Name: genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Yazarlar bu yöntemi giriş için Kay laboratuarı ve LMB mikroskobu ve akış sitometresi imkanları mükemmel bilimsel ve teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser tıbbi araştırma Konseyi grant MC_U105115237 R. R. Kay, BBSRC (Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi) için hibe BB/K009699/1'e R. R. Kay tarafından finanse edildi, kanser Araştırmaları İngiltere hibe A15672 R. H. olmak, hoş geldiniz güven kıdemli bursu 202867/Z/16/Z Jonathan R Chubb ve UCL MRC LMCB Üniversitesi birimi (MC_U12266B) finansman MRC.

<ol>
	<li>Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Dictyostelium+discoideum.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum.</a> Development. 138 (3), 387-396 (2011).</li><li>Sussman, R., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Dictyostelium+discoideum+in+axenic+culture.">Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).</li><li>Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+the+Dictyostelium+alpha-actinin+gene+leads+to+an+altered+mRNA+and+lack+of+the+protein.">Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein.</a> The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).</li><li>De Lozanne, A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+Dictyostelium+myosin+heavy+chain+gene+by+homologous+recombination.">Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination.</a> Science. 236, 1086-1091 (1987).</li><li>Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+transient+expression+system+for+Dictyostelium+discoideum.">Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum.</a> Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).</li><li>Knecht, D., Pang, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Dictyostelium+discoideum.">Electroporation of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).</li><li>Wetterauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+strains+of+Dictyostelium+discoideum+can+be+transformed+using+a+novel+selection+cassette+driven+by+the+promoter+of+the+ribosomal+V18+gene.">Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene.</a> Plasmid. 36, 169-181 (1996).</li><li>Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditions+for+the+transformation+of+nonaxenic+Dictyostelium+strains.">Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains.</a> Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).</li><li>Bloomfield, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+controls+macropinocytosis+and+phagocytosis+in+Dictyostelium.">Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP(3)-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Hoeller, O., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+the+absence+of+PIP3+gradients.">Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients.</a> Current Biology. 17, 813-817 (2007).</li><li>Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dictyostelium+RasS+protein+is+required+for+macropinocytosis,+phagocytosis+and+the+control+of+cell+movement.">The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement.</a> Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).</li><li>Schaap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phylogeny+and+evolution+of+morphology+in+the+social+amoebas.">Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas.</a> Science. 314, 661-663 (2006).</li><li>Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+Aggregative+Multicellularity+and+Cell-Cell+Communication+in+the+Dictyostelia.">The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).</li><li>Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+in+social+amoebae+is+mediated+by+allelic+pairs+of+tiger+genes.">Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes.</a> Science. 333 (6041), 467-470 (2011).</li><li>Strassmann, J. E., Queller, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+cooperation+and+control+of+cheating+in+a+social+microbe.">Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).</li><li>Wolf, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+Trade-offs+Result+in+the+Illusion+of+Social+Success.">Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success.</a> Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).</li><li>Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+set+of+small,+extrachromosomal+expression+vectors+for+Dictyostelium+discoideum.">A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum.</a> Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).</li><li>Woznica, D., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under-agarose+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).</li><li>Dubin, M., Nellen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+set+of+tagged+expression+vectors+to+monitor+protein+localisation+and+function+in+Dictyostelium.">A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium.</a> Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).</li><li>de Hostos, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+mutants+lacking+the+cytoskeletal+protein+coronin+are+defective+in+cytokinesis+and+cell+motility.">Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility.</a> Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).</li><li>Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+targeting+of+multiple+genes+in+Dictyostelium.">CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).</li><li>Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+harbours+for+the+integration+of+new+DNA+in+the+human+genome.">Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).</li><li>Rosengarten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaps+and+lulls+in+the+developmental+transcriptome+of+Dictyostelium+discoideum.">Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum.</a> BMC Genomics. 16, 294 (2015).</li><li>Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-mediated+diversification+of+transcriptional+bursting+dynamics+following+gene+duplication.">Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).</li><li>Gebbie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phg2,+a+kinase+involved+in+adhesion+and+focal+site+modeling+in+Dictyostelium.">Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Sigara axenic, vahşi-tipi Dictyostelium hücreleri kullanımı çok sınırlı defa moleküler araştırma olmuştur. Bu suşların genetik mühendisliği için kullanılabilir yöntemleri güvenilirlik ve verimliliği23genel onların evlat edinmek önlenmesi, yoktu. Yaratılan malzeme ve burada sunulan iletişim kuralları için herhangi bir D. discoideum zor onun yeteneğini bağımsız sıvı ortamda büyümeye kullanılabilir. Bu iletişim kuralı NC4 elde edilen hücre hatları için optimize edilmiş olduğu belirtilmelidir. Biz daha önce gözlemledim ve V12M2 ve WS21628,9için aşağıda gösterildiği gibi transfection verimliliği vahşi üzerinden taze izole suşları için NC4 farklı. Elektroporasyon koşulları ve özellikle transfection verimliliği üzerinde önemli bir etkiye sahip görünüyor daha fazla optimizasyon bazı suşları için gereken. Genel olarak, transfectants yeterli miktarda bu yöntemler uygulanabilir olduğunu gösterecek kadar test tüm suşların içinde gözlenen. Olumlu transfectants NC4 elde edilen suşların kullanılarak elde sayısı diğer axenic wild-türü suşları için ama her durumda daha göre transfectants yeterli sayıda daha fazla deneyler için izin vermek için elde edilir. Bu artı bizim iletişim kuralı, sadeliği, önceki girişimleri8,9' a göre önemli gelişme.
Bu yeni axenic iletişim kuralları tüm standart genetik yordamlar kapsar ve transfections hızla ve verimli bir şekilde paralel olarak yapılabilir bu yana daha fazla avantajları ekleyin. Pozitif klonlar büyüme bakteri yarım bölümü saat bu yana hafta yerine gün elde edilebilir. Yeni kurulan plazmid aynı zamanda axenic şartlar altında çalışmayı ve rutin olarak her iki büyüme koşullar altında bu methology22başka bir gelişme olduğu kullanılabilir. Protokol tanıttı gibi bakteri seçimi için kullanılan plazmid transfection başarısı için çok özel gereksinimleri vardır. Özellikle, ifade ve direnç kaset sürüş Rehberleri başarılı transfection için önemlidir. Hücreleri bakteri yetiştirilen direnç veya ifade kaset sürüş için sık kullanılan act6 (aktin 6) Organizatörü24 verimliliği yoksun. Direnç kaset bir coA (a coactosin) Organizatörü, her ikisi de hangi aktif axenic koşullar altında ve vardır kontrol altında iken plazmid sistemimizde tüm ifade kaset, son derece etkin act15 (aktin 15) Organizatörü sürücüler hücreleri bakteri yetiştirilen. Ifade bir muhabir için gereksinimleri yapıları knock-in yanı sıra ve knock-out yapıları bizim plazmid repertuar kullanmak gerekli yapmak, ama ne yazık ki zaten bu verimsiz act6 organizatörü olarak oluşturulan vektörel çizimler kısıtlar.
Organizatörü verimliliği doğru genomik locus bir tek tümleştirme olaya bağlı transfections için özellikle önemlidir. Direnç gen ekspresyonu sürüş Rehberleri bizim iyileşme nedeniyle, yeterli direnç protein tek locus entegrasyonlar üretilmektedir. Genom içine birden çok entegrasyonlar, hygromycin ya da açıklandığı gibi G418 kullanırken lehine büyük bir endişe vardı. Yok birden çok entegrasyonlar lehine şimdiye kadar daha önce G418 seçimlerinde büyük organizatörü sistemleri25kullanarak rapor olarak gözlenmektedir. Bu hem temiz knock-çıkışları ve knock-Ins. üretimi için uygun seçilebilir işaretleri vardır ne yazık ki hygromycin ve G418, seçilebilir marker blasticidin axenic olmayan koşullar altında çalışmıyor demektir. Blasticidin direnç kaset rutin olarak D. discoideumiçinde knock-out yapıları oluşturmak için kullanılan bu yana bu bizim Yöntem, büyük bir dezavantaj olduğunu. Zaten blasticidin direnç kasetleri ile oluşturulan yapıları bir uygulanabilir seçilebilir işaretleri kullanarak rederived gerekir. Yeni kurulan axenic D. discoideum CRISPR birleştirmek için bu sınırlamayı aşmak için başka bir olasılık var teknoloji ile bu transfection Protokolü26. Basit ve hızlı tam knock-out yapıları yeniden inşası uygun, tek rehber RNA'ların (sgRNAs) kuşağıdır. Gelecekteki yönelimler, olasılığını için birden çok knock-çıkışları üreten CRISPR/Cas9 bu transfection kuralıyla birlikte kullanarak itiraz ediyor ve Dictyostelium toplumda pek çok araştırmacı için önünü. Ancak, işlenebilirlik için CRISPR/Cas9 axenic yetişkin hücrelerinde kullanılan kurulan geçici ifade sisteminin dikkatle incelenmelidir.
Sunulan act5 çakma sistemi güvenilir ve güvenli entegrasyon sistemi istikrarlı hücre hatlarında D. discoideum, nesil benzer siteler diğer organizmaların22yılında kurulan avantajı ile sunuyor. Ayrıca genom bir tek tümleştirme etkinliğinde bağlıdır ve farklı araştırma yönleri için birçok seçenek sunuyor. Act5 düzenleyici güçlü etkindir ve neredeyse homojen ifade27 ekimi koşullardan bağımsız garanti eder. Floresan muhabir proteinler mühendislik hedefleme plazmid kullanarak bu sığınak locus kolayca entegre edilebilir. Bu karışımı deneyde aþaðýda gösterildiði gibi hücre izleme açısından yararlı olabilir. Hücreleri izleme otomatik hücreye yardımcı olabilir en az hücre hücre ifade değişkenlik gösterir. Önemlisi, istenen sırayı 5 hareketlocus içine ekleme phenotypically tarafsız28,29görünür. Ifade protein ifade, korumak için seçilebilir bir işaretleyici üzerinde rastgele integrants veya extrachromosomal vektör taşıyan hücre hatları görüldüğü gibi bağlı değildir, act5 sistem kurtarma deneyler için de yararlı olabilir. Hücre hatları homojen olduğundan, tüm hücreleri analiz edilebilir. Bu extrachromosomal bir plazmid olduğu önemli heterojenite ifadede ifade kullanarak mümkün değildir.
Yanı sıra bu genel yönelik tüm suşları için axenic wild-türü hücreleri moleküler araştırma için kullanabilme geçerli laboratuar suşları içinde birikmiş mutasyonların etkileri bir değerlendirmesini sağlar. Birden çok genetik düzenlemeler bulundu beri Ax2 zorlanma kabulü 1970 yılında, daha önce yayımlanmış Mikroarray analizleri26tarafından gösterildiği gibi. Sentetik fenotipleri Bu mutasyonlar varlığı nedeniyle gözlenir. Örneğin, bir rapor phg2 mutant azalmış yapışma bir laboratuvar zorlanma arka plan ve başka bir3yüksek yapışma gösterir. Böyle çakışan veri şimdi (Bu durumda, DdB) ortak atası zorlanma deneyde tekrar ederek çözülebilir. Bu yaklaşım gücünü son zamanlarda küçük GTPazlar Semud'u30,31için göstermiştir.
Yetenek herhangi bir D. discoideum suşu genetik deneyler yapmak vahşi yalıtır, özellikle toplumsal evrimin, kin tanıma ve cinsel döngüsü22ilgili olanlar kullan seçeneğine bağlı yeni araştırma yönleri potansiyelini genişletir.

Dictyostelium cins çoğunlukla bakteri yem toprak-yaşayan sosyal amip vardır. Şube Kökbacaklılar konuyor, çok sayıda tür-si olmak be izole dört farklı clades1gruplandırılabilir. Türler Dictyostelium discoideum (D. discoideum) hücre göç ve fagositoz gibi karmaşık hücresel süreçler eğitim için popüler bir model organizma haline gelmiştir. Kontrol ve deneysel koşullar, karmaşık veya tanımlanmış sıvı ortamda bakteri2yokluğunda büyümek mümkün axenic hücre hatları geliştirilmiştir standartlaştırmak için. Ax2, Ax3, belirli önemlidir ve tüm 1970'lerde üretilen ve sonuçta elde edilen tek bir vahşi Ax4 suşları NC43yalıtır. Genetik mühendisliği için araçlar ilk yayımlanan nakavt 19874,5sonuçlanan bu axenic suşları geliştirilmiştir. İletişim kuralları daha da geliştirilmiş olup axenic koşulları6,7altında kullanım için optimize edilmiş.
Adaptasyon Bu protokollerden vahşi tipi D. discoideum için sıvı suyu büyümek mümkün değildir suşları birkaç laboratuvarları tarafından kurulması denenen. Transfection iletişim kuralları karmaşıktır ve verimlilik, kısmen kapasitesi9seçici reaktifler8,için bir lavabo olarak hareket bakteri nedeniyle eksikliği beri Ancak, bu tam olarak başarılı olamamıştır. Sonuç olarak, temelde tüm Moleküler veriler D. discoideum üzerinde tek bir vahşi tipi izole soyundan gelir. Bu sınırlamayı aşmak ve genetik olarak D. discoideum hücreler sıvı ortamda büyümeye yeteneklerini bağımsız değiştirmek için bir yöntem geliştirmek istedim. Böyle bir yöntem ihtiyacını axenic büyüme sağlayan mutasyonlar esas olarak tarafsız geçmişte kabul edildi ve hücre fizyolojisi zarar değil gözlem tarafından açıklanabilir. Bu varsayım sadece kısmen doğru olduğunu. Genel olarak, iki önemli fark vardır; İlk olarak, arasında farklı axenic suşları ve ikinci ne zaman axenic bu suşların axenic vahşi yalıtır8,9ile karşılaştırılır, izole.
Belki de en önemli faktördür son zamanlarda RasGAP NF1 tanımlanan anahtar axenic gen, baltaB. NF1 bir RasGAP olarak büyük Ras aktivitesi3tutmaya işlevidir. Tüm axenic suşları enzim silinmesi büyük etkin Ras yamalar oluşum olarak kendini gösteren aşırı Ras faaliyet yol açar. Bu genişlemiş Ras düzeltme ekleri PIP3 birikimi plazma zarı neden. Bu tesadüfi görünen yamaları PIP3 ve etkin Ras sonunda kapatan ve macropinosomes10oluşumuna yol açar bir dairesel fırfır oluşumu için bir şablon vardır. Macropinocytic aktivite aşırı bir artış sonucudur. Macropinocytosis, aktin odaklı bir süreçtir. Hücre iskeleti bileşenleri oluşumu için bir yarışma macropinosomes veya pseudopods sonucudur. Hücre davranış üzerindeki etkilerini folat11bitkisel hücrelerin kemotaksis neredeyse tamamen önlenmesi yansıtılır. Ağır genişlemiş PIP3 yamalar çok ısrarcı. Bile aç olan hücrelerde, PIP3 yamalar kalır ve kemotaksisi kamp çalışmaları yorumlama sorunlara neden olabilir pseudopods olarak yanlış anlaşılabilir.
Bazı durumlarda, NF1 mutasyon deneysel olarak yararlıdır. Bu bir transfection yöntemi bacterially yetişkin D. discoideum için geliştirmek için ikinci bir motivasyon için ulaşabilirsiniz hücreleri, macropinocytosis oranı artış axenic hücreleri bu sürecin12 temel yönleri soruşturma için değerli yapan bu yana . Ancak, macropinocytosis, Ras ve PI3-kinaz10gibi gerekli genlerde mutasyon hemen hemen iptal axenic büyüme, bakteri büyüme ile bu hücreleri işlemek gerekli yapma. Bakteri tabanlı transfections değerli kılan bir başka neden Dictyostelids çok cellularity13,14, kin tanıma15,16evrim sorular keşfetmek için artan kullanmaktır, ve esas olarak taze izole vahşi türünün kullanımı üzerinde bağlıdır fedakar hücresel davranış17yalıtır. Tüm araştırma alanlarına axenic sigara ve sıvı suyu büyümek değil vahşi yalıtır genetik manipülasyon için etkili yöntemler tarafından kolaylaştırılabilir söz.
Protokolümüze açıklanan sınırlamalar üstesinden gelmek için izin verir. Birlikte, bu sadece artan hız nedeniyle seçim sürecinin daha hızlı da olsa D. discoideum hücreleri tutar yararları tüm Dictyostelium araştırmacılar için yetiştirilen bakteriyel ile genetik manipülasyon gerçekleştirme imkanı ele alındığında Amip (4 h katlama zaman) axenic medya (10 saat iki katına h) büyüme kıyasla bakteri büyümesi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:820px;" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Equipment</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-400-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">12823252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EP6331000025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gene Pulser X Cell, including CE &#38; PC modules</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Safety Cabinet Foruna - SCANLAF</td>
			<td style="width:184px;">Labogene</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BioPhotometer Plus</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CLSM 710</td>
			<td style="width:184px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Media &#38; Agaroses</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">LoFlo Medium</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LF0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:184px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Low EEO Agarose</td>
			<td style="width:184px;">BioGene</td>
			<td style="width:119px;">300-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Purified Agar</td>
			<td style="width:184px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SM broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">SMB0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2x LB broth</td>
			<td style="width:184px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">LBD0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Chemicals</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1 Kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HEPES free acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">391340 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">P/4800/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">Na2HPO4 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2 * 6 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td style="width:119px;">5982 EMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">CaCl2 * 2 H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">442909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KOH</td>
			<td style="width:184px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">26668.263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cultur Dishes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated</td>
			<td style="width:184px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5</td>
			<td style="width:184px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:119px;">P50G-1.5-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Geneticin G418-sulphate</td>
			<td style="width:184px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hygromycin B Gold</td>
			<td style="width:184px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Additional Consumables</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2mm gap electroporation cuvettes, long electrode</td>
			<td style="width:184px;">Geneflow Limited</td>
			<td style="width:119px;">E6-0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">10 &#181;l Inoculating Loop, Blue 10 Micro L</td>
			<td style="width:184px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">129399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Spreader, L-shaped, sterile</td>
			<td style="width:184px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">730190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Combitips advanced 5 ml</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf BIOPUR</td>
			<td style="width:119px;">30089669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Kits</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ZR Plasmid Miniprep Classic</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D4016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Quick DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zymoclean DNA Recovery Kit</td>
			<td style="width:184px;">Zymoresearch</td>
			<td style="width:119px;">D40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Enzymes</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0482L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:184px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td style="width:184px;">TakaraBio</td>
			<td style="width:119px;">R045A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of dictyostelium discoideum cells based on selection and growth on bacteria

Dictyostelium discoideum hücre farklılaşması işlemlerin incelenmesi için ilgi çekici bir model organizma geliştirme, hücre sinyallemesi ve diğer önemli Hücresel biyoloji soruları sırasında olur. İyi gelişmiş teknolojileri Dictyostelium hücrelerin genetik olarak işlemek kullanılabilir. Transfections farklı seçilebilir işaretleri ve bisiklet, Homolog rekombinasyon ve insertional mutagenesis de dahil olmak üzere yeniden işaretleyici kullanarak gerçekleştirilebilir. Bu iyi açıklamalı Genom tarafından desteklenir. Ancak, bu yaklaşımlar sıvı kültürlerde büyüyen axenic hücre hatları için optimize edilmiş ve sadece bakteri yem axenic yaban tipi hücrelere uygulamak zordur. Axenic suşların mevcut mutasyonlar sinyal, aşırı macropinocytosis beslenmesi için gerekli yol açan Ras rahatsız eder ve sinyal iletimi ve bu suşlar deneylerde kemotaksisi yorumlanması zihnimi karıştıran hücre geçiş etkileyebilir. Genetik olarak axenic olmayan hücreleri değiştirmek için önceki girişimleri verimliliği ve gerekli karmaşık deneysel prosedürler yoktu. Biz, ilk kez, bu sınırlamalar üstesinden basit transfection protokol geliştirdik. Dictyostelium moleküler genetik büyük gelişmeler bu dizi vahşi-türü olarak standart laboratuar suşları olarak kolayca manipüle edilebilir hücrelere izin. Avantajları bozulmamış sinyal ve motilite süreçleri çalışmak için ek olarak, macropinocytosis dayalı büyüme bozabilir mutantlar şimdi kolayca ayrılmış olabilir. Ayrıca, tüm transfection iş akışı büyük ölçüde, hafta yerine gün içinde oluşturulan rekombinant hücrelerle hızlandırılır. Moleküler genetik daha fazla taze izole vahşi tipli Dictyostelium örnekleri çevre ile yapılabilir başka bir avantajdır. Bu bu araştırma alanlarında kullanılan yaklaşımlar kapsamını genişletmek için yardımcı olabilir.

Extrachromosomal plazmidler bir hücre veya mutant hücre hücresel yapısında değişiklikler içinde belirli proteinlerin yerelleştirme tanımlamak için amaç muhabir çalışmaları için kullanılır. Hücre döngüsünün kontrolü gibi pek çok yaklaşım için aynı anda iki gazetecilere ifade etmek önemlidir. Bu şimdi çift muhabir extrachromosomal plazmid sistemimizi (Tablo 1) kullanarak mümkündür. 1 gün, 5 h (Şekil 1) sonra seçilebilir işaret G418 eklemeden önce hücreleri transfected. Örneğin, NC4, DdB, Ax2 ve bağımsız olarak türetilmiş vahşi yalıtır V12M2 ve WS2162 (ek tablo 1) GFP-TubulinA, mikrotübüller ve mCherry-PCNA, olan bir protein için bir işaretleyici için kodlar plazmid pPI289 ile transfected hücre döngüsü (Şekil 2A) izlemek için kullanılır. 32 h sonra hücrelerin mikroskop altında tespit edildi. Her iki floresan etiketli füzyon proteinler, hücre çoğunluğu ifade tutarlı ile önceki raporlar bu ifade aynı plazmid gösterir benzer ifade düzey, iki gazeteci iki farklı plazmid kullanırken neredeyse imkansız olduğu 18,19. Temsil edici bir hücre (NC4, DdB, Ax2, V12M2 ve WS2162) her hücre satırı için istenen çift muhabir ifade Şekil 2' deBgösterilir. Transfection verimlilik Şekil2 Cözetlenir. NC4 türetilmiş hücre hatları en iyi transfection verimliliği göster. Ancak, hücre satır V12M2 ve WS2162, transfectants oldukça yüksek sayıda elde edildi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig2.jpg"> Resim 2 : Extrachromosomal bir plazmid ifadesidir. (A)Extrachromosomal plazmid doğrudan dairesel formda transfected. Örneğin, Çift muhabir pPI289 gösterilir. NgoMIV siteleri ikinci muhabir extrachromosomal ifade plazmid içine ekleme gösterir. (B) Z-projeksiyon temsilcisi bir hücrenin GFP-TubulinA (sitoplazmik) ve mCherry-PCNA (büyük ölçüde nükleer) kullanılan beş farklı vahşi-türü hücre hatları (NC4, DdB, Ax2, V12M2, WS2162) için ifade. (C) transfection verimliliği (B) resimde beş hücre hatları için hesaplanır. Gösterilen iki deney ortalamasıdır. Hata Çubuklarõn ± SD <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Belirtilen genomik locus hedefleme vektör entegrasyonu daha zordur ve oluşturulan hücre kültürünü daha dikkatli analiz gerektirir. Şekil 3' te, bir act5- mCherry NC4 kı denenir. İlk olarak, plazmid transfection takip rekombinasyon olayları sıklığını artırmak için linearized gerekir. Bunun için sivil toplum örgütüile MIV plazmid pDM1514 kesilir. İki grup üzerinde bir özel jel "denemeler" den çalıştırdıktan sonra elde edilir. 4127 bp grup istenen yapı (Şekil 3) içerir. Transfection, sindirilmiş DNA jel çıkarılan ve üreticinin yönergelerini izleyerek bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saf.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig3.jpg"> Şekil 3 : Act5 knock bileşenini ve DNA hazırlanması için transfection. Örnek kullanım bir hareket5 knock-in plazmid pDM1514 gösterilir. Hazırlık adımları aşağıda listelenmiştir. (A)belirtilen NgoMIV sites'ı kullanarak plazmid Elektroporasyon daha önce linearize. (B, C) İki beklenen grup düzgün ayrılır kadar kesilmiş plazmid üzerinde bir özel jel çalıştırın. Rekombinasyon silah, mCherry ve direnç-kaset içeren 4127 bp bant kesme ve jel ayıklamak DNA. DNA şimdi transfection için hazırdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Saf DNA NC4 hücre transfection için kullanıldı. Seçimin 5-6 gün sonra klonlar elde edilmiştir. Temsilcisi transfection verimliliği ve birkaç act5 çakma girişimleri için pozitif saptanan klonlar miktarını Tablo 3' te özetlenmiştir. NC4 transfection iki klon rastgele seçilmiş ve PCR (Şekil 4A) tarafından analiz ve her ikisi de tahmin edilen bant desen bir knock beklenen ve daha fazla Southern blot analizi ile tek bir entegrasyon sağlamak için doğrulanmış gösterdi yapı içine genom20olay. Leke açık tek bir entegrasyon istenen act5 odağı (Şekil 4B) gösterir. Oluşturulan NC4::act5 mCherry hücre kültürünü şimdi deneylerde kullanılabilir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig4.jpg"> Şekil 4 : Act5- mCherry kıs NC4 içinde doğrulanmasını. (A)düzeni ve kontrol PCR act5 odağı içine pozitif entegrasyonlar doğrulama için. Belirtilen astar iki bağımsız klon ve üst analiz etmek için kullanılmıştır. Her iki klonlar ebeveyn zorlanma mevcut olmayan beklenen bantları direnç-kaset ve aşağı akım (P1) veya ters yönde astar (P2), göster. Astar kombinasyonu (P1/P2) act5 odağı doğru entegrasyon mCherry ve direnç kaset onaylar. Her iki KI klonlar bu grup eksikliği ve bunun yerine 1400 baz çifti daha büyük hakkında bir PCR ürünü görüntülemek vahşi tipli NC4 beklenen 2800 bp grubu gösterir. (B) düzeni için kullanılan kısıtlama Özet ve Güney leke. Her iki çakma klonlar daha küçük 3400 bp grup göstermek hangi yapı entegrasyon 5 hareketlocus içine sonucu, özellikle ek Bclı hygromycin direnç kasete site. Vahşi-tipi kumanda gösterir beklenen 5.8 kb iki aşağı akım bulunduğu Bclkaynaklanan ben siteler. Leke kırpılmış ve netlik için spliced. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>act5 odağı içine hedeflenen yapı</td>
			<td>Plazmid adı</td>
			<td>işgal altındaki kuyu sayısı</td>
			<td>checked klonlar sayısı</td>
			<td>Pozitif klonlar</td>
			<td>Doğru klonlar (%)</td>
			<td>Kullanılan Dictyostelium zorlanma</td>
			<td>transfection verimlilik (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µg DNA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-mCherry</td>
			<td>pPI226</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>14,2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>LifeAct-GFP</td>
			<td>pPI227</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>5</td>
			<td>41,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>6 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>66,6</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP</td>
			<td>pDM1513</td>
			<td>66</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td>55.5</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.3 x 10 ^ -5</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>221</td>
			<td>12</td>
			<td>10</td>
			<td>83.3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.1 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>33,3</td>
			<td>AX2</td>
			<td>1.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2B-mCherry</td>
			<td>pPI420</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>85.7</td>
			<td>AX2</td>
			<td>3.5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>70</td>
			<td>DdB</td>
			<td>5 x 10 ^ -6</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>240</td>
			<td>12</td>
			<td>11</td>
			<td>91.6</td>
			<td>DdB</td>
			<td>1.2 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
<tr>
<td>mCherry</td>
			<td>pDM1514</td>
			<td>320</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>100</td>
			<td>NC4</td>
			<td>1.6 x 10 ^ -4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Transfection verimliliği ve miktarını elde edilen olumlu transfectants nesil için act5 Kıs içinde farklı zorlanma arka planlar 22 .
5 hareketlocus entegre muhabir21nispeten homojen ifade sunmaktadır. Oluşturulan NC4::act5-mCherry hücreleri ile diğer act5 knock-ins GFP gibi farklı bir floresan protein kullanarak gerçekleştirilecek mix deneyler izin. Bu sistemin en büyük avantajı vurgulamak için Ax2::act5-GFP ile karıştırma deneyler gösterilir. Axenic yaban-türü hücre transfect yetersizlik nedeniyle, bu tür bir yaklaşım önce gerçekleştirilemedi. Çünkü onlar aynı deneysel koşullar karşılaşan farklı hücre hatları arasında doğrudan bir karşılaştırma izin Mix deneyler hücre davranış, analiz etmek için önemli bir araç vardır. NC4 hücreleri Ax2 hücreleri (Şekil 5A) daha bakteriyel çimenler üzerinde daha hızlı büyür. Bu bakteri ya da taşımak ve bir besin kaynağı doğru kemotaksisi göstermek için geliştirilmiş yetenek phagocytose için daha yüksek bir kapasite nedeniyle olabilir. Bir eksik agar folat kemotaksisi tahlil kullanarak, doğrudan karşılaştırma NC4::act5-mCherry ve Ax2::act5-GFP nüfusun, NC4::act5-mCherry folat algılama çok daha etkili olduğunu gösteren gerçekleştirildi. 4 h sonra daha fazla NC4::act5-mCherry hücreleri özel Ax2::act5-GFP hücreleri (Şekil 5B) daha altında tarama başardık. Altında özel geçiş hücrelerin kemotaksis standart ölçümleri analiz ortaya NC4::act5-mCherry hücreleri daha hızlı olduğunu ve Ax2::act5-GFP hücreleri (Şekil 5C-E daha güçlü kemotaktik tepki gösterdi ).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig5.jpg"> Şekil 5 : 5 hareketkıs kullanarak yansıma tabanlı kemotaksisi mix deneyler için. (A) NC4::act5-mCherry ve Ax2::act5-GFP ifade 5 hareketodağı belirtilen floresan protein için yetenek bir bakteriyel çim büyümeye analiz. 4 gün sonra yalnız kaplama Dictyostelium hücrelerden ortaya çıktığı plak çapı ölçüldü. Sigara axenic act5:: NC4 hücreleri yapmak axenic Ax2::act5-GFP hücreleri daha önemli ölçüde daha büyük plaklar (± SD, demek *** p < 0,0001, n = 3, 5 mm Ölçek). (B) karıştırıldı bakteri-amip her iki suşlarının yetiştirilen özel altında folat kemotaksisi kullanımı tahlil için doğrudan NC4::act5-mCherry ve (A) kullanılan Ax2::act5-GFP kemotaktik yetenekleri karşılaştırmak için22 , bir 50: 50 oranı. Hücreleri altında özel tarama için izin verildi. 4 h sonra folat degrade geçiş hücreleri confocal bir mikroskop kullanarak görüntüsü. NC4::act5-mCherry ve Ax2::act5-GFP hücre sayısı sonra tespit edilmiştir. NC4::act5-mCherry hücreleri folat algılama daha verimli. 10 kat daha fazla NC4::act5-mCherry hakkında Ax2::act5-GFP hücrelere kıyasla hücreleri bulundu (± SD, demek *** p < 0,0001, n = 6, ölçek 100 µm bar). (C, D) Hücreleri için 60 dk çekildi ve onların hızı ve kemotaktik endeksi hesaplanmıştır. Sonra ön seçim en chemotactically duyarlı hücrelerin (yalnızca bu özel altında geçirilen) Ax2::act5-GFP gösterdi daha düşük değerler hücre hız ve kemotaksisi hücreleri. Hücre başına elli hücre analiz edildi. (ortalama ± SD, * p < 0,01, n = 3). (E) NC4::act5-mCherry ve Ax2::act5-GFPact5 knock-ins parça üzerinde 60 dk daha yönlendirilmiş hareketi doğru NC4::act5 mCherry hücre chemoattractent kaynak gösterilen, çizilir (ortalama ± SD, ** * p < 0,0001, n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Act5 çakma hücre satırları akış sitometresi için de kullanılabilir. Gibi büyüme bakteri ile geliştirme axenic suşları ve axenic wild-türleri arasında büyük farklılıklar vardır. Sonra geliştirme, Olgun cesetleri NC4 hücre yaklaşık iki katı kadar büyük Ax2 hücrelerden türetilmiş. Hücreleri karışık, bir orta boy meyve vücut elde edilir. Her iki hücre hatları katkısını daha kantitatif analiz etmek için akış sitometresi kullanıldı. Bu analizler açıkça orta boy olgun cesetleri farklı düzeylerinden her iki hücre hatları katkı nedeniyle olduğunu gösterdi. Süre ölçülen Sporlar yaklaşık % 75 ' NC4::act5-mCherry hücreleri yapılmış, Ax2::act5-GFP axenic sigara suşları (Şekil 6) için potansiyel bir fitness avantaj ortaya sadece % 25, katkıda bulunmuştur. Analiz sapı hücre nüfus izlemez beri geliştirme Ax2 ve NC4 arasındaki dengesizlik açıklamak için iki olasılık vardır. Ax2 hücreleri esas olarak SAP hücre nüfus yerine spor hücre nüfus girerek katkıda bir ihtimal. Alternatif olarak, daha fazla NC4 hücreleri Ax2 görece gecikmeli gelişim döngüsü girebilirsiniz ve sonuç olarak bir meyve vücut derlemeye katkı edemiyoruz. Axenic wild-türü hücre transfect imkanı daha fazla diğer yaklaşımlar geliştiren ve büyük ölçüde deneysel prosedürler kolaylaştırır.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58981/58981fig6.jpg"> Şekil 6: hareket5 kıs izin akış sitometresi kullanarak karışım deneyleri analizini. (A) NC4::act5-mCherry ve Ax2::act5-GFP ayrı ayrı veya 50: 50 karışım besin olmayan agar plakalar üzerinde geliştirilmiştir. NC4::act5-mCherry hücreleri Ax2::act5-GFPdaha büyük Olgun organları oluşturur. Mix, bunun yerine bir ara boyut gösterir (ölçek 5 mm). Confocal floresan ışık mikroskobu NC4::act5-mCherry Sporlar karışımları türetilmiş spore kafaları daha yüksek bir miktar önerir. (Bu gözlem, Sporlar hasat spor kafa karıştırma deneme (a) akış sitometresi tarafından analiz edildi miktarda ölçmek içinB). Sporlar yaklaşık % 75 Ax2::act5-GFP hücrelerden yalnızca % 25 ile NC4::act5-mCherry hücrelerden kökenli. (C) her iki hücre satırları akış sitometresi dağılım gelen sporlar temsilcisi dağılımı. Yaklaşık % 0.05 mCherry ve GFP sinyalleri, parasexual füzyon süreçleri ortaya çıkan veya Sporlar birbirine yapışmasını düşündüren pozitif göster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58981/58981fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Hücre kültürünü</td>
			<td>Genetik olarak arka plan</td>
			<td>Referans numarası</td>
			<td>Daha önce yayınlanan</td>
			<td>Türü</td>
		</tr>
<tr>
<td>AX2 (Ka)</td>
			<td></td>
			<td>DBS0235521</td>
			<td>Bloomfield vd., 2008</td>
			<td>vahşi türü</td>
		</tr>
<tr>
<td>NC4 (S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield vd., 2008</td>
			<td>vahşi türü</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::mCherry klon 5</td>
			<td>NC4</td>
			<td>HM1912</td>
			<td>Paschke vd., 2018</td>
			<td>act5 kapı açma</td>
		</tr>
<tr>
<td>act5::Gfp klon 2</td>
			<td>AX2</td>
			<td>HM1930</td>
			<td>Paschke vd., 2018</td>
			<td>act5 kapı açma</td>
		</tr>
<tr>
<td>V12M2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield vd., 2008</td>
			<td>vahşi türü</td>
		</tr>
<tr>
<td>WS2162</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bloomfield vd., 2008</td>
			<td>vahşi türü</td>
		</tr>
</tbody></table>Ek tablo 1: farklı suşları Dictyostelium okudu.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria at JoVE.com

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetik Mühendisliği hücreleri Dictyostelium discoideum alan seçimi ve bakteri büyüme

Dictyostelium discoideum hücre göç, endositoz ve geliştirme gibi karmaşık hücresel süreçler çalışmaya bir popüler bir model organizmadır. Belgili tanımlık yarar organizmanın genetik manipülasyon fizibilite üzerinde bağlıdır. Burada, sıvı ortam kodlamayla hücrelerde varolan sınırlamalar üstesinden Dictyostelium discoideum hücre transfect yöntemleri mevcut.

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Bu protokolün değeri, bu suş sıvı ortamda eksenli olarak büyüyüp büyümeyeceğine bakılmaksızın, neredeyse her türlü dictyostelium discoideum türünün moleküler genetik tarafından manipüle edilmesine izin verilmesidir. Bu tekniğin bir diğer avantajı hızlı ve basit olmasıdır. Dictyosteliums karıştırmaya başlamadan önce bir ekzoromosomal plazmid ile transfect hücrelere transkt.Sonuçlar transfeksiyondan iki gün sonra mikroskopi ile doğrulanabilir. Dictyostelium hücreleri ve bakteri süspansiyonu ile çalışmak alışılmadık bir durumdur. Görselleştirme, deneme yapanlara protokollerin farklı adımlarının nasıl gerçekleştirildiği hakkında bir fikir vermenize yardımcı olur.Prosedürü benimle birlikte göstermek Soudabeh Imanikia, benim laboratuvar bir postdoc olacaktır. Başlamak için, metin protokolüne göre magnezyum klorür ve kalsiyum klorür ile sorensen tampon çalışma çözeltisi 1000 mililitre hazırlamak. Bundan sonra, LB orta bir litre aşılamak için K aerogenes tek bir koloni kullanın.Bakterilerin sallayarak 37 santigrat derece bir gecede büyümeye izin verin. Hücreleri hasat etmek için iki 500 mililitrelik santrifüj tüpleri aşağı hücreleri spin. Daha sonra bakterileri 500 mililitre tamponla yıkayın.20 mililitre arabellekte peleti yeniden askıya alın. Numunenin optik yoğunluğunu kontrol etmek için bir fotometre kullanın ve optik yoğunluk yaklaşık 100 olana kadar numuneyi tamponla seyreltin. Bundan sonra, metin protokolüne göre H40 elektroporasyon tamponu hazırlayın.Oda sıcaklığında bir gecede bir SM orta birleştirmek için K aerogenes grow. Bir SM agar plakasına 400 mikrolitre bakteriyel süspansiyon ekleyin ve eşit olarak yayın. Daha sonra steril bir döngü yütleyin ve dictyostelium hücreleriyle aşılamak ve hücreleri plakanın bir kenarına yayın.Büyüme bölgelerinin transfeksiyon için yeterince büyük olduğundan emin olmak için plakayı iki gün boyunca 22 derecede kuluçkaya yatırın. 10 santimetrelik doku kültürü yle tedavi edilen Petri kabına 10 mililitre K aerojen süspansiyonu ekleyin. Daha sonra, kültür plakasının büyüme bölgelerinden hücreleri kazımak için 10 mikrolitrelik tek kullanımlık aşılama döngüsü kullanın.Hücreleri buz gibi H40 tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri 10000 kat yerçekiminde iki saniye döndürün. Daha sonra, supernatant atın ve H40 tampon hücreleri yeniden askıya.Daha sonra, 1-2 mikrogram DNA içeren bir tüpe 100 mikrolitre hücre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak ve önceden soğutulmuş elektroporasyon cuvette hücre DNA karışımı aktarmak için. İki mikrogramdan fazla DNA eklemeyin.Daha yüksek DNA konsantrasyonu hücreler için toksik ve verimliliği azaltır. Elektroporasyondan sonra, hücreleri hemen hazırlanmış 10 santimetrelik Petri kabına aktarın ve hücrelerin beş saat boyunca iyileşmesini bekleyin. Bir nakavt, knock-in veya bir hareket beş knock-in için bir transfectant seçmek için, yüzey üzerinde sıvı borulama tarafından Petri çanak hücreleri ayırmak.Daha sonra, metin protokolüne göre seçici aracının üç seyreltme ayarlayın. Son olarak, 96-iyi düz alt doku kültür plakaları her kuyuiçine hazırlanan seyreltme 150 mikrolitre dağıtın. Bu protokolde çift muhabir ekstrakromosomal plazmid sistemi gösterilmiştir.Transfeksiyondan 32 saat sonra, hücrelerin çoğu hem floresan etiketli füzyon proteinlerini ifade etti. Bir hareket beş M kiraz knock-in ve bir NC4 de denendi. Bir agarose jel üzerinde sindirim çalıştırdıktan sonra iki bant elde edildi.4127 baz çifti bandı istenilen yapıyı içerir. Saflaştırılmış DNA NC4 hücrelerinin transfeksiyonu için kullanıldı. NC4 transfeksiyonunun iki klonu PCR ile analiz edildi ve her ikisi de öngörülen bant modellerini gösterdi.Güney leke sonra PCR sonuçlarını doğrulamak için kullanılmıştır. NC4 ax2 hücrelerinden daha bakteriyel çimler üzerinde daha hızlı büyüdü. Dört saat sonra, NC4 hücrelerinin daha Ax2 hücreleri daha agarose altında tarama başardık.NC4 hücreleri daha hızlıydı ve folata Ax2 hücrelerinden daha güçlü kemotaktik yanıt gösterdi. Her zaman yeni kurulmuş SM plakaları hücreleri kullanın. Dört günden daha eski hücreleri asla kullanmayın, aksi takdirde verimlilik düşer.Taze izole, nonextenic, beyaz HAP suşları genellikle dictyosteliums bir ruching veya sosyal davranış ile ilgili soruları ele almak için kullanılır. Moleküler genetiği bu izole ler aracılığıyla uygulayabilesin.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yenilenebilir Biyoyakıt ve Biyokimyasal Üretim için bir Sıradışı Maya Genetik Mühendisliği

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizleri roman proteinler açıklayacak OpenProt veritabanı kullanarak kanonik olmayan açık okuma çerçevesi tercüme

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...