Name: activity-based training on a treadmill with spinal cord injured wistar rats
Uploaded: 2019-01-16T14:30:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats at JoVE.com

Gli autori riconoscono la d. ssa Patricia Ward, aprile Herrity e Susan Harkema per loro ingresso e guida, Christine Yarberry per assistenza chirurgica, Yangsheng Chen, Andrea Willhite e Johnny Morehouse per assistenza tecnica e Darlene Burke per assistenza con statistiche e valutazioni del comportamento. Finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal dipartimento della difesa (W81XWH-11-1-0668 e W81XWH-15-1-0656) e midollo spinale Kentucky e testa ferita Research Trust (KSCHIRT 14-5).

Tutti i metodi descritti sono stati approvati dall'Università di Louisville istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC).
1. pre-infortunio movimentazione e test (una settimana prima di SCI)
<ol><li>Gestire ogni ratto per un periodo di 5-10 minuti una volta al giorno per cinque giorni. Nota: Ratti Wistar maschio adulto che sono inizialmente ~ 50 giorni di età e pesare 200-225 g sono utilizzati nel presente protocollo. Ratti a questo sono tempo-punto pre-infortunio non acclimatati all'imbracatura utilizzata per LT come pieno uso delle zampe posteriori permette il ratto sfuggire la giacca.</li>
	<li>Condurre qualsiasi test di pre-infortunio studio specifico (ad es., gli autori fanno valutazioni gabbia metabolica per gli studi che coinvolgono gli effetti della SCI sulla funzione della vescica e delle viscere).</li>
</ol>2. midollo spinale contusione25,26,27,28
<ol><li>Anestetizzare gli animali con ketamina (80 mg/kg) e la miscela di xilazina (10 mg/kg) per via intraperitoneale secondo la tabella di dosaggio fornito (tabella 1). Amministrare il dosaggio supplementare come stato necessario. Prova profondità anestetica almeno ogni 10 min di valutazione corneale, palpebrale, pedale, pizzico di coda e riflessi di pinna.</li>
	<li>Radersi i capelli dalla parte posteriore dell'animale dove devono verificarsi incisione e lesioni. Detergere l'area chirurgica con Dermachlor 4% scrub chirurgico. Somministrare un antibiotico generale di lunga durata d'azione (ad esempio, 0,5 cc Pro-penna-G per via sottocutanea).</li>
	<li>Metti l'animale anestetizzato su un rilievo di riscaldamento su una posizione bassa per mantenere la temperatura corporea normale.</li>
	<li>Stimare la posizione del livello di lesione mirata basata su protuberanze vertebrali e con un bisturi #10, fare un'incisione di circa 5 cm sul dorso dell'animale, direttamente sopra le vertebre del midline.</li>
	<li>Per medio-toracica contusioni, esporre il livello T8/T9 di tramite rimozione del midollo spinale (con Pinze ossivore) del overlaying lamina vertebrale T7.</li>
	<li>Utilizzando un dispositivo di contusione come un orizzonte infinito impactor29, eseguire la contusione (per una moderata a grave grado di SCI, utilizzare una forza di kdyn 210 con nessun tempo di sosta)18.</li>
	<li>Suturare insieme gli strato muscolare e la fascia sopra il midollo spinale utilizzando monofilo di diametro di 4-0 e chiudere la pelle con clip 9mm chirurgica della ferita.</li>
	<li>Somministrare i farmaci postoperatori, come solfato di gentamicina (5 mg/kg al giorno per 5 giorni; antibiotico per evitare infezioni della vescica) e meloxicam (1 mg/kg per via sottocutanea, analgesico per 48 h prima e poi come necessario).</li>
	<li>Sistemare gli animali in una gabbia pulita su un rilievo di riscaldamento. Controllo animali segni vitali ogni 15 minuti fino a quando non sono completamente svegli dall'anestesia.  Durante il primo giorno post-operatorio, gli animali sono incoraggiati a mangiare con una delizia zuccherina. Per le prime 48 h (tre volte al giorno al momento del manuale crede - v. 2.10), ratti sono monitorati per inattività, vocalizzazione in risposta alla manipolazione e la mancanza di desiderio di mangiare e bere.  Se l'analgesia è risultata inadeguata, viene contattato il personale veterinario. Durante tutta la fase di recupero iniziale di due settimane, gli animali sono osservati per prova dell'infezione o altre complicazioni. Una volta riflesso minzionale restituisce, gli animali sono tendenzialmente due volte al giorno (mattina presto e nel tardo pomeriggio). Immediatamente sono euthanized animali con infezioni o perdita di peso significativa. Per quanto riguarda l'assunzione di cibo e acqua, il cut off point per l'eutanasia è quando l'animale ha raggiunto nulla oltre 20% perdita di peso. Perdita di peso normale dopo chirurgia e disuso atrofia dei muscoli sotto il livello della lesione è 15-20%. Tutti gli animali vengono pesati almeno una volta alla settimana.</li>
	<li>Eseguire procedure usando la manovra di Credé manuale 3 volte al giorno (8, 15, 22) di svuotamento della vescica fino a quando la funzione riflessiva della vescica ha restituito (3-6 giorni in media per contusioni)26,30.</li>
</ol>3. formazione fase
<ol><li>Iniziare non prima di due settimane post-SCI, come gli interventi d'inizio troppo presto possono esacerbare il danno secondario cascades31LT.</li>
	<li>Acclimatazione settimana 1 alla formazione di tapis roulant: i ratti per una camera tranquilla che è dedicata per la formazione di trasporto.</li>
	<li>Il giorno 1, in modo casuale e in modo uniforme dividere gli animali SCI in gruppi di controllo qualificato e non qualificato, a rappresentare la potenziale variabilità in sia la lesione stessa, nonché il grado di recupero spontaneo dopo la contusione. Ad esempio, suddividere ratti in 4 gruppi separati: quadrupede addestrato (QT), sola zampa anteriore addestrato (FT), controllo non addestrato (NT) e gabbia a casa non addestrati controllo (HC). Un gruppo di finto dove gli animali ricevono un laminectomy, ma nessuna ferita e vengono gestiti in caso contrario lo stesso come gli altri gruppi possono essere utilizzati anche come un gruppo di controllo illeso senza formazione.</li>
	<li>Posizionare ogni animale al rispettivo cablaggio (Figura 1) e fissare le imbracature per il meccanismo di sostegno del peso di corpo sopra i tapis roulant tramite morsetti a coccodrillo che sono fissate a molle di sostegno del peso (Figura 2 e figura 3). Ciò richiede l'animale per essere risolto in uno spot sul tapis roulant, assicurando che vanno nella direzione avanti designato e velocità. Nota: A causa di vincoli di tempo e di personale, laboratorio authors' svolge attività di allenamento giornaliero in gruppi di dodici animali, tre in ogni gruppo di sottoinsieme.</li>
	<li>Avviare il processo di acclimatazione seguendo il protocollo precedentemente pubblicato17. Inizio acclimatazione a LT (inizio della settimana 3 post-SCI) con un regime di esposizione graduale tapis roulant, aumentando da 10 min il giorno 1 di destinazione completa di 58 min nella prima settimana (tabella 2). In genere, di 4 giorno, gli animali acclimatare bene per il regime di allenamento. Se un animale non mostrano progressione entro il terzo giorno di acclimatazione, il tempo sarebbe stato ridotto ed extra giorni aggiunti a un più graduale ramp-up (evento raro).<ol>
<li>Se un animale durante il primo giorno o due non si adatta al confino del cablaggio e tapis roulant, interrompere la sessione di allenamento, rimuoverlo dall'imbracatura, posto sul retro degli animali nella sua gabbia e dargli due chicche per contribuire a rafforzare la conformità successiva. Il giorno successivo, metti l'animale nel sistema di supporto imbracatura e peso ancora per 10 min. Nei giorni successivi, aumentare la durata di 20 min inizialmente poi continuano ad aumentare la durata di addestramento al giorno per ottenere una formazione completa di giorno 10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seguire il regime di allenamento dettagliato fornito nella tabella 2.<ol>
<li>A causa della limitata dell'arto uso post-infortunio, ratti nel gruppo di QT richiederà manuale facilitazione per zampa corretto posizionamento durante l'esecuzione sul tapis roulant. Utilizzare un dito su ogni mano (comunemente la terza cifra) per facilitare il supporto anca/vita. Quando l'animale richiede ulteriore assistenza nel fare un passo, è possibile utilizzare questo stesso dito per applicare pressione sopra il ginocchio per iniziare a fare un passo. Se necessario, usare un dito separato (comunemente la quinta cifra) per aiutare il piede a un passo. Nota: La quantità di corpo peso supporto necessario varia da animale ad animale e cambia nel corso di formazione. Il sistema di supporto di primavera dà sufficiente assistenza per mantenere l'animale posizionato per un'andatura corretta. Ulteriore supporto è fornito come necessari per il trainer per sopra. Si noti che un elemento chiave della LT è zampa funzionalmente appropriato posizionamento per fare un passo e interlimb di coordinamento che è promosso dal formatore ed è indipendente dal sistema di supporto.</li>
		<li>Per il gruppo di esercizio FT, regolare il sistema di supporto del peso di corpo per elevare leggermente le zampe per garantire senza stimoli sensoriali per le zampe e senza cuscinetto di peso avviene attraverso il contatto con il tapis roulant. Nota: Il gruppo FT serve come un esercizio ed il controllo metabolico, simile a quella di un esercizio di manovella negli studi di formazione basata sulle attività umane.</li>
		<li>Il gruppo NT imbrigliato e collegato al sistema di supporto del peso di corpo in un modo simile come il QT e posto il gruppo NT vicino al gruppo QT su una superficie stabile (Figura 2 e figura 3). Nota: Il gruppo di NT non riceve nessuna attività e controlli per i potenziali effetti di essere sfruttato per un periodo di tempo prolungato.</li>
		<li>Un gruppo gabbia a casa può servire come un ulteriore controllo. Trasporto di questi animali per la struttura di formazione come un ulteriore passaggio per questo gruppo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Di giorno 7 -10 dopo l'inizio del LT, treno ogni animale una volta al giorno, ogni giorno fino al giorno della cessazione dello studio. Dopo ogni giornata di formazione, dare ogni animale un trattamento zuccherato per rafforzare la conformità. Continuare LT giornalieri su animali che seguono il regime di 1h fornito nella tabella 2 per tutta la durata dello studio (ad es., 8-12 settimane per imitare l'approssimativo 80 sessioni di un'ora che vengono fatte negli studi clinici)9.</li>
</ol>4. l'eutanasia e tessuto collezione
<ol><li>Somministrare una dose letale di anestesia per l'animale che aderisce agli orientamenti AVMA sull'eutanasia.</li>
	<li>Quando il cuore batte a malapena, iniziare immediatamente che irrora l'animale in una cappa dedicato in primo luogo con soluzione fisiologica eparinizzata freddo seguita da freddo, soluzione paraformaldeide al 4%.<ol>
<li>Iniziare utilizzando forbici chirurgiche per fare un'incisione attraverso il diaframma, esponendo la cavità toracica. Continuare a tagliare attraverso la gabbia toracica rostralmente su entrambi i lati, rimuovere la gabbia toracica. Inserire l'ago di aspersione nel ventricolo sinistro del cuore e morsetto ago con emostatiche, poi l'atrio di destra di clip.</li>
		<li>Utilizzando un meccanismo di pompa di perfusione, permettono la soluzione fisiologica eparinizzata freddo a fluire attraverso i vasi sanguigni dell'animale. Una volta chiaro salini flussi dall'atrio di destra, passare alla soluzione fredda paraformaldeide al 4%, fino a quando il corpo è irrigidito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il tessuto necessario come rene, vescica, colon, cervello, gangli sensoriali e del midollo spinale e memorizzare in paraformaldeide al 4% per fino a 48 ore a 4 ° C. Dopo 24-48 h, spostare il tessuto al 30% di saccarosio e conservare a 4 ° C.</li>
	<li>Spostare il tessuto raccolto per un 30% saccarosio/fosfato crioprotettore soluzione tamponata fino a quando il tessuto è pronto per il taglio. Per tagliare i tessuti, incorporare in un composto di congelamento di tessuto e tagliare un criostato a spessore desiderato a seconda del tipo di tessuto utilizzato (ad es., 35 µm per il cervello e il midollo spinale del tessuto, 5-7 µm per tessuti d'organo).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ahuja, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+spinal+cord+injury.">Traumatic spinal cord injury.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17018 (2017).</li><li>Behrman, A. L., Harkema, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+training+after+human+spinal+cord+injury:+a+series+of+case+studies.">Locomotor training after human spinal cord injury: a series of case studies.</a> Physical Therapy. 80 (7), 688-700 (2000).</li><li>Anderson, K. 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L., Valenca, M. M., McCANN, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+control+of+body+fluid+metabolism.">Neuroendocrine control of body fluid metabolism.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 169-208 (2004).</li><li>C&#244;t&#233;, M. -. P., Azzam, G. A., Lemay, M. A., Zhukareva, V., Houl&#233;, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+increase+in+neurotrophic+factors+is+associated+with+an+enhanced+modulation+of+spinal+reflexes+after+spinal+cord+injury.">Activity-dependent increase in neurotrophic factors is associated with an enhanced modulation of spinal reflexes after spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (2), 299-309 (2011).</li><li>Dupont-Versteegden, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+gene+expression+in+soleus+muscle+is+dependent+on+time+after+spinal+cord+injury+in+rats.">Exercise-induced gene expression in soleus muscle is dependent on time after spinal cord injury in rats.</a> Muscle &amp; Nerve: Official Journal of the American Association of Electrodiagnostic Medicine. 29 (1), 73-81 (2004).</li><li>De Leon, R., Hodgson, J., Roy, R., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+weight-bearing+hindlimb+standing+following+stand+training+in+the+adult+spinal+cat.">Full weight-bearing hindlimb standing following stand training in the adult spinal cat.</a> Journal of Neurophysiology. 80 (1), 83-91 (1998).</li><li>Pearson, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in brain research. 143, 123-129 (2004).</li><li>Gerasimenko, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed-forwardness+of+spinal+networks+in+posture+and+locomotion.">Feed-forwardness of spinal networks in posture and locomotion.</a> The Neuroscientist. 23 (5), 441-453 (2017).</li><li>Courtine, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+nonfunctional+spinal+circuits+into+functional+states+after+the+loss+of+brain+input.">Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input.</a> Nature Neuroscience. 12 (10), 1333 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I nostri metodi di ABT sui ratti dopo SCI è un intervento terapeutico novello. Mentre altri metodi di allenamento e addestramento in modelli animali di passaggio possono esistere35,36,37, questo metodo imita effettuati clinicamente nella popolazione umana SCI, dove abbiamo visto promettenti risultati23LT. Con la combinazione del nostro programma di installazione, regime e uso degli animali di controllo, i risultati ottenuti utilizzando il nostro paradigma di formazione verranno aiuterà a capire i benefici di ABT dopo SCI. Future applicazioni del presente protocollo comprendono osservando i risultati descritti di ABT a tempi differenti di addestramento così come l'effetto che ABT ha il recupero da diversi livelli ed extent della ferita.
Una limitazione di questo disegno è la lunghezza del tempo per tali esperimenti. Dato che il nostro regime di allenamento per ogni animale richiede 1 ora al giorno, ogni giorno per 10 settimane, tempo notevole dei personali e una pianificazione organizzata è una necessità. Un aspetto importante che richiede un'attenzione speciale coinvolge il gruppo FT, che ha unici imbracature con gancio-e-loop cinghie materiale per proteggere le zampe sopra il tapis roulant per l'eliminazione del peso di supporto. È importante garantire che l'animale non riceve supporto peso, motivo per cui una piattaforma non è posizionata sotto le zampe posteriori del ratto. Inoltre, come gli studi precedenti hanno indicato che l'input sensoriale è un conducente principale della plasticità del sistema locomotore del midollo spinale38,39,40, c'è un costante bisogno di gestire il gruppo QT per assistere con un passo simile a fisioterapisti nella regolazione clinica.
Un'importante modifica apportata al sistema di tapis roulant disponibili in commercio utilizzato per gli animali era inversione della polarità. Dopo aver esposto il motore, i cavi positivo e negativi sono stati commutati che inverte la direzione che si muove il tapis roulant. Questo permette più spazio e più facile accesso per raggiungere e aiutare gli animali (il sistema è dotato di una griglia di scossa ad una estremità che è stata progettata per impedire che gli animali non sfruttato, livello spinale intatti stepping fuori il nastro).

A livello globale, tra 250.000-500.000 nuove lesioni del midollo spinale (SCI) casi sorgono a causa di degenerazione, malattie o più comunemente (fino al 90%) trauma1. Dopo SCI traumatico, una serie di eventi fisiologici hanno luogo che provocano deficit neurologici che interessano una moltitudine di funzioni corporee. Dovuto il deficit cronico che seguono SCI, lo sviluppo e la sperimentazione di efficaci modalità di trattamento è fondamentale. Fino a poco tempo, strategie riabilitative più comunemente sono concentrati sul recupero di mobilità2,3. Dopo SCI, i pazienti rango urinario/vescica, intestino e le funzioni sessuali fra le complicazioni più alte qualità della vita che hanno bisogno di migliore gestione1,4,5. Di conseguenza, targeting della vescica, intestino e la funzione sessuale è della massima importanza da un punto di vista di riabilitazione1,4,5.
Esercizio e la formazione dell'apparato locomotore (LT) sono comunemente utilizzate terapie riabilitative nella popolazione di pazienti di SCI con molti vantaggi come ad esempio la funzione cardiovascolare, funzione della vescica/urinaria e mobilità6,7,8 ,9,10. È per questo motivo che utilizziamo una modalità simile nel nostro modello SCI di ratto pre-clinica. È il nostro obiettivo per determinare quali effetti LT ha sui ratti Wistar di SCI, in particolare per quanto riguarda sia superiore (rene) e funzione del tratto urinario inferiore (vescica, sfintere uretra esterno), funzione intestinale e la funzione sessuale. Ulteriormente, LT ha dimostrato di essere sufficiente nell'attivazione neuromuscolare sistemi sotto il livello della lesione che può influenzare la quantità di plasticità all'interno del sistema nervoso centrale (SNC)11,12.
Il successo di LT in studi pre-clinici è ben documentato sia grande13,14 e piccolo15,16,,modelli animali per il SCI19 18,17,. La prova suggerisce che input sensoriali afferenti fornito da LT è sufficiente per stimolare spinale vie riflesse che si traducono in plasticità e miglioramenti al sensitivo-motore funzionano9,20. Benefici LT per quanto riguarda funzioni autonome non sono stati caratterizzati bene. Per questo motivo, implementiamo il nostro paradigma di formazione con un focus su misure di risultato autonomica, utilizzando quattro gruppi distinti che includono due controlli non addestrato e un gruppo di cuscinetto non-peso metabolico/esercizio insieme a un gruppo LT che imita la tempistica, la durata della sessione, assistenza manuale e supporto di peso che sono utilizzati in studi clinici19,21,22,23,24.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Exer-3R treadmill</td>
			<td>Columbus Instruments</td>
			<td></td>
			<td>reversed polarity of the motor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Body weight support system</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>modified spring scales with alligator clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat harness</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Our harnesses are custom made; please refer to Figure 1 for visual.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite Horizon (IH) impactor device</td>
			<td>Precision Systems and Instrumentation</td>
			<td>Model 0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-2053-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (AnaSed Injection)</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Eloxiject)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC 116695-6925-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate (GentaFuse)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC 11695-4146-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urethane, 97%</td>
			<td>Argos Organics</td>
			<td>CAS 51-79-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 monofilament suture kit (4-0 Ethilon Nylon Suture)</td>
			<td>Ethicon, LLC</td>
			<td>205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel suture clips (9mm Auto Clips)</td>
			<td>MikRon Precision, Inc.</td>
			<td>1629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Mastex Industries, Inc</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tootie Fruitys cereal</td>
			<td>Malt O Meal</td>
			<td></td>
			<td>For training reward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 surgical scalpel blades</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>SKU: 4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activity-based training on a treadmill with spinal cord injured wistar rats

Ferita del midollo spinale (SCI) si traduce in durata di deficit che includono sia la mobilità e una moltitudine di disfunzioni autonomiche correlate. Formazione dell'apparato locomotore (LT) su un tapis roulant è ampiamente usato come uno strumento di riabilitazione nella popolazione SCI con numerosi vantaggi e miglioramenti alla vita quotidiana. Utilizziamo questo metodo basato sulle attività di formazione di attività specifiche (ABT) in roditori dopo SCI ad entrambi delucidare i meccanismi dietro tali miglioramenti e per valorizzare e migliorare su protocolli di riabilitazione clinica esistenti. Il nostro obiettivo attuale è quello di determinare i meccanismi alla base di ABT-indotto miglioramenti in urinario, intestinale e la funzione sessuale in SCI ratti dopo un moderato livello di contusioni gravi. Dopo essersi assicurato ogni singolo animale in una maglia regolabile su misura, essi sono fissati ad un meccanismo di supporto peso corpo versatile, abbassata al tapis roulant di tre corsie modificate e assistito in fase di formazione per 58 minuti, una volta al giorno per 10 settimane. Questa configurazione consente l'addestramento di animali sia quadrupede e sola zampa anteriore, insieme a due gruppi diversi non addestrato. Animali addestrati quadrupede con supporto di peso del corpo sono aiutati da un tecnico presente per assistere a un passo con posizionamento corretto dell'arto come necessario, mentre animali addestrati sola zampa anteriore vengono generati verso l'estremità caudale affinché nessun contatto dell'arto con il nessun peso-cuscinetto e tapis roulant. Un gruppo SCI non addestrato di animali è collocato in un'imbracatura e si riposa accanto al tapis roulant, mentre l'altro gruppo SCI di controllo rimane nella sua gabbia a casa nella training room è vicino a. Questo paradigma consente la formazione di più animali SCI in una sola volta, rendendo così più efficienti in termini di tempo oltre a garantire che il nostro modello animale pre-clinico imita la rappresentazione clinica come vicino possibile, specialmente per quanto riguarda il corpo Peso supporto con assistenza manuale.

A seguito di questo protocollo di allenamento, è stato documentato che solo gli animali QT dimostrano la funzione locomotoria superiore quando rispetto agli altri gruppi di18. Tuttavia, a causa della natura del nostro laboratorio, il nostro obiettivo primario è di indagare non-locomotore benefici di formazione basata su attività di attività specifiche (ABT), compreso la vescica, intestino e funzione sessuale. Per esempio, in precedenza abbiamo pubblicato dati che mostrano risultati LT una riduzione indotta dall'esercizio del polyuria in gruppi sia QT che FT SCI ratti (Figura 4)17. Inoltre, una diminuzione indotta da lesione nella espressione di fattore di crescita-β (TGF-β) nel rene, indicativo di un'alterata risposta immunitaria, di trasformazione non è stato visto in gruppi QT e FT, che ha avuto livelli di TGF-β simili agli animali di sham (nessuna ferita). In stesso studio17, cistometria sveglio è stato effettuato prima dell'accumulazione dell'eutanasia e del tessuto. L'ampiezza massima delle contrazioni della vescica durante i cicli di sub non era significativamente differente tra farsa, QT e FT gruppi, mentre i gruppi NT è rimasto significativamente alterati. Insieme, questi dati indicano un risultato di esercizio positivo sulla funzione della vescica e di salute del rene, migliorando così la funzione urinaria dopo SCI.
I meccanismi sottostante poliuria all'interno della popolazione di SCI sono attualmente non chiaro ma sono probabilmente multifattoriale32. Alcuni hanno ipotizzato, ad esempio, che il pool di fluido nelle membra più basse mentre SCI gli individui sono in sedia a rotelle può portare a sovraccarico di liquidi ed eliminazione aumentata fluido durante turni posturale (ad esempio lo spostamento da seduto a sdraiato)33. Una tale spiegazione non vale per il modello pre-clinico, che ci ha portato a concentrarsi inizialmente su arginina vasopressina (AVP), l'ormone che controlla l'omeostasi fluido nel corpo e può essere modulata con l'esercizio. AVP controlli fluido omeostasi attraverso l'attivazione del recettore V2 nei reni che facilita il riassorbimento di acqua dalla raccolta renale condotti34. Prova preliminare da un esperimento pilota (tempo-punto cronica con livello di gravità di una lesione - forza di impatto kdyn 210) indicano un effetto benefico dell'esercizio (LT e FT) sui livelli del ricevitore V2 nel rene del ratto (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58983/58983fig1.jpg"> Figura 1: cablaggi su misura dimensionate per ratti maschii di Wistar. Animali sia QT e NT sono collocati nello stesso tipo di giacca (A) consentendo l'utilizzo delle arti posteriori nel caso di animali QT. Ci sono cinghie supplementari cuciti sul fascio usato per animali FT (B) per sollevare gli arti posteriori, non assicurando nessun supporto di peso del corpo. Le grandi porzioni di materiale gancio-e-ciclo dell'imbracatura consentono facili regolazioni di diversi animali di dimensioni e di eventuali modifiche delle dimensioni di un singolo animale nel corso del tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58983/58983fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58983/58983fig2.jpg"> Figura 2: installazione di stazione di formazione. Meccanismo di sostegno del peso corpo che circonda il tapis roulant per NT (estrema sinistra), QT (medio) o gruppi (a destra) FT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58983/58983fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58983/58983fig3.jpg"> Figura 3: stazione di allenamento con gli animali. Superiore (A) e una vista laterale (B) risultati peso corporeo supporto meccanismo e la posizione di fissaggio supporto clip per le imbracature. Si noti che le zampe dell'animale FT (B) viene generato e fuori il nastro. Inserto (C) ritrae una vista ingrandita del clip fissata all'imbracatura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58983/58983fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58983/58983fig4.jpg"> Figura 4: effetti ABT il polyuria ratto dopo SCI. Il volume totale della produzione di urina (A) è aumentato dopo SCI (*; p < 0,05) e restituito più vicino alla linea di base dopo 9 settimane di allenamento LT nei gruppi QT e di FT, ma è rimasto aumentate nel gruppo NT riguardante i gruppi addestrati (#; p < 0,05). Tutti i gruppi hanno dimostrato maggiore produzione di urina rispetto al basale a 9 settimane e aumentato volume vuoto (B). È importante notare che il numero di vuoti (C) e la quantità di assunzione di acqua (D) è rimasto lo stesso in tutti i gruppi. I valori sono mezzi ± errore standard. Questa figura è ripubblicata con autore autorizzazione17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58983/58983fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58983/58983fig5.jpg"> Figura 5: effetti ABT il rene del ratto. Western blot risultati per livelli di rene di ratto dei recettori V2 in 5 gruppi di 4 ratti ogni (20 in totale), che mostrano i livelli di espressione per le bande proteiche fornito nel pannello A e nel gruppo dire densitometria i risultati dell'analisi delle bande (usando ImageJ; OD = densità ottica) nel pannello B, che indica una significativa (*; p < 0,05) diminuzione nei recettori presso un punto di tempo cronica (12 settimane) post-SCI e nessuna diminuzione rispetto ai valori basali (comandi finti chirurgico) per i gruppi che ricevono 10 settimane di ABT un'ora giornaliera. Barre di errore rappresentano errore standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58983/58983fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Dose di chetamina/xilazina grafico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dose efficace:</td>
			<td colspan="4">Utilizzo di 100 mg/mL di brodo di ketamina e 20 mg/mL xilazina stock * * *</td>
		</tr>
<tr>
<td>80 mg/kg ketamina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mg/kg xylazina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">1,0 mL di miscela iniezione = 0,62 mL di brodo di ketamina (100 mg/mL) + 0,38 mL di brodo di xilazina (20 mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peso dell'animale</td>
			<td colspan="2">Iniezione di miscela</td>
			<td>Peso dell'animale</td>
			<td>Iniezione di miscela</td>
		</tr>
<tr>
<td>(g)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td></td>
			<td>(g)</td>
			<td>(mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>0.13</td>
			<td></td>
			<td>275</td>
			<td>0.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>105</td>
			<td>0,14</td>
			<td></td>
			<td>285</td>
			<td>0,37</td>
		</tr>
<tr>
<td>110</td>
			<td>0,14</td>
			<td></td>
			<td>290</td>
			<td>0,38</td>
		</tr>
<tr>
<td>115</td>
			<td>0.15</td>
			<td></td>
			<td>300</td>
			<td>0.39</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>0.16</td>
			<td></td>
			<td>305</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>125</td>
			<td>0.16</td>
			<td></td>
			<td>310</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>130</td>
			<td>0,17</td>
			<td></td>
			<td>315</td>
			<td>0.41</td>
		</tr>
<tr>
<td>135</td>
			<td>0.18</td>
			<td></td>
			<td>320</td>
			<td>0,42</td>
		</tr>
<tr>
<td>140</td>
			<td>0.18</td>
			<td></td>
			<td>325</td>
			<td>0,42</td>
		</tr>
<tr>
<td>145</td>
			<td>0,19</td>
			<td></td>
			<td>330</td>
			<td>0.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>150</td>
			<td>0.2</td>
			<td></td>
			<td>335</td>
			<td>0,44</td>
		</tr>
<tr>
<td>155</td>
			<td>0.2</td>
			<td></td>
			<td>340</td>
			<td>0,44</td>
		</tr>
<tr>
<td>160</td>
			<td>0.21</td>
			<td></td>
			<td>345</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
<tr>
<td>165</td>
			<td>0.21</td>
			<td></td>
			<td>350</td>
			<td>0.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>170</td>
			<td>0.22</td>
			<td></td>
			<td>355</td>
			<td>0.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>175</td>
			<td>0.23</td>
			<td></td>
			<td>360</td>
			<td>0,47</td>
		</tr>
<tr>
<td>180</td>
			<td>0.23</td>
			<td></td>
			<td>365</td>
			<td>0,47</td>
		</tr>
<tr>
<td>185</td>
			<td>0,24</td>
			<td></td>
			<td>370</td>
			<td>0,48</td>
		</tr>
<tr>
<td>190</td>
			<td>0.25</td>
			<td></td>
			<td>375</td>
			<td>0,49</td>
		</tr>
<tr>
<td>195</td>
			<td>0.25</td>
			<td></td>
			<td>380</td>
			<td>0,49</td>
		</tr>
<tr>
<td>200</td>
			<td>0,26</td>
			<td></td>
			<td>385</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>205</td>
			<td>0,27</td>
			<td></td>
			<td>390</td>
			<td>0.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>210</td>
			<td>0,27</td>
			<td></td>
			<td>395</td>
			<td>0.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>215</td>
			<td>0.28</td>
			<td></td>
			<td>400</td>
			<td>0,52</td>
		</tr>
<tr>
<td>220</td>
			<td>0,29</td>
			<td></td>
			<td>410</td>
			<td>0,53</td>
		</tr>
<tr>
<td>225</td>
			<td>0,29</td>
			<td></td>
			<td>420</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>230</td>
			<td>0.3</td>
			<td></td>
			<td>430</td>
			<td>0,56</td>
		</tr>
<tr>
<td>235</td>
			<td>0,31</td>
			<td></td>
			<td>440</td>
			<td>0.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>240</td>
			<td>0,31</td>
			<td></td>
			<td>450</td>
			<td>0,59</td>
		</tr>
<tr>
<td>245</td>
			<td>0,32</td>
			<td></td>
			<td>460</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>250</td>
			<td>0,33</td>
			<td></td>
			<td>470</td>
			<td>0.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>255</td>
			<td>0,33</td>
			<td></td>
			<td>480</td>
			<td>0,62</td>
		</tr>
<tr>
<td>260</td>
			<td>0,34</td>
			<td></td>
			<td>490</td>
			<td>0,64</td>
		</tr>
<tr>
<td>265</td>
			<td>0,34</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
			<td>0.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>270</td>
			<td>0.35</td>
			<td></td>
			<td>510</td>
			<td>0,66</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Tabella di dosaggio anestesia basato sul peso del singolo animale.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tempo di allenamento (min)</td>
			<td>Velocità (cm/s)</td>
			<td>Durata (min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0-1</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1-2</td>
			<td>8.4</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2-3</td>
			<td>10,8</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3-8</td>
			<td>13.2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8-13</td>
			<td>10,8</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>13-28</td>
			<td>13.2</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>28-33</td>
			<td>10,8</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>33-38</td>
			<td>6</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>38-43</td>
			<td>8.4</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>43-58</td>
			<td>13.2</td>
			<td>15</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Regime di allenamento di impostazioni di velocità che il tapis roulant dovrebbe essere il corrispondente al tempo trascorso ad ogni velocità.

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Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Questo protocollo dimostra il nostro modello di formazione basato su attività locomotrice tapis roulant per i ratti con lesioni del midollo spinale (SCI). È incluso sia quadrupede che sola zampa anteriore gruppi, oltre a due distinti tipi di gruppi di controllo non addestrato. Gli investigatori sono in grado di valutare gli effetti di formazione sui ratti SCI utilizzando questo protocollo.

Corsi di formazione basati su attività su un tapis roulant con midollo spinale feriti ratti Wistar

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

L'esercizio fisico e l'allenamento locomotore sono comunemente usati nelle terapie riabilitative nella popolazione di pazienti feriti del midollo spinale. Il principale vantaggio dell'allenamento basato sull'attività è che sono stati documentati molti benefici funzionali, sia negli studi preclinici sugli animali che nella pratica clinica. A dimostrare la procedura saranno James Armstrong, Christine Yarberry, entrambi tecnici di ricerca senior, e Jason Gumbel, uno studente laureato del mio laboratorio. Durante la settimana precedente la lesione del midollo spinale, maneggiare ogni topo per cinque o dieci minuti, una volta al giorno per cinque giorni. Il giorno della lesione, radere i capelli dalla parte posteriore del primo ratto da 200 a 225 grammi, nel sito della lesione, e posizionare l'animale anestetizzato su una pastiglia riscaldante a bassa impostazione. Somministrare lubrificante per gli occhi, un antibiotico generale ad azione lunga, un analgesico e cinque millilitri di soluzione salina fisiologica. Stimare la posizione del livello di lesione mirato, in base alle protuberanze vertebrali, e utilizzare un bisturi numero 10 per fare un'incisione di circa cinque centimetri sul dorsum dell'animale, direttamente sopra le vertebre della linea mediana. Usando gli emostati, ritrai i muscoli laterale, usando la sutura di seta 4-0. Per le contusioni toraciche medie, utilizzare i rongeurs per rimuovere la lamina delle vertebre T7 sovrapposta, esporre il livello T8-T9 del midollo spinale e utilizzare un dispositivo di contusione per eseguire le contusioni. Dopo aver riportato le lesioni, utilizzare monofilamenti di 4-0 diametro per suturare insieme il muscolo e la fascia sul midollo spinale. E chiudere la pelle con clip chirurgiche da nove millimetri. Iniettare altri cinque millilitri di soluzione salina fisiologica. Quindi posizionare gli animali in singole gabbie pulite, su pastiglie di riscaldamento con monitoraggio ravvicinato per le prime 24-48 ore. Utilizzo del manuale Cred

Research

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Neuroscience

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Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

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Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

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An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

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Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Indagare rigenerazione funzionale in organotipiche midollo spinale Co-culture Grown in array multi-elettrodo

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

Strategie sperimentali per colmare grandi lacune tessuto nel midollo leso spinale dopo acuta e cronica Lesione

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...