaler, vilket tyder på att parasexual fusion bearbetar har inträffat eller att sporer sticker till varandra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Cellinje</td>
			<td>Genetiskt bakgrund</td>
			<td>Referensnummer</td>
			<td>Utgiven före</td>
			<td>Typ</td>
		</tr>
<tr>
<td>AX2 (Ka)</td>
			<td></td>
			<td>DBS0235521</td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>vildtyp</td>
		</tr>
<tr>
<td>NC4 (S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>vildtyp</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::mCherry klon 5</td>
			<td>NC4</td>
			<td>HM1912</td>
			<td>Paschke et al., 2018</td>
			<td>act5 inpressning</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::GFP klon 2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>HM1930</td>
			<td>Paschke et al., 2018</td>
			<td>act5 inpressning</td>
		</tr>
<tr>
<td>V12M2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>vildtyp</td>
		</tr>
<tr>
<td>WS2162</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield et al., 2008</td>
			<td>vildtyp</td>
		</tr>
</tbody></table>Kompletterande Tabell1: olika stammar av Dictyostelium studerade.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genteknik Dictyostelium discoideum celler baserat på urval och tillväxt på bakterier

Dictyostelium discoideum är en populär modellorganism att studera komplexa cellulära processer såsom cellmigration, endocytos och utveckling. Nyttan av organismen är beroende av genomförbarheten av genetisk manipulation. Här presenterar vi metoder för att transfect Dictyostelium discoideum celler som övervinna befintliga begränsningar av odling av celler i flytande media.

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Värdet av detta protokoll är att det tillåter nästan alla stammar av dictyostelium discoideum manipuleras av molekylär genetik, oavsett om denna stam kommer att växa axenically i flytande medium eller inte. Den andra fördelen med denna teknik är att det är snabbt och enkelt. Transponera till transfect celler med en exochromosomal plasmid innan du börjar blanda dictyosteliums.Resultaten kan redan valideras två dagar efter transfektion med hjälp av mikroskopi. Det är ovanligt att arbeta med dictyostelium celler och bakterier suspension. Visualisering kommer att bidra till att ge experimenter en idé hur är de olika stegen i protokollen utförs.Demonstrera förfarandet med mig kommer att Soudabeh Imanikia, en postdoc från mitt labb. Till att börja med förbereda 1000 milliliter sörensen buffert arbetslösning med magnesiumklorid och kalciumklorid enligt textprotokollet. Efter detta, använd en enda koloni av K aerogenes att inokulera en liter LB medium.Låt bakterierna att växa över natten vid 37 grader celsius med skakningar. Snurra ner cellerna i två 500 milliliter centrifugrör för att skörda cellerna. Sedan tvätta bakterierna en gång med 500 milliliter buffert.Resuspend pelleten i 20 milliliter buffert. Använd en fotometer för att kontrollera provets optiska densitet och späd provet med buffert tills den optiska densiteten är ca 100. Efter detta, förbereda H40 elektroporationsbuffert enligt textprotokollet.Odla K aerogenes att sammanflödet ett SM medium över natten i rumstemperatur. Tillsätt 400 mikroliter av bakteriell suspension till en SM agar platta och sprida den jämnt. Ta sedan en steril slinga och inokulera den med dictyosteliumceller och sprida cellerna i ena kanten av plattan.Inkubera plattan vid 22 grader Celsius i två dagar, för att säkerställa att tillväxtzonerna är tillräckligt stora för transfection. Tillsätt 10 milliliter K aerogene suspension till en 10 centimeter vävnad kulturbehandlade Petriskål. Använd sedan en 10 mikroliter disponibel inokulering slinga för att skrapa celler från tillväxtzonerna i odlingsplattan.Överför cellerna till ett 1,5 milliliterrör, innehållande iskall H40-buffert. Snurra cellerna i två sekunder på 10000 gånger gravitation. Sedan, kasta supernatant och resuspend cellerna i H40 buffert.Därefter lägger du till 100 mikroliter av cellerna till ett rör som innehåller ett till två mikrogram DNA. Pipett upp och ner för att blanda och överföra cellen DNA-blandningen till en förkyld elektroporation cuvette. Tillsätt inte mer än två mikrogram DNA.Högre DNA-koncentration är toxiska för cellerna och minskar effektiviteten. Efter elektroporation, omedelbart överföra cellerna till en beredd 10 centimeter Petriskål och låta cellerna återhämta sig i fem timmar. För att välja en transfectant för en knock-out, knock-in, eller en handling fem knock-in, lossa cellerna från Petri-skålen genom pipettering vätska över ytan.Ställ sedan in tre spädningar av det selektiva medlet enligt textprotokollet. Slutligen, fördela 150 mikroliter av de beredda utspädningar i varje brunn av 96-väl platt-botten vävnad kulturplattor. I detta protokoll, en dubbel reporter extrachromosomal plasmid systemet visades.32 timmar efter transfektionen uttryckte majoriteten av cellerna båda fluorescerande märkta fusionsproteiner. En akt fem M cherry knock-in och en NC4 försökte också. Två band erhölls efter att ha kört digest på en agarosgel.4127 basparbandet innehåller den önskade konstruktionen. Den renade DNA användes för transfection av NC4 celler. Två kloner av NC4-transfectionen analyserades via PCR och båda visade de förutsagda bandmönstren.Southern blot användes sedan för att validera resultaten av PCR. NC4 växte snabbare på bakteriegräsmattor än Ax2-celler. Efter fyra timmar kunde fler av NC4-cellerna krypa under agaros än Ax2-celler.NC4 cellerna var snabbare och visade starkare chemotactic svar på folat än De Ax2 cellerna. Använd alltid celler från nyuppställda SM-plattor. Använd aldrig celler äldre än fyra dagar, annars effektivitet kommer att sjunka.Nyligen isolerade, nonextenic, vit HAP stammar används vanligen för att ta itu med frågor om en ruching eller socialt beteende av dictyosteliums. Vår tillåter att tillämpa molekylär genetik genom dessa isolat.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Genteknik av en okonventionell Jäst för förnybart biobränsle och biokemisk produktion

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Utformning och användning av en låg kostnad, Automated Morbidostat för Adaptive Evolution av bakterier under antibiotikum Drug Val

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugativ Parning Analyser för sekvensspecifik analys av Transfer proteiner involverade i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Bedömning av DNA kontaminering i RNA-prover baserat på Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Enda molekyl Analys av Laser Lokaliserade psoralen Addukter

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Urval-beroende och oberoende generering av CRISPR / Cas9-medierade genknockouts i däggdjursceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering, karakterisering och mikroRNA-baserad genetisk modifiering av mänskliga dentala follikeln stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Mass Spectrometry-baserad proteomik analyser med hjälp av databasen OpenProt att avslöja nya proteiner översatt från icke-kanoniska öppen läsning ramar

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Poolade CRISPR-baserade genetiska skärmar i däggdjursceller

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetisk kartläggning av Termotolerans skillnader mellan arter av Saccharomyces jäst via Genomomfattande ömsesidig Hemizygosity analys

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...