Name: activity-based training on a treadmill with spinal cord injured wistar rats
Uploaded: 2019-01-16T14:30:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats at JoVE.com

Die Autoren erkennen DRS. Patricia Ward, April Herrity und Susan Harkema für ihre Eingabe und Beratung, Christine Yarberry für chirurgische Hilfe, Yangsheng Chen, Andrea Willhite und Johnny Morehouse für technische Hilfe und Darlene Burke für Hilfe mit Statistiken und Verhaltensstörungen Bewertungen. Finanzielle Unterstützung für diese Arbeit wurde durch das Department of Defense (W81XWH-11-1-0668 und W81XWH-15-1-0656) und Kentucky Rückenmark und Head Injury Research Trust (KSCHIRT 14-5) zur Verfügung gestellt.

Alle beschriebene Methoden wurden von der University of Louisville institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt.
1. vor Verletzungen Handlings- und Prüfautomaten (eine Woche vor dem SCI)
<ol><li>Behandeln Sie jede Ratte für einen Zeitraum von 5-10 min. einmal pro Tag für fünf Tage. Hinweis: In diesem Protokoll werden Erwachsene männliche Wistar-Ratten, die sind zunächst ca. 50 Tage alt und wiegen 200-225 g verwendet. Ratten in diesem Zeit-Punkt sind vor Verletzungen gewöhnt sich nicht an das Geschirr, das für LT verwendet wird, wie volle Nutzung der Hintergliedmaßen erlaubt die Ratte aus der Jacke zu entkommen.</li>
	<li>Tests jeder vor Verletzungen, die studienspezifischen ist (z. B.die Autoren tun metabolische Käfig Bewertungen für Studien, bei denen die Auswirkungen der SCI auf Blase und Darm-Funktion).</li>
</ol>(2) Rückenmark Prellung25,26,27,28
<ol><li>Betäuben Sie Tiere mit Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) Gemisch intraperitoneal entsprechend vorgesehenen Dosierung Tabelle (Tabelle 1). Zusätzliche Dosierung je nach Bedarf zu verwalten. Narkose Tiefe mindestens alle 10 Minuten durch die Beurteilung der Hornhaut, palpebrale, Pedal "," Schweif drücken "und" Pinna Reflexe zu testen.</li>
	<li>Rasieren Sie Haar von der Rückseite des Tieres, wo sind Schnitt und Verletzungen auftreten. Der OP-Bereich mit Dermachlor 4 % chirurgische Peeling zu reinigen. Ein lang wirkendes allgemeine Antibiotikum zu verwalten (z. B.0,5 ccm Pro Pen G subkutan).</li>
	<li>Legen Sie das narkotisierten Tier auf ein Heizkissen auf eine niedrige Einstellung für normale Körpertemperatur zu halten.</li>
	<li>Lage des gezielten Läsion Ebene basierend auf Wirbelkörper Protuberanzen und mit einem Skalpell #10 zu schätzen, einen geschätzten 5 cm Einschnitt auf der Rücken des Tieres, direkt oberhalb der Mittellinie Wirbel machen.</li>
	<li>Für Mitte-Thorax Prellungen aussetzen der T8/T9-Ebene des Rückenmarks über Entfernung (mit Rongeurs) von der Überlagerung T7 Wirbelkörper Lamina.</li>
	<li>Die Prellung (für einen mittelschweren bis schweren Grad der SCI, gewaltsam 210 Kdyn mit keine Verweilzeit) durchzuführen mit einem Prellung-Gerät wie einen unendlichen Horizont Impaktor29,18.</li>
	<li>Naht die Muskelschicht und Faszie über das Rückenmark mit 4: 0 Durchmesser Monofile und schließen Sie die Haut mit 9 mm chirurgische Wunde Clips.</li>
	<li>Postoperative Drogen wie Gentamicin Sulfat (5 mg/kg pro Tag für 5 Tage, Antibiotika, Infektionen der Blase zu vermeiden) und Meloxicam zu verwalten (1 mg/kg subkutan, Schmerzmittel für die ersten 48 h und dann als notwendig).</li>
	<li>Setzen Sie Tiere in einem sauberen Käfig auf ein Heizkissen. Überprüfen Sie tierische Vitalfunktionen alle 15 Minuten bis sie vollständig aus der Narkose erwacht sind.  Am ersten postoperativen Tag werden die Tiere ermutigt, mit einem süßen Leckerbissen zu essen. Für die ersten 48 h (dreimal täglich zum Zeitpunkt der manuellen Crede - siehe 2.10), Ratten werden aufgrund von Inaktivität, Vokalisation in Reaktion auf die Handhabung und mangelnde Lust, Essen und trinken überwacht.  Wenn Analgesie unzulänglich gefunden wird, wird das tierärztliche Personal kontaktiert. Während der ersten zwei Wochen Erholungsphase sind die Tiere auf Anzeichen einer Infektion oder andere Komplikationen beobachtet. Einmal reflex Entleerung Renditen, die Tiere sind tendenziell zweimal täglich (morgens und am späten Nachmittag). Tiere mit Infektionen oder signifikanten Gewichtsverlust werden sofort eingeschläfert. In Bezug auf Essen und Wasseraufnahme, die Cut-off-Punkt für Euthanasie ist wenn das Tier etwas über 20 % erreicht hat Gewichtsverlust. Normale Gewichtsverlust nach der Operation und Nichtgebrauch Atrophie der Muskeln unterhalb der Verletzung ist 15-20 %. Alle Tiere sind mindestens einmal wöchentlich gewogen.</li>
	<li>Durchführen der Blasenentleerung Verfahren mit Hilfe der manuellen Credé Manöver 3 Mal pro Tag (08:00, 15:00, 22:00) bis reflexive Blasenfunktion (3-6 Tage im Durchschnitt für Prellungen)26,30zurückgekehrt ist.</li>
</ol>3. Ausbildungsphase
<ol><li>Beginnen Sie LT nicht früher als zwei Wochen Post-SCI, wie initiierende Interventionen zu früh sekundäre Verletzungen Kaskaden31verschlimmern können.</li>
	<li>Woche 1 Akklimatisierung zu Laufbandtraining: Transport der Ratten, die ein ruhiges Zimmer, das für die Ausbildung gewidmet ist.</li>
	<li>Am 1. Tag teilen Sie nach dem Zufallsprinzip und gleichmäßig die SCI-Tiere in ausgebildete und nicht ausgebildete Kontrollgruppen, um mögliche Variabilität in der Verletzung selbst sowie der Grad der Spontanheilung nach Prellung zu berücksichtigen. Zum Beispiel Ratten in 4 getrennten Gruppen unterteilen: vierbeinigen ausgebildete (QT), Vordergliedmaße nur ausgebildete (FT), ungeübte Kontrolle (NT) und ungeübte Hause Käfig Steuern (HC). Eine Sham-Gruppe, wo Tiere erhalten eine Laminektomie aber keine Verletzungen und sind ansonsten identisch mit den anderen Gruppen behandelt, kann auch als eine unverletzte Kontrollgruppe ohne Training verwendet werden.</li>
	<li>Stellen Sie jedes Tier im jeweiligen Kabelbaum (Abbildung 1) und befestigen Sie Gurte um den Körper Gewicht Unterstützungsmechanismus über das Laufband über Krokodilklemmen die nach Gewicht Unterstützung Springs (Abbildung 2 und Abbildung 3) befestigt sind. Dazu muss das Tier an einer Stelle befestigt werden, auf dem Laufband, um sicherzustellen, dass sie in der vorgesehenen Fahrtrichtung und Geschwindigkeit gehen. Hinweis: Aufgrund der zeitlichen und personellen Zwänge führt die Autoren Lab tägliches Training in Gruppen von zwölf Tieren, drei in jeder Teilmenge-Gruppe.</li>
	<li>Starten Sie die Akklimatisierung, nach der zuvor veröffentlichten Protokoll17. Beginnen Sie die Akklimatisierung zu LT (Anfang der Woche 3 Post-SCI) mit einem allmählichen Laufband Exposition Regimen, erhöhte sich von 10 min an Tag1 auf das volle Ziel 58 min. in der ersten Woche (Tabelle 2). In der Regel von Tag 4, die Tiere gut auf dem Trainingsplan zu akklimatisieren. Wenn ein Tier nicht fortschreiten am dritten Tag der Akklimatisierung zu zeigen, die Zeit wäre reduziert und zusätzliche Tage am ein allmählicher Hochlauf (selten) hinzugefügt.<ol>
<li>Wenn ein Tier während des ersten Tages oder zwei nicht an den Einschluss der Kabelbaum und Laufband anpasst, die Trainingseinheit zu stoppen, aus dem Gurtzeug zu entfernen, legen Sie das Tier zurück in seinen Käfig, und ihm zwei behandelt, die dazu beitragen, zukünftige Erfüllung. Legen Sie am nächsten Tag das Tier im Gurtzeug und Gewicht Support-System wieder für 10 Minuten. An den folgenden Tagen erhöht die Dauer von 20 Minuten zunächst dann weiterhin die Trainingsdauer täglich zu erhöhen, um voll im Training von Tag 10 zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Folgen Sie den detaillierten Trainingsplan in Tabelle 2zur Verfügung gestellt.<ol>
<li>Aufgrund der begrenzten Hind Gliedmaßen Verwendung nach der Verletzung erfordert Ratten in der QT-Gruppe manuelle Erleichterung für die richtige Pfote Platzierung beim treten auf dem Laufband. Verwenden Sie einen Finger an jeder Hand (häufig die dritte Ziffer) zur Hüfte/Taille Unterstützung Unterstützung. Wenn das Tier weitere Unterstützung bei der Verstärkung erforderlich sind, verwenden Sie diese denselben Finger Druck oberhalb des Knies, verstärkt zu initiieren. Verwenden Sie ggf. einen separate Finger (häufig die fünfte Stelle), um den Fuß verstärkt zu unterstützen. Hinweis: Die Höhe der Körper Gewicht Unterstützung benötigt ist von Tier zu Tier unterschiedlich und ändert sich im Laufe der Ausbildung. Der Frühling-Support-System gibt genügend Unterstützung, das Tier für eine richtige Gangart positioniert zu halten. Weiterer Unterstützung erfolgt nach Bedarf durch den Trainer pro oben. Beachten Sie, dass ein zentrales Element der LT funktional entsprechende Pfote Platzierung für die Intensivierung und Koordination, die vom Trainer gefördert und ist unabhängig von der Support-System interlimb.</li>
		<li>Stellen Sie für die FT-Übung-Gruppe Körper-Gewicht-Support-System um die Hinterbeine dafür keine sensorische Reize, die Pfoten und keine Gewichtsbelastung erfolgt durch den Kontakt mit dem Laufband leicht zu erhöhen. Hinweis: Die FT-Gruppe dient als Übung und metabolische Kontrolle, ähnlich wie eine Handkurbel Übung in menschlichen Activity based Training Studien.</li>
		<li>Die NT-Gruppe genutzt und befestigt, das Körper-Gewicht-Support-System auf ähnliche Weise als die QT und den Ort der NT-Gruppe in der Nähe der QT-Gruppe auf einer stationären Oberfläche (Abbildung 2 und Abbildung 3). Hinweis: Die NT-Gruppe erhält keine Aktivität und Steuerungen für alle möglichen Auswirkungen der für einen längeren Zeitraum hinweg genutzt werden.</li>
		<li>Eine Gruppe nach Hause Käfig kann als eine zusätzliche Kontrolle dienen. Diese Tiere zu der Ausbildungsstätte als weiteren Schritt für diese Gruppe zu transportieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vom 7. Tag nach Beginn der LT,-10 trainieren jedes Tier einmal täglich, jeden Tag bis zum Tag der Beendigung der Studie. Im Anschluss an jeden Tag Training verwöhnen Sie jedes Tier zuckerhaltige, Compliance zu verstärken. Weiter tägliche LT auf Tieren nach der 1 h-Schema gemäß Tabelle 2 für die Dauer der Studie (z.B.8-12 Wochen, das ungefähr 80 einstündige Sitzungen zu imitieren, die in klinischen Studien durchgeführt werden)9.</li>
</ol>(4) Sterbehilfe und Gewebe-Sammlung
<ol><li>Verabreichen Sie an das Tier, das an AVMA Richtlinien zur Euthanasie hält eine tödliche Dosis der Narkose.</li>
	<li>Wenn das Herz gerade schlägt, sofort Vorrichtung das Tier in einem dedizierten Abzug zuerst mit kaltem heparinisierten Kochsalzlösung, gefolgt von kalten, 4 % Paraformaldehyd Lösung.<ol>
<li>Mithilfe Chirurgische Scheren einen Schnitt in das Zwerchfell, Freilegung der Brusthöhle zu machen beginnen. Weiter zu durchschneiden des Brustkorbs Rostral auf beiden Seiten, den Brustkorb zu entfernen. Nadel in den linken Ventrikel des Herzens Perfusion und Klemmen Sie Nadel mit Arterienklemmen, dann clip den rechten Vorhof.</li>
		<li>Mit einen Pumpmechanismus Perfusion, damit die kalten heparinisierten Kochsalzlösung durch das Tier Blutgefäße fließen. Einmal klar saline fließt vom rechten Vorhof, schalten Sie auf die kalte 4 % Paraformaldehyd-Lösung, bis der Körper versteift hat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie notwendige Gewebe wie Niere, Blase, Darm, Gehirn, sensorischen Ganglien und Rückenmark, und in 4 % Paraformaldehyd für bis zu 48 h bei 4 ° c lagern Verschieben Sie nach 24-48 h Gewebe 30 % Saccharose und Store bei 4 ° C.</li>
	<li>Verschieben Sie gesammelte Gewebe zu einer 30 % Saccharose/Phosphat Kryoprotektivum Lösung zwischengespeichert, bis Gewebe bereit zum Schneiden ist. Um Gewebe zu schneiden, eingebettet in einem Gewebe Einfrieren Compound und schneiden auf einem Kryostat auf gewünschte Dicke abhängig von der Art des Gewebes verwendet (z.B. 35 µm für Gehirn und Rückenmark Gewebe, 5-7 µm für Orgel Gewebe).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ahuja, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+spinal+cord+injury.">Traumatic spinal cord injury.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17018 (2017).</li><li>Behrman, A. L., Harkema, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+training+after+human+spinal+cord+injury:+a+series+of+case+studies.">Locomotor training after human spinal cord injury: a series of case studies.</a> Physical Therapy. 80 (7), 688-700 (2000).</li><li>Anderson, K. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+gene+expression+in+soleus+muscle+is+dependent+on+time+after+spinal+cord+injury+in+rats.">Exercise-induced gene expression in soleus muscle is dependent on time after spinal cord injury in rats.</a> Muscle &amp; Nerve: Official Journal of the American Association of Electrodiagnostic Medicine. 29 (1), 73-81 (2004).</li><li>De Leon, R., Hodgson, J., Roy, R., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+weight-bearing+hindlimb+standing+following+stand+training+in+the+adult+spinal+cat.">Full weight-bearing hindlimb standing following stand training in the adult spinal cat.</a> Journal of Neurophysiology. 80 (1), 83-91 (1998).</li><li>Pearson, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in brain research. 143, 123-129 (2004).</li><li>Gerasimenko, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed-forwardness+of+spinal+networks+in+posture+and+locomotion.">Feed-forwardness of spinal networks in posture and locomotion.</a> The Neuroscientist. 23 (5), 441-453 (2017).</li><li>Courtine, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+nonfunctional+spinal+circuits+into+functional+states+after+the+loss+of+brain+input.">Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input.</a> Nature Neuroscience. 12 (10), 1333 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Unsere Methoden der ABT an Ratten nach SCI eine neuartige therapeutische Intervention ist. Während andere Methoden der Übung und training in Tiermodellen Schritt35,existieren können imitiert36,37, diese Methode LT durchgeführt klinisch in der SCI-Bevölkerung, wo wir viel versprechende Ergebnisse23gesehen haben. Mit der Kombination aus unserer Einrichtung, Therapie und Verwendung von Kontrolltieren hilft die Ergebnisse aus der Nutzung unserer Ausbildung Paradigma um zu verstehen die Vorteile der ABT nach Sci Zukunft Anwendungen dieses Protokolls sind die beschriebenen Ergebnisse der Beobachtung ABT auf verschiedenen Zeitrahmen sowie die Wirkung, dass ABT auf Erholung von verschiedenen Ebenen und Blöcke von Verletzungen.
Eine Einschränkung dieses Entwurfs ist die Länge der Zeit für solche Experimente. Angesichts der Tatsache, dass unser Trainingsprogramm für jedes Tier 1 Stunde pro Tag, jeden Tag für 10 Wochen erfordert ist erhebliche Personalkosten und eine organisierte Zeitplan eine Notwendigkeit. Ein wichtiger Aspekt, der besondere Aufmerksamkeit erfordert beinhaltet die FT-Gruppe, die einzigartige Gurtzeuge mit Haken und Ösen Material Gurte zur Sicherung der hinteren Gliedmaßen über das Laufband für die Beseitigung von Gewicht zu unterstützen hat. Es ist darauf zu achten, dass das Tier nicht Gewichtsentlastung, erhält deshalb eine Plattform nicht unter die Ratte Hinterpfoten positioniert ist. Darüber hinaus, wie frühere Studien gezeigt haben, dass die sensorische Input ein Haupttreiber der Bewegungsapparat Plastizität in den Rückenmark38,39,40 ist, gibt es ein ständiger Bedarf der Umgang mit der QT-Gruppe zu unterstützen mit treten ähnlich wie Physiotherapeuten im klinischen Setting.
Eine wichtige Änderung, die auf das handelsübliche Laufband-System für die Tiere verwendet wurde die Polarität umkehren. Nach dem Aussetzen des Motors, bekamen die positiven und negativen Drähte, die Richtung, die das Laufband bewegt sich umkehrt. Dadurch mehr Platz und leichteren Zugang zu erreichen und helfen, die Tiere zu trainieren (das System kommt mit einem Schock-Raster an einem Ende, die entworfen ist, um zu verhindern, dass Tiere nicht vorgespannt, spinally intakt Verstärkung aus dem Laufband Gürtel).

Weltweit, zwischen 250.000-500.000 neue Verletzungen des Rückenmarks (SCI) Fällen entstehen entweder durch Degeneration, Krankheiten oder die meisten häufig (bis zu 90 %) Trauma1. Nach traumatischen SCI, eine Reihe von physiologischen Veranstaltungen statt, die zu neurologischen Defiziten führen, die eine Vielzahl von Körperfunktionen beeinflussen. Wegen der chronischen Defizite, die SCI zu folgen, ist die Entwicklung und Erprobung wirksamer Behandlungsmethoden entscheidend. Bis vor kurzem konzentrierten Sanierungsstrategien am häufigsten auf Wiederherstellung der Mobilität2,3. Nach SCI Rang Patienten Blase/Harn, Darm- und sexuellen Funktionen zu den höchsten Lebensqualität Komplikationen brauchen bessere Management1,4,5. Ausrichtung auf Blase, deshalb Darm und Sexualfunktion von größter Bedeutung von einer Rehabilitation Sicht1,4,5.
Sport und Bewegungsorgane Training (LT) sind häufig genutzte rehabilitative Therapien in der SCI Patientenpopulation mit vielen Vorteilen wie z. B. Herz-Kreislauf-Funktion, Blase/Harn Funktion und Mobilität6,7,8 ,9,10. Es ist aus diesem Grund, dass wir eine ähnliche Modalität in unseren vorklinischen Rattenmodell SCI nutzen. Es ist unser Ziel, welche Auswirkungen festzustellen, LT auf SCI Wistar-Ratten, insbesondere im Hinblick auf oberen (Niere) und unteren (Blase, externen urethralen Sphinkter) Harn-Trakt Funktion, Darmfunktion und sexuelle Funktion hat. LT ist darüber hinaus nachweislich ausreichend bei der Aktivierung des neuromuskulären Systems unterhalb der Verletzung, die die Menge an Plastizität innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS)11,12beeinflussen kann.
Der Erfolg der LT in prä-klinischen Studien ist in großen13,14 und kleiner15,16,17,18,19 SCI Tiermodellen gut dokumentiert. Hinweise darauf, dass afferenter sensorischer Input zur Verfügung gestellt von LT ausreichend ist, um spinale reflex Wege zu stimulieren, die Plastizität führen und Verbesserungen der sensorisch-motorischen9,20 Funktion. LT-Vorteile bei vegetativen Funktionen wurden nicht gut charakterisiert. Aus diesem Grund setzen wir unsere Ausbildung Paradigma mit einem Fokus auf autonome Zielparameter mit vier verschiedene Gruppen, die zwei nicht ausgebildeten Steuerelemente enthalten und eine metabolische/Übung nicht belasten-Gruppe neben einer LT-Gruppe, die das Timing imitiert, Sitzungsdauer, manuelle Hilfe und Support für Weight, die in klinischen Studien19,21,22,23,24verwendet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Exer-3R treadmill</td>
			<td>Columbus Instruments</td>
			<td></td>
			<td>reversed polarity of the motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Body weight support system</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>modified spring scales with alligator clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat harness</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Our harnesses are custom made; please refer to Figure 1 for visual.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite Horizon (IH) impactor device</td>
			<td>Precision Systems and Instrumentation</td>
			<td>Model 0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-2053-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Eloxiject)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC 116695-6925-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate (GentaFuse)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC 11695-4146-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urethane, 97%</td>
			<td>Argos Organics</td>
			<td>CAS 51-79-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 monofilament suture kit (4-0 Ethilon Nylon Suture)</td>
			<td>Ethicon, LLC</td>
			<td>205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel suture clips (9mm Auto Clips)</td>
			<td>MikRon Precision, Inc.</td>
			<td>1629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Mastex Industries, Inc</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tootie Fruitys cereal</td>
			<td>Malt O Meal</td>
			<td></td>
			<td>For training reward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 surgical scalpel blades</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>SKU: 4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activity-based training on a treadmill with spinal cord injured wistar rats

Verletzungen des Rückenmarks (SCI) ergibt dauerhafte Defizite, die Mobilität und eine Vielzahl von im Zusammenhang mit autonomen Funktionsstörungen enthalten. Bewegungsorgane Training (LT) auf einem Laufband ist weit verbreitet als Reha-Tool in der SCI-Bevölkerung mit viele Vorteile und Verbesserungen für das tägliche Leben. Wir nutzen diese Methode des Activity based aufgabenspezifische Schulung (ABT) bei Nagetieren nach SCI, beide zu erhellen die Mechanismen hinter solchen Verbesserungen und zu verbessern und verbessern bestehende klinische Rehabilitation Protokolle. Unsere aktuellen Ziel ist es, die Mechanismen, die ABT-induzierte Verbesserungen im Harn bestimmen, Darm- und Sexualfunktion in SCI Ratten nach ein mittelschwerer bis schwerer Ebene der Prellung. Nach der Sicherung jedes einzelnen Tieres in einem maßgeschneiderten verstellbare Weste, sind diese zu einem Fördermechanismus der vielseitige Körper Gewicht, abgesenkt, um eine modifizierte dreispurigen Laufband und unterstützte im Schritt-Training für 58 Minuten, einmal pro Tag für 10 Wochen geschützt. Dieses Setup ermöglicht die Ausbildung der vierbeinigen sowohl Vordergliedmaße nur Tiere, neben zwei verschiedenen ungeübte Gruppen. Vierbeinigen ausgebildete Tiere mit Gewicht Körperunterstützung unterstützt werden von einem Techniker anwesend, bei der verstärkt mit richtigen Hind Gliedmaßen Platzierung nach Bedarf, während am kaudalen Ende darauf keinen hinteren Gliedmaßen Kontakt Vordergliedmaße nur ausgebildete Tiere gezüchtet werden die Laufband und keine Belastung. Eine ungeübte SCI-Gruppe von Tieren befindet sich in einem Kabelbaum und liegt neben dem Laufband, während die andere SCI Kontrollgruppe in seinem Hause Käfig im Schulungsraum in der Nähe bleibt. Dieses Paradigma ermöglicht die Ausbildung von mehreren SCI Tiere auf einmal, wodurch es mehr zeiteffizient zusätzlich zu gewährleisten, dass unsere präklinischen Tiermodell die klinische Darstellung als imitiert so nah wie möglich, insbesondere in Bezug auf den Körper Gewichtsentlastung mit manuelle Unterstützung.

Im Anschluss an diese Ausbildung Protokoll wurde dokumentiert, dass nur die QT-Tiere zeigen überlegene Bewegungsorgane Funktion im Vergleich zu den anderen18Gruppen. Jedoch aufgrund der Beschaffenheit unseres Labors soll unser Hauptaugenmerk nicht Bewegungsorgane Nutzen des Activity based aufgabenspezifische Schulung (ABT), einschließlich Blase, Darm und Sexualfunktion untersucht. Zum Beispiel haben wir zuvor Daten veröffentlicht, die zeigt, LT Ergebnisse in eine Übung-induzierte Reduktion des Polyurie in QT und FT der SCI Ratten (Abbildung 4)17. Auch eine Verletzung-induzierte Abnahme bei der Umwandlung von Wachstumsfaktor-β (TGF-β) Ausdruck in der Niere, bezeichnend für eine veränderte Immunantwort galt nicht in QT und FT-Gruppen, die TGF-β Niveau ähnlich Sham (keine Verletzungen) Tiere hatte. In der gleichen Studie17war wach Cystometry vor Euthanasie und Gewebe Sammlung durchgeführt. Die maximale Amplitude der Blase Kontraktionen während nichtig Zyklen war nicht signifikant unterschiedlich in Sham, QT und FT-Gruppen, während der NT-Gruppen signifikant veränderten blieb. Zusammen, zeigen diese Daten eine positive Bewegung Ergebnis auf die Gesundheit und Blase Nierenfunktion, verbessert so Harnfunktion nach Sci.
Die Mechanismen, die zugrunde liegenden Polyurie innerhalb der SCI Bevölkerung ist derzeit nicht klar, aber ist wahrscheinlich multifaktoriellen32. Einige haben vermutet, zum Beispiel, dass Bündelung von Flüssigkeit in den unteren Extremitäten während SCI Personen im Rollstuhl zu flüssige Überlastung und erhöhte Fluid Eliminierung während Haltungs Schichten (z. B. verschieben vom sitzen zum liegen)33führen kann. Solche Erklärung hält sich nicht für den präklinischen Modell, was führte uns zunächst auf Arginin-Vasopressin (AVP), das Hormon zu konzentrieren, die Flüssigkeit Homöostase im Körper steuert und mit Übung moduliert werden kann. AVP steuert Fluid Homöostase durch Aktivierung des V2-Rezeptors in den Nieren die Resorption von Wasser aus der Nieren sammeln Kanäle34erleichtert. Vorläufige Ergebnisse bei einem Pilotversuch (chronische Zeit-Punkt mit einer Läsion Schweregrad - 210 Kdyn Fangstoss) zeigen eine positive Wirkung der Übung (LT und FT) auf V2-Rezeptor-Ebenen in der Ratte Niere (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58983/58983fig1.jpg"> Abbildung 1: maßgeschneiderte Geschirre Größe für männliche Wistar-Ratten. QT und NT Tiere befinden sich in der gleichen Art von Jacke (A) für die Nutzung der hinteren Gliedmaßen bei QT Tiere erlaubt. Es gibt zusätzliche Gurte genäht auf den Gurt für FT Tiere (B) verwendet, um den hinteren Gliedmaßen, versichert keine Unterstützung für den Körper Gewicht heben. Der große Haken und Ösen Materialabschnitte des Kabelbaums ermöglichen einfache Anpassungen an verschiedene Tiere und Änderungen in der Größe eines einzelnen Tieres im Laufe der Zeit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58983/58983fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58983/58983fig2.jpg"> Abbildung 2: Training Station Setup. Körper Gewicht Unterstützungsmechanismus rund um das Laufband für NT (ganz links), QT (Mitte) oder FT (rechts) Gruppen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58983/58983fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58983/58983fig3.jpg"> Abbildung 3: Trainingsstation mit Tieren. Oben (A) und (B) Seitenansicht zeigt Körpergewicht unterstützen Mechanismus und den Speicherort der Unterstützung Befestigungsclips an den Gurten. Beachten Sie, dass die Hinterbeine des Tieres FT (B) wird ausgelöst und das Laufband Gürtel aus. Einschub (C) schildert einen näheren Blick auf den Clip am Gurtzeug befestigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58983/58983fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58983/58983fig4.jpg"> Abbildung 4: ABT Auswirkungen auf die Ratte Polyurie nach Sci Das Gesamtvolumen der Urinausscheidung (A) stieg nach SCI (*; p < 0,05) und nach 9 Wochen LT Training in QT und FT Gruppen aber erhöhte in der NT-Gruppe im Vergleich zu den ausgebildeten Gruppen (#; p < 0,05 blieb) näher an Grundlinie zurück. Alle Gruppen zeigten erhöhte Urinausscheidung im Vergleich zum Ausgangswert bei 9 Wochen und Hohlraumvolumen (B) erhöht. Es ist wichtig zu beachten, dass die Anzahl der Hohlräume (C) und die Höhe der Wasseraufnahme (D) über alle Fraktionen hinweg unverändert. Werte sind Mittelwerte ± Standardfehler. Diese Zahl ist mit Autor Erlaubnis17neu aufgelegt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58983/58983fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58983/58983fig5.jpg"> Abbildung 5: ABT Auswirkungen auf die Ratte Niere. Western-blot Ergebnisse für Ratte Niere Ebenen von V2-Rezeptoren in 5 Gruppen von 4 Ratten jeweils (20 insgesamt), zeigen Ausdruck für die Protein-Bands zur Verfügung gestellt im Bedienfeld "bedeutet A und Densitometrie Analyseergebnisse der Bands (mit ImageJ; OD = optische Dichte) im Bedienfeld " B" zeigt eine signifikante (*; p < 0,05) Rückgang der Rezeptoren an einer chronischen Zeit-Punkt (12 Wochen) Post-SCI und keinen Rückgang im Vergleich zu Grundlinie (Sham chirurgische Kontrollen) für Gruppen, die von einer Stunde täglich ca. 10 Wochen Fehlerbalken darzustellen Standardfehler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58983/58983fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Ketamin/Xylazin-Dosis Diagramm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Effektive Dosis:</td>
			<td colspan="4">Verwendung von 100 mg/mL Ketamin Lager und 20 mg/mL Xylazin Lager ***</td>
		</tr>
<tr>
<td>80 mg/kg Ketamin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mg/kg Xylazin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">1,0 mL Mischung Injektion = 0,62 mL Ketamin bestand (100 mg/mL) + 0,38 mL Xylazin Brühe (20 mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tierische Gewicht</td>
			<td colspan="2">Mischung-Injektion</td>
			<td>Tierische Gewicht</td>
			<td>Mischung-Injektion</td>
		</tr>
<tr>
<td>(g)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td></td>
			<td>(g)</td>
			<td>(mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>0.13</td>
			<td></td>
			<td>275</td>
			<td>0,36</td>
		</tr>
<tr>
<td>105</td>
			<td>0,14</td>
			<td></td>
			<td>285</td>
			<td>0,37</td>
		</tr>
<tr>
<td>110</td>
			<td>0,14</td>
			<td></td>
			<td>290</td>
			<td>0,38</td>
		</tr>
<tr>
<td>115</td>
			<td>0,15</td>
			<td></td>
			<td>300</td>
			<td>0,39</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>0,16</td>
			<td></td>
			<td>305</td>
			<td>0,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>125</td>
			<td>0,16</td>
			<td></td>
			<td>310</td>
			<td>0,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>130</td>
			<td>0,17</td>
			<td></td>
			<td>315</td>
			<td>0,41</td>
		</tr>
<tr>
<td>135</td>
			<td>0.18</td>
			<td></td>
			<td>320</td>
			<td>0,42</td>
		</tr>
<tr>
<td>140</td>
			<td>0.18</td>
			<td></td>
			<td>325</td>
			<td>0,42</td>
		</tr>
<tr>
<td>145</td>
			<td>0,19</td>
			<td></td>
			<td>330</td>
			<td>0,43</td>
		</tr>
<tr>
<td>150</td>
			<td>0,2</td>
			<td></td>
			<td>335</td>
			<td>0,44</td>
		</tr>
<tr>
<td>155</td>
			<td>0,2</td>
			<td></td>
			<td>340</td>
			<td>0,44</td>
		</tr>
<tr>
<td>160</td>
			<td>0.21</td>
			<td></td>
			<td>345</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
<tr>
<td>165</td>
			<td>0.21</td>
			<td></td>
			<td>350</td>
			<td>0,46</td>
		</tr>
<tr>
<td>170</td>
			<td>0,22</td>
			<td></td>
			<td>355</td>
			<td>0,46</td>
		</tr>
<tr>
<td>175</td>
			<td>0,23</td>
			<td></td>
			<td>360</td>
			<td>0,47</td>
		</tr>
<tr>
<td>180</td>
			<td>0,23</td>
			<td></td>
			<td>365</td>
			<td>0,47</td>
		</tr>
<tr>
<td>185</td>
			<td>0,24</td>
			<td></td>
			<td>370</td>
			<td>0,48</td>
		</tr>
<tr>
<td>190</td>
			<td>0,25</td>
			<td></td>
			<td>375</td>
			<td>0.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>195</td>
			<td>0,25</td>
			<td></td>
			<td>380</td>
			<td>0.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>200</td>
			<td>0.26</td>
			<td></td>
			<td>385</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>205</td>
			<td>0,27</td>
			<td></td>
			<td>390</td>
			<td>0.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>210</td>
			<td>0,27</td>
			<td></td>
			<td>395</td>
			<td>0.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>215</td>
			<td>0,28</td>
			<td></td>
			<td>400</td>
			<td>0,52</td>
		</tr>
<tr>
<td>220</td>
			<td>0.29</td>
			<td></td>
			<td>410</td>
			<td>0,53</td>
		</tr>
<tr>
<td>225</td>
			<td>0.29</td>
			<td></td>
			<td>420</td>
			<td>0,55</td>
		</tr>
<tr>
<td>230</td>
			<td>0,3</td>
			<td></td>
			<td>430</td>
			<td>0,56</td>
		</tr>
<tr>
<td>235</td>
			<td>0,31</td>
			<td></td>
			<td>440</td>
			<td>0,57</td>
		</tr>
<tr>
<td>240</td>
			<td>0,31</td>
			<td></td>
			<td>450</td>
			<td>0,59</td>
		</tr>
<tr>
<td>245</td>
			<td>0,32</td>
			<td></td>
			<td>460</td>
			<td>0,6</td>
		</tr>
<tr>
<td>250</td>
			<td>0,33</td>
			<td></td>
			<td>470</td>
			<td>0,61</td>
		</tr>
<tr>
<td>255</td>
			<td>0,33</td>
			<td></td>
			<td>480</td>
			<td>0,62</td>
		</tr>
<tr>
<td>260</td>
			<td>0,34</td>
			<td></td>
			<td>490</td>
			<td>0.64</td>
		</tr>
<tr>
<td>265</td>
			<td>0,34</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
			<td>0,65</td>
		</tr>
<tr>
<td>270</td>
			<td>0,35</td>
			<td></td>
			<td>510</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Anästhesie Dosierung Diagramm basierend auf Gewicht des einzelnen Tieres.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trainingszeit (min)</td>
			<td>Geschwindigkeit (cm/s)</td>
			<td>Dauer (min.)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0-1</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1-2</td>
			<td>8.4</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2-3</td>
			<td>10.8</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3-8</td>
			<td>13.2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8-13</td>
			<td>10.8</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>13-28</td>
			<td>13.2</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>28-33</td>
			<td>10.8</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>33-38</td>
			<td>6</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>38-43</td>
			<td>8.4</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>43-58</td>
			<td>13.2</td>
			<td>15</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Trainingsplan von Geschwindigkeiten, die das Laufband sollten auf entsprechend der Zeit verbrachte bei jeder Geschwindigkeit.

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Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Dieses Protokoll zeigt unser Modell des Activity based Bewegungsorgane Laufbandtraining für Ratten mit Verletzungen des Rückenmarks (SCI). Enthalten sind sowohl vierbeinigen und Vordergliedmaße nur, neben zwei verschiedene Arten von nicht ausgebildeten Kontrollgruppen. Ermittler können Trainingseffekte auf SCI Ratten unter Verwendung dieses Protokolls zu beurteilen.

Activity-based Training auf einem Laufband mit Rückenmark verletzt Wistar-Ratten

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Bewegung und Bewegungstraining werden häufig in rehabilitativen Therapien in der rückengeschädigten Patientenpopulation eingesetzt. Der Hauptvorteil der aktivitätsbasierten Ausbildung besteht darin, dass viele funktionelle Vorteile sowohl in präklinischen Tierstudien als auch in der klinischen Praxis dokumentiert wurden. James Armstrong und Christine Yarberry, beide leitende Forschungstechniker, und Jason Gumbel, ein Student meines Labors, werden das Verfahren demonstrieren. In der Woche vor der Rückenmarksverletzung, behandeln Sie jede Ratte für fünf bis zehn Minuten, einmal täglich für fünf Tage. Am Tag der Verletzung rasieren Sie die Haare von der Rückseite der ersten 200 bis 225 Gramm Ratte an der Stelle der Verletzung, und legen Sie das anästhesierte Tier auf einem Heizkissen bei einer niedrigen Einstellung. Verabreichen Sie Augenschmierstoff, ein lang wirkendes allgemeines Antibiotikum, ein Schmerzmittel und fünf Milliliter physiologische Rinline. Schätzen Sie die Position des zielgerichteten Läsionsniveaus, basierend auf den Wirbelprotuberanzen, und verwenden Sie ein Skalpell der Zahl 10, um einen etwa fünf Zentimeter großen Schnitt auf dem Dorsum des Tieres direkt über den Mittellinienwirbeln zu machen. Mit Hämostaten, ziehen Sie die seitlichen Muskeln, mit 4-0 Seidennaht. Für mittelthorakale Prellungen verwenden Sie Rongeurs, um die überlagernde T7-Wirbellamina zu entfernen, den T8-T9-Spiegel des Rückenmarks freizulegen, und verwenden Sie eine Kontusionsvorrichtung, um die Prellungen durchzuführen. Nach der Übergabe der Verletzungen verwenden Sie Monofilamente mit 4-0 Durchmesser, um den Muskel und die Faszien über dem Rückenmark zu verankern. Und schließen Sie die Haut mit neun Millimeter chirurgischen Wundclips. Weitere fünf Milliliter physiologische Rinline injizieren. Dann legen Sie die Tiere in einzelne saubere Käfige, auf Heizkissen mit genauer Überwachung für die ersten 24-48 Stunden. Verwenden der Bedienungsanleitung Cred

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Forschung

Neurowissenschaften

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Hühnerembryo Spinal Cord Scheibe Kultur Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Untersuchung funktionelle Regeneration im Organotypische Spinal Cord Co-Kulturen auf Multi-Elektroden-Arrays Grown

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

Experimentelle Strategien große Gewebelücken in das verletzte Rückenmark nach akutem zu überbrücken und chronische Lesion

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...