Name: high-throughput and comprehensive drug surveillance using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry
Uploaded: 2019-04-23T12:30:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry at JoVE.com

P.B.M. ønsker at anerkende finansieringen støtte fra naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada, Canada Foundation for Innovation, genom Canada og McMaster University. Forfatterne takke Howard Lee hos Seroclinix Corporation og Dr. Marcus Kim fra Agilent Technologies for deres indsigtsfulde drøftelser. Derudover, anerkender forfatterne Dr. Zainab Samaan fra Institut for psykiatri og adfærdsmæssige Sciences ved McMaster University og stemninger sygdom klinik på St. Joseph's Hospital for at få adgang til de deidentified patient urinprøver anvendes i denne undersøgelse .

Blindet urinprøver blev venligst leveret af Dr. Zainab Samaan fra stemninger sygdom klinik på St. Joseph's Hospital (Hamilton, ON, Canada), hvis undersøgelse blev godkendt af Hamilton integreret forskning etik Board.
1. reagenser og prøveforberedelse løsninger
<ol><li>
Baggrund elektrolyt forberedelse
	<ol>
<li>Forberede 50 mL af baggrunden elektrolyt (BGE) hver anden uge, 1 M myresyre, pH 1.8, med 15% v/v acetonitril som en økologisk modifier.</li>
		<li>Alikvot 1,9 mL koncentreret myresyre stock (26,5 M) i en 50 mL målekolbe og tilsættes 7,5 mL acetonitril og 40,6 mL deioniseret vand for at bringe den samlede mængde på 50 mL. Derefter sonikeres løsning for 15 min og overføre det til en steriliseret flaske med stramme forsegling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kappe flydende forberedelse
	<ol>
<li>Forberede 200 mL af kappe flydende løsning ugentligt, bestående af 0,1% myresyre i 60: 40 (MeOH:H2O).</li>
		<li>Alikvot 200 µL af myresyre (26,5 M lager) i en flaske, indeholdende 120 mL MeOH og 80 mL H2O at gøre jakke væske og degas det i 15 min.</li>
		<li>Næste, Tilføj 10 µL af hver af følgende reference ioner, purin og hexakis (2,2,3,3-tetrafluoropropoxy) phosphazine (HP-921), i kappe væsken til konstant masse signaler på m/z 121.05087 og m/z 922.00979, henholdsvis. Bemærk: Disse reference ioner giver mulighed for real-time masse korrektion og også overvåger for potentielle matrix-induceret ion undertrykkelse eller ekstraudstyr effekter under adskillelse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Standardpraeparat
	<ol>
<li>Forberede en standardopløsning, som indeholder en 84-drug panel blanding på 3 x kliniske screening cut-off niveau (L6)14 i 1 mL methanol, ved hjælp af Lægemiddelstandarder købt fra en kemiske leverandør. Forbered særskilt en blanding af 48 matchende deutereret indre stof standard (d-ISs) ved en 10-fold højere koncentration end 84-drug blandingen i 1 mL methanol. Derudover forberede en stamopløsning, som indeholder 200 µM med 4-fluoro -L-fenylalanin (F-Phe) og 3-chlor -L-tyrosin (Cl-Tyr) i 1 mL deioniseret vand H2O.</li>
		<li>Udføre en femdoblet fortynding af ovennævnte 84-drug blandingen (20 µL) og 48 d-ISs (20 µL), samt en tidobbelt fortynding af 4-fluorophenylalanine (F-Phe, 10 µL) og 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 µL) i en certificeret syntetiske urin matrix (40 µL) til at gøre alt volumen af 100 µL i et 250 µL centrifugeglas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eksterne kalibrering kurve forberedelse
	<ol>
<li>Udarbejde fem-punkts eksterne kalibreringskurverne (som beskrevet nedenfor) i fire eksemplarer (n = 4) over en 20-fold dynamikområde ved hjælp af 84-drug standard blandingen og 48 i deres tilsvarende d-ISs gjorde taktfast 1.3.1. For eksempel, for at gøre en fem-punkts eksterne kalibreringskurve, sikre fortynding 84-drug blanding (L6, trin 1.3.1) til 2-, 4-, 10-, 20-, og 40-fold, det er nødvendigt at udarbejde en femdoblet fortynding af matchende d-ISs (20 µL) og en tidobbelt fortynding af () 4-F-Phe 10 µL) og Cl-Tyr (10 µL) som en yderligere er i et syntetisk urin matrix til at gøre en samlet maengde paa 100 µL. I tilfælde når en matchende d-IS ikke er tilgængelig for et bestemt lægemiddel, er brug 4-F-Phe som en surrogat for yderligere oplysninger om datanormalisering. Bemærk: Undgå optagelse af yderligere d-ISs, som cross-griber (Isobar) med andre DoA inden for panelet, hvis de ikke fuldt ud er løst af CE adskillelse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Urin prøveforberedelse
	<ol>
<li>Optø deidentified morgen urinprøver fra en repræsentativ kohorte af ti klinisk deprimerede patienter med en kendt prescription drug historie. Opbevar urinprøver ved-80 ° C efter samling, indtil de har at blive optøet straks analyse. Bemærk: Undgå flere fryse-tø cykler af urin eller en forsinket opbevaring ved stuetemperatur efter samlingen på grund af deres indvirkning på den kemiske stabilitet af visse DoA metabolitter og deres konjugater.</li>
		<li>Vortex deidentified morgen urin prøver for 30 s og derefter centrifugeres dem i 1 min på 14.000 x g til bundfældning. Efter at alikvot 10 µL af den ovennævnte forarbejdet urin, 10 µL af d-er, og 5 µL af F-Phe/Cl-Tyr og 25 µL med deioniseret vand H2O og vortex for 1 min (Gentag disse trin i tre eksemplarer til at vurdere tekniske præcision). Overføre en 20 µL alikvot af den ovenfor beskrevne blandingen til en polypropylen hætteglas til analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. opsætning af CE-TOF-MS System
<ol><li>Ubestrøget fused silica kapillær conditioning parametre
	<ol>
<li>Sørg for, at alle standarder, eksterne kalibreringskurverne og urinprøver forberedt i afsnit 1.3-1,5 adskilt ved hjælp af en ubestrøget open-rørformede smeltet silica polyimid-belagt kapillær med en indre diameter på 50 μm, en ydre diameter på 360 µm, og en kapillar totallængde 135 cm. Bemærk: En diamant cutter værktøj bruges til at sikre konsekvent kapillærer, der inspiceres yderligere for at sikre en flush og glat snit.</li>
		<li>Fjerne omkring 7 mm af polyimid belægning fra både de distale kapillær ender, ved hjælp af en kapillær vindue maker til at reducere prøve fremførsel og forebygge potentielle polyimid hævelse ved kontakt med organiske opløsningsmidler.</li>
		<li>Sørg for at Rage ca. 2 mm kapillær forretningen ud af CE sprøjte nål og installere kapillær fjorden i CE patron ved looping to 360 ° sving. Derefter omhyggeligt installere CE patron i CE og placere CE sprøjten ud af ion kilde når konditionering af kapillar. Bemærk: Cut den kapillære outlet konsekvent som det er afgørende for at sikre en stabil electrospray nuværende når koblet til MS. To forskellige sprøjter blev brugt i arbejdet: en CE sprøjten blev anvendt til analysen af prøven, og en LC sprøjten blev brugt til den masse kalibrering.</li>
		<li>Sørg for at udføre kapillær konditionering med CE sprøjten ikke placeret i ion kilde. Sætte LC sprøjten i ion kilde. Bemærk: Dette giver mulighed for masse kalibrering samtidig undgå enhver form for kontaminering af koaksial kappe flydende interface, der efterfølgende koblet til TOF-MS.</li>
		<li>Betingelse nye kapillærerne ved at vælge flush funktion (940 mbar) på kreditorens software bruges til at kontrollere apparatet og Indstil varigheden af en flush på 30 min for fire forskellige opløsningsmidler i følgende rækkefølge: methanol, 1 M NaOH, deioniseret vand vand, og BGE. Sørg for at sætte isocratic pumpe på standby periode kapillær conditioning.</li>
		<li>Tør CE-MS sprøjten med en væv tørre gennemblødt i MeOH/H2O at fjerne enhver resterende salt indskud.</li>
		<li>Udføre den daglige forebyggende vedligeholdelse af CE-MS system før analysere prøverne. Brug methanol til at aftørre af CE elektrode (på fjorden), men bruge en isopropanol og vand (50/50) blandingen for at ren CE-MS grænseflade, som er vigtigt at undgå salt oprustning og begrænse potentielle prøve fremførsel.</li>
		<li>Fjerne LC sprøjten ud af ion kilde og placere rengøres sprøjten med en nyligt konditioneret kapillær i koaksial kappe flydende interface for CE-MS.</li>
		<li>Tænd isocratic pumpe og anvende en spænding på 30 kV for 15 min til at sikre en stabil CE nuværende profil før urinanalyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Injektion og adskillelse betingelser ved hjælp af CE
	<ol>
<li>Åbn sælger software anvendes til at kontrollere instrumentet til at angive parametrene CE og vælg forkonditionering trin. Indstille flush funktion til 600 s og angive en BGE hætteglas position. Bemærk: En ekstern vand chiller muligvis skal sluttes til CE-systemer, der mangler prøve bakke køling funktioner, som dette er påkrævet for at forhindre prøve fordampning, når du analyserer store partier af volumen-begrænset prøver.</li>
		<li>Sæt injektion funktion at hydrodynamically indsprøjte prøver på 100 mbar til 5 s og electrokinetically indsprøjte BGE afstandsstykker på 30 kV for 75 s. Bemærk: Denne proces gentages med hvert eksempel injektion (fra forskellige hætteglas stand) efterfulgt af en BGE spacer (fra den samme hætteglas holdning), der udføres automatisk inden for en metode program på software til ialt 11 diskrete prøver analyseres i den samme køre når ved hjælp af en MSI-format. Analysere 10 urinprøver i tilfældig rækkefølge efter en 84-panel stof blanding på screening cut-off niveau sprøjtes som den første prøve position for hver MSI-CE-MS køre.</li>
		<li>Angiv den anvendte spænding at være 30 kV, patron temperaturen er 25 ° C, og den samlede længde skal være 40 min. ved hjælp af tidsplanen, anvende en trykgradient 2 mbar/min. fra 0 min til 40 min. under separationen. Bemærk: En gradient trykket er anvendt under separationen til eluering af langsom-overflytning narkotika, som omfatter nogle svagt, grundlæggende benzodiazepiner og neutral/sure stoffer (fx, acetaminophen, barbiturater). Dog migrere mest grundlæggende DoA og deres metabolitter som kationer inden for 25 min, herunder amfetamin, opioider og andre klasser af alkaloider.</li>
		<li>Efter prøven erhvervelse er færdig, Sørg for at skylle kapillar ved et lavt tryk (50 mbar) med BGE indtil næste dag. Ellers, skyl kapillær for 600 s ved et højt tryk (900 mbar) med vand og derefter til 600 s med luft, og gemme det i en sprøjte holder indtil næste brug.</li>
	</ol></li>
	<li>Isocratic pumpe og jakke væske
	<ol>
<li>Bruge en Infinity Isocratic pumpe og en Infinity afgasser til at levere den kappe væske (60: 40 MeOH:H2O med 0,1% v/v myresyre) med en hastighed på 10 µL/min til CE-MS sprøjten.</li>
	</ol></li>
	<li>TOF-MS indstillinger
	<ol>
<li>Sikre, at en TOF-MS, med en koaksial kappe-væske electrospray ion kilde og opvarmet nitrogen gas, er forsynet med en CE-enhed.</li>
		<li>Betjene TOF-MS under positiv ion påvisning , der strakte sig over en masse m/z 50-1.700, med en datahastighed erhvervelse af 500 ms/spektrum. Sikre, at både profilen og barycentrum data gemmes i et filformat, ".d".</li>
		<li>Angive electrospray Ionisation betingelser være: Vcap og dyse spænding på 2.000 V, forstøver gas på 10 psi og tørring gas leveret ved 8 L/min. ved 300 ° C, med en kappe gasflow 3,5 L/min. ved 195 ° C. Derudover angive MS spænding indstillinger af fragmentor, skimmer og Oct1 RF til 120, 65 og 750 V, henholdsvis. Bemærk: Vcap og dyse spænding, samt nebulizer gas blev slukket under den serielle prøve injektion sekvens anvendes i MSI-CE-MS, men electrospray var programmeret til at være vendte tilbage på 1 min efter indledningen af den elektroforetisk adskillelse at forhindre aktuelle fejl på grund af sugning effekter.</li>
		<li>Udføre instrument kontrol og dataopsamling ved hjælp af leverandørens software (Tabel af materialer).</li>
	</ol></li>
	<li>Dataanalyse
	<ol>
<li>Analysere den MSI-CE-MS data ved hjælp af leverandørens software, herunder behandling, data gulvafslibning, og integration af uddraget ion elektroferogrammer (EIEs) for repræsentant DoA og deres metabolitter.</li>
		<li>Åbn softwaren og angive følgende parametre.<ol>
<li>Vælg udtræk dataformatog kromatogrammet og masse spektrale data format til profil tilstand under kromatogrammer.</li>
			<li>Vælg Kvadratiske/Cubic Savitzky Golay under funktionen udjævning og funktion bredde til 15 point.</li>
			<li>Klik derefter Integrere (MS), indstille integrator skal Agile, og vælg det maksimale antal toppe grænse til de største 11 under peak filtre.</li>
			<li>Klik på Vis, klikke på Integration peak liste, og vælg peak nummer, retentionstiden (RT), topareal, tophøjdeog signal / støj-forhold (SNR).</li>
			<li>Gem disse parametre under en unik metodenavn. Anvende denne metode til processen og fortolke hvert datasæt. Bemærk: En oversigtstabel med peak nummer, RT, toparealet og højde og SNR vises på højre side. Udføre datanormalisering for målte RT og integreret topareal for hver DoA til enten en matchende d-er eller (hvis det ikke findes) til F-Phe at forbedre analytiske præcision.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. analyse af urinprøver og eksterne kalibreringskurver
<ol><li>
Forskellige serielle injektion konfigurationer bruges i MSI-CE-MS
	<ol>
<li>For den første serielle prøve injektion konfiguration, bruges til at påvise drug isomer/isobar opløsning (figur 1A), sikre, at fem gentagne injektioner er udført på en blanding af 84 Lægemiddelstandarder med d-er og 4-F-Phe/Cl-Tyr, efterfulgt af en sjette indsprøjtning, som er en blindprøve i syntetisk urin, og fem yderligere injektioner af standard stof blanding.</li>
		<li>For den anden serie prøve injektion konfiguration, bruges til at demonstrere påvisning af DoA i individuelle urinprøver fra patienter med kendte recept (figur 2A), sikre, at den første prøve stik er en blanding af 84-drug standard blanding på en 1 x cut-off screening niveau (positiv kontrol) efterfulgt af en randomiseret injektion af 10 fortyndet urinprøver fra patienter: #293, #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, #183 og #50.</li>
		<li>For den tredje serie prøve injektion konfiguration, bruges til at illustrere erhvervelse af eksterne kalibreringskurverne i et enkelt løb, sikre at kalibratoren løsninger til DoA tilberedes over en 20-fold lineære dynamiske område svarer til 0,25 x 0,5 x, 1 x 2,5 x, og 5 x cut-off koncentrationsniveauer, sammen med matchende d-IS og F-Phe/Cl-Tyr som yderligere er i et syntetisk urin matrix (n = 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Products - Vital Statistics Rapid Release - Provisional Drug Overdose Data Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/drug-overdose-data.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/drug-overdose-data.htm</a> (2018)</li><li>Olfson, M., King, M., Schoenbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Young+People+With+Antipsychotic+Medications+in+the+United+States.">Treatment of Young People With Antipsychotic Medications in the United States.</a> JAMA Psychiatry. 72, 867-874 (2015).</li><li>Moeller, K. E., Kissack, J. C., Atayee, R. S., Lee, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Interpretation+of+Urine+Drug+Tests:+What+Clinicians+Need+to+Know+About+Urine+Drug+Screens.">Clinical Interpretation of Urine Drug Tests: What Clinicians Need to Know About Urine Drug Screens.</a> Mayo Clinic Proceedings. 92, 774-796 (2017).</li><li>Levy, S., Siqueira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committee+on+Substance+Abuse.+Testing+for+Drugs+of+Abuse+in+Children+and+Adolescents.">Committee on Substance Abuse. Testing for Drugs of Abuse in Children and Adolescents.</a> American Academy of Pediatrics. 133, e1798 (2015).</li><li>Pesce, M., Mikel, C., West, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+two+drug+testing+technologies:+GC-MS+and+LC-MS/MS.">A tale of two drug testing technologies: GC-MS and LC-MS/MS.</a> American Society of Interventional Pain Physicians. 13, 91-92 (2010).</li><li>Saitman, A., Park, H. -. D., Fitzgerald, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False-Positive+Interferences+of+Common+Urine+Drug+Screen+Immunoassays:+A+Review.">False-Positive Interferences of Common Urine Drug Screen Immunoassays: A Review.</a> Journal of Analytical Toxicology. 38, 387-396 (2014).</li><li>In Pursuit of Liquid Gold. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2017/12/27/business/urine-test-cost.html">https://www.nytimes.com/interactive/2017/12/27/business/urine-test-cost.html</a> (2017)</li><li>Wu, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+liquid+chromatography-high+resolution+mass+spectrometry+(LC-HR/MS)+in+clinical+toxicology.">Role of liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HR/MS) in clinical toxicology.</a> Clinical Toxicology. 50, 733-742 (2012).</li><li>Guale, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+LC-TOF-MS+Screening+for+Drugs,+Metabolites,+and+Collateral+Compounds+in+Forensic+Toxicology+Specimens.">Validation of LC-TOF-MS Screening for Drugs, Metabolites, and Collateral Compounds in Forensic Toxicology Specimens.</a> Journal of Analytical Toxicology. 37, 17-24 (2013).</li><li>Kaupilla, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+metabolites+and+drugs+of+abuse+from+urine+samples+by+desorption+electrospray+ionization-mass+spectrometry.">Rapid analysis of metabolites and drugs of abuse from urine samples by desorption electrospray ionization-mass spectrometry.</a> The Analyst. 132, 868-875 (2007).</li><li>Bynum, N. D., Moore, K. N., Grabenauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Laser+Diode+Thermal+Desorption-Tandem+Mass+Spectrometry+(LDTD-MS-MS)+in+Forensic+Toxicology.">Evaluation of Laser Diode Thermal Desorption-Tandem Mass Spectrometry (LDTD-MS-MS) in Forensic Toxicology.</a> Journal of Analytical Toxicology. 38, 528-535 (2014).</li><li>Kuehnbaum, N. L., Kormendi, A., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisegment+Injection-Capillary+Electrophoresis-Mass+Spectrometry:+A+High-Throughput+Platform+for+Metabolomics+with+High+Data+Fidelity.">Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry: A High-Throughput Platform for Metabolomics with High Data Fidelity.</a> Analytical Chemistry. 85, 10664-10669 (2013).</li><li>Nori de Macedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sweat+Metabolome+of+Screen-Positive+Cystic+Fibrosis+Infants:+Revealing+Mechanisms+Beyond+Impaired+Chloride+Transport.">The Sweat Metabolome of Screen-Positive Cystic Fibrosis Infants: Revealing Mechanisms Beyond Impaired Chloride Transport.</a> ACS Central Science. 3, 904-913 (2017).</li><li>DiBattista, A., Rampersaud, D., Lee, H., Kim, M., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Throughput+Screening+Method+for+Systematic+Surveillance+of+Drugs+of+Abuse+by+Multisegment+Injection-Capillary+Electrophoresis-Mass+Spectrometry.">High Throughput Screening Method for Systematic Surveillance of Drugs of Abuse by Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 89, 11853-11861 (2017).</li><li>Cao, Z., Kaleta, E., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantitation+of+78+Drugs+and+Metabolites+in+Urine+with+a+Dilute-And-Shoot+LC-MS-MS+Assay.">Simultaneous Quantitation of 78 Drugs and Metabolites in Urine with a Dilute-And-Shoot LC-MS-MS Assay.</a> Journal of Analytical Toxicology. 29, 335-346 (2015).</li><li>Drouin, N., Rudaz, S., Schappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Supported+Liquid+Membrane+for+Electromembrane+Extraction+of+Polar+Basic+Endogenous+Metabolites.">New Supported Liquid Membrane for Electromembrane Extraction of Polar Basic Endogenous Metabolites.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 159, 53-59 (2018).</li></ol>

Forfatterne afslører en US patent (PCT/CA2014/050454) på MSI-CE-MS multipleksede screening platform og data arbejdsgang for kemisk analyse.

Konventionelle kromatografisk separation typisk stole på en enkelt prøve injektion pr. løb, som efterfølges af en gradient eluering til at løse komplekse stof blandinger og kolonne renovering. Disse krav fundamentalt begrænse sample overførselshastighed og pligt cykle selv når ved hjælp af optimal kolonne-skifte programmer. I denne sammenhæng, store mængder urin drug analysis for arbejdspladsen, toksikologi eller terapeutisk kontrol applikationer ved GC-MS/MS og i stigende grad, LC-MS/MS er således udført sideløbende, men anvendes fortrinsvis som en andenrangs eller konfirmatoriske test Hvornår nødvendigt (dvs., juridiske eller medicinsk sammenhæng). Dette skyldes meget højere investeringer og driftsomkostninger samt komplikationer med dataanalyse ved sammenligning prøver analyseret på tværs af flere instrumentale platforme inden for et akkrediteret laboratorium. Som følge heraf er immunassays stadig den primære metode til rutinemæssig stof screening på trods af at være udsat for falske-positiver og falske negativer blandt mange narkotika klasser, med begrænset adgang til antistof reagenser til nye designerstoffer. Tidligere undersøgelser har vist, at multipleksede separationer baseret på MSI-CE-MS tilbyder en enkel løsning for at forbedre prøve overførselshastighed op til én størrelsesorden. Derudover tillader denne tilgang til design af nye data arbejdsprocesser for biomarkør opdagelse med høj data troskab baseret på gennemførelsen af effektive batch korrektion og kvalitetskontrol12,13,14. Men indførelsen af 10 eller flere serielle hydrodynamiske injektioner i MSI-CE-MS forkorter den effektive kapillær længde påkrævet for at vedligeholde højeffektiv separationer, som kan kompromittere selektivitet, når du analyserer DoA og deres metabolitter i human urin.
Heri, indførte vi en elektrokinetiske indsprøjtning af BGE efter hver injektion af hydrodynamiske prøven, således at adskillelsen drager fordel af den fulde kapillær længde (120 cm), dermed forbedre løsningen af vigtige stof isobarer/isomerer, når du bruger Full scan dataopsamling ved TOF-MS (figur 1A). I forhold til en nylig rapport14opnås bedre opløsning for flere vigtige Isobar/isomer DoA og deres metabolitter, som er kritiske, når screening for store stof paneler. For eksempel, blev løsning af flere vigtige strukturelle/funktionelle gruppe isomerer realiseret, herunder tre analoge opioid narkotika/metabolitter (figur 1B), to ikke-forretningsmæssigt forbundne opioid isobarer (figur 1 c), og to methamfetamin positionelle isomerer (fig. 1 d). I alle tilfælde er prøve fremførsel fra seriel injektion af forskellige kalibratoren løsninger inden for det samme køre ikke væsentlig som bekræftet af en negativ urin kontrol/blank. Desuden, forbedret opløsning er også indså for flere cross-interferenser involverer visse d-ISs med Isobar narkotika i panelet, som cotinine-d3 og 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA), EUDP-d3 og imipramin, norfentanyl-d5 og ketamin, Kodein-d6 og sertralin, og kokain-d3 og zolpidem. Dette resultat er udvidet til andre Isobar interferenser inden for panelet stof, der var bedre løses i denne undersøgelse (f.eks.noroxycodone/oxymorphone, normeperidine/methylphenidat), samt største baggrund urin interferenser (f.eks. , i-source fragment ioner af kreatinin med amfetamin)14. Adgang til to ortogonale parametre til at tilfredsstille den formodede identifikation af et bestemt DoA er faktisk afgørende for at reducere falsk-positive på grund af Isobar interferenser, nemlig nøjagtig masse kombineret med comigration med d-ISs. Også, påvisning af en eller flere biotransformed metabolitter af det overordnede stof inden for den samme prøve, såsom hydroxyleret, demethylated eller intakt glucuronid stof conjugate(s), tilføjer yderligere tillid mod narkotika identifikation under udvidelse af vinduet for registrering.
De anbefalede cut-off niveauer for urin stof screening varierer meget for forskellige klasser af DoA (spænder fra 50 til 1,000 ng/mL) afhængigt af deres farmakokinetik, toksicitet og baggrunden interferenser, for at reducere metode bias baseret på retningslinjerne fra Substance Abuse og mentale sundhed Services Administration (SAMHSA)14. Potentialet for MSI-CE-MS til at opdage og identificere forskellige klasser af DoA direkte i urinen med minimal prøve forbehandling blev anvendt til en gruppe af klinisk deprimeret patienter med en kendt recept post. Den endelige identifikation af metadon (ordineret), amfetamin (nonprescribed/ulovlig), Venlafaxin (ordineret) og pregabalin (ordineret) i fortyndet, men nonhydrolyzed, urinprøver blev demonstreret ved brug af MSI-CE-MS. Dette var baseret på en direkte sammenligning af et stof, der er registreret i en bestemt injektion position i forhold til 84-drug blandingen blev indført i den første prøve position på den anbefalede cut-off screeningsniveau, der tjener som en intern reference/QC og positiv kontrol (Figur 2). Også, absolut drug kvantificering er muligt ved hjælp af eksterne kalibreringskurverne (figur 3) baseret på ion svar forholdet målt for et stof i forhold til sin d-er. I modsætning til de fleste kromatografisk separation, der er ingen deuterium effekt påvirker migration tidsforskelle mellem en d-er og dens nondeuterated drug da de besidder analoge elektroforese mobilitetsophold i gratis løsning i CE. Faktisk er funktionen migration af DoA præcist modelleret i CE, baseret på deres grundlæggende fysisk-kemiske egenskaber/kemiske struktur, nemlig molekylære volumen og effektiv opladning (pKen)14. Da mange lægemidler også undergår betydelig sekundære metabolisme før udskillelse i urinen (fxmorfin glucuronid), screening cut-off niveauer kræver justering som deres målte koncentrationer er lavere end forventet i forhold til metoder, der udnytter enzym hydrolyse til samlede stof afsløring. En stor fordel ved "fortynde-og-skyd" urin drug test, ud over at reducere omkostninger og klokkeslæt, prøve håndtering, og en potentiel bias eller batch variationer på grund af ufuldstændige enzym hydrolyse, er, at formodede skærm-positive tilfælde bekræftes yderligere af den påvisning af en eller flere relaterede drug metabolitter inden for samme prøve. Dette har også giver dybere indsigt i stof farmakokinetik og optimal dosering krav for enkelte patienter samtidig forbedre påvisning for "hurtig" metabolizers eller ordineret/ulovlige stoffer med korte halveringstider. Derudover comigration med en matchende d-spiller to vigtige funktioner for pålidelige stof screening når bruger MSI-CE-MS — nemlig, den identificerer nøjagtige prøve injektion position (dvs., patienten #) mens også korrigere for forskelle i ion svar/injektionsvolumener for forbedret præcision og nøjagtighed.
Fremtidige arbejde har til formål at udvikle tilpassede softwareværktøjer til at lette edb multipleksede separationer koblet til HRMS som krævet for store mængder urin drug test med QC/QA. Streng validering af MSI-CE-MS til DoA bredspektret screening vil også blive undersøgt blandt en større kohorte af højrisiko patienter for at objektivt evaluere foreskrevne medicin overholdelse og potentielle misbrug/substitution, kan kompromittere behandling effektivitet, patientsikkerhed, og/eller psykiatrisk vurdering/diagnose. En supplerende analyse af sure/anioniske klasser af DoA og deres metabolitter skal også udføres af MSI-CE-MS betingelser basisk med negativ ion mode opdagelse som krævet for den omfattende screening af naturlige/syntetiske cannabinoider. Dette er vigtigt i betragtning de truende offentlige sundhedsmæssige konsekvenser af legalisering af rekreative marihuana på tværs af Canada og flere amerikanske stater. En stor fordel af full scan datafangst af TOF-MS er, at retrospektiv analyse af prøver kan udføres, selv når urinprøver fra er ikke længere tilgængelig for opfølgende test, mens andre livsstil eller kosten engagementer kan vurderes bedre forstå differentieret svar til medicinsk behandling. I Resumé giver en hurtig endnu præcis drug overvågning metode af MSI-CE-MS betydelige fordele ved at konventionelle målrettede immunassays, såvel som direkte infusion/omgivende ionisering-MS/MS metoder, der er udsat for interferens/bias, når der udvidet paneler af DoA og deres metabolitter i komplekse biologiske prøver på meromkostninger.

En alarmerende stigning i misbrug af og afhængighed af opioider til håndtering af kronisk smerte repræsenterer en voksende trussel for folkesundheden, med over 70.000 drug overdosis dødsfald i USA anslås i 20171. På samme måde, forskellige andre psykotrope medicin er også almindeligt ordineret til børn og unge voksne til behandling af angst, depression og mental sundhed spørgsmål2. Som et resultat, er urin drug test metoder, bredt udviklet til arbejdspladsen og retsmedicinske toksikologi, af vital betydning for den terapeutiske overvågning af ordineret medicin, der er udsat for tolerance og afhængighed af3,4. Dette er nødvendigt for at sikre overholdelse, optimale terapeutiske virkning og patientsikkerhed, samtidig med at afsløre potentielle substitution, herunder ulovlig eller nonprescribed stof misbrug. I øjeblikket, urin dopingtest for DoA stole på en todelt fremgangsmåde, som består af en indledende konkurrencedygtige immunassay skærm via punkt af pleje enheder eller laboratorium analyzers, efterfulgt af en verifikationsprøve med større specificitet baseret på GC-MS/MS og i stigende grad, LC-MS/MS5. Dog er immunassays tilbøjelige til bias, som antistof reagenser binde nonspecifically til forskellige narkotika klasser til at generere en Præsumptive screen-positivt resultat, som forhindrer en pålidelig identifikation og kvantificering af specifikke stoffer eller komplekse stof blandinger6. I denne sammenhæng mere præcise urin dopingtest er tvingende nødvendigt i betragtning af de ublu omkostninger af omfattende flere skærme,7 herunder designerstoffer og syntetiske urin produkter, der unddrager sig konventionelle målrettet assays.
Højeffektiv separationer sammenholdt med høj opløsning MS (HRMS) ved hjælp af TOF eller orbitrap masse analyzers er blevet foreslået som en disse strategi for narkotika overvågning i en æra af Polyfarmaci og udvide paneler af DoA8,9 . Konventionelle LC-separationer er dog langsom (> 15 min) på grund af de lange eluering gange til løsning af kemisk forskellige klasser af DoA og deres metabolitter ved hjælp af gradient eluering programmer, som begrænser prøve overførselshastighed for rutinemæssig stof screening. Alternativt, direkte analysemetoder baseret på desorption ionisering (DESI)10 og laser diode termisk desorption (LDTD) giver mulighed for hurtigere stof screening uden adskillelse11. Disse omgivende ionisering metoder er dog udsat for Isobar/isomer interferenser når analysere komplekse urinprøver fra, hvilket kræver uafhængige bekræftende prøvning.
Vores laboratorium har for nylig udviklet en multiplex adskillelse platform for at øge gennemløbet af prøven samtidig bevare en høj effektivitet adskillelse baseret på MSI-CE-MS12opløsning og data pålidelighed. Roman data arbejdsprocesser kan designes i MSI-CE-MS for disse metabolitten profilering (dvs.metabolomics) af volumen-begrænset biospecimens, kvalitetskontrol (QC) give mulighed for batch korrektion som krævet for storstilet befolkning studier13. I dette tilfælde udføres separationer ved hjælp af en isocratic buffer med opløste ionisering optræder under steady-state opløsningsmiddel, når du bruger en konventionel kappe flydende interface, som giver mulighed for serielle injektioner af 10 eller flere prøver inden for en enkelt køre for hurtigt men selektiv screening af forskellige klasser af DoA og deres metabolitter14. Fokus i denne undersøgelse er at yderligere validere MSI-CE-MS til direkte analyse af autentiske urinprøver fra en repræsentativ kohorte af klinisk deprimerede patienter ved hjælp af en "fortynde-og-skyd"-metode, der undgår behovet for enzymet hydrolyse15. Derudover gennemførelsen af en elektrokinetiske spacer mellem seriel prøve stik i MSI-CE-MS16 blev udført at yderligere forbedre løsningen af forskellige stof isomerer/isobarer, baggrund urin interferenser og/eller Cross-interferens når screening store paneler af DoA. Den absolutte kvantificering af DoA i urinprøver fra når ved hjælp af matching deutereret interne standarder (d-er) er påvist, når du bruger MSI-CE-MS. Denne tilgang også letter drug identifikation samt udlede korrekt prøve placeringen af skærmen-positive tilfælde i forhold til en drug panel blanding på de anbefalede cut-off screeningsniveau, der også fungerer som en intern reference/QC inden for samme flugt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7100 Capillary Electrophoresis System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G7100A</td>
			<td>CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G6230B</td>
			<td>HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE-ESI-MS Sprayer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G1603A</td>
			<td>CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G1310B</td>
			<td>Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>--</td>
			<td>Software used for control of CE-MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>--</td>
			<td>Software used for processing of CE-MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortix Capillary Cutter</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>5813-4620</td>
			<td>Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Window Maker</td>
			<td>Microsolv Inc.</td>
			<td>07200-S</td>
			<td>Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused-silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies Inc.</td>
			<td>TSP05375</td>
			<td>Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)</td>
			<td>Cerilliant Inc.</td>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput and comprehensive drug surveillance using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry

Nye analysemetoder er tvingende nødvendigt at aktivere høj overførselshastighed, men omfattende stof screening, givet en alarmerende opioid og prescription drug krise på folkesundhedsområdet. Konventionelle urin drug test baseret på en to-lags immunassay skærmen efterfulgt af en gaskromatografi-tandem massespektrometri (GC-MS/MS) eller liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) metode er dyrt og tilbøjelig til bias samtidig være begrænset til målrettede paneler af kendte medicin misbrug (DoA). Heri, skitsere vi en forbedret metode til narkotika overvågning, der giver mulighed for opløsning og påvisning af en udvidet panel af DoA og deres metabolitter, når du bruger multisegment injektion-kapillær elektroforese-massespektrometri (MSI-CE-MS). Multipleksede separationer af ti urinprøver med en kvalitetskontrol af CE (< 3 min/eksempel) sammen med full scan dataopsamling ved hjælp af en time-of-flight massespektrometer (TOF-MS) under positiv ion mode påvisning giver mulighed for identifikation og kvantificering af DoA ovenstående anbefalede cut-off niveauer. En fremragende opløsning af narkotika isomerer og isobarer, herunder baggrunden interferens, nås når du bruger MSI-CE-MS med en elektrokinetiske spacer mellem prøve segmenter, hvor nøjagtig masse/Molekylær formel sammen med comigration af en matchende deutereret intern standard og påvisning af en eller flere bio-omdannet metabolitter lette DoA identifikation over et bredere afsløring vindue. Urinprøver kan Derudover analyseres direkte uden enzymet deconjugation for hurtig screening uden kompliceret eksempel workup. MSI-CE-MS giver mulighed for overvågning af et bredt spektrum af DoA, der er nødvendige for behandling overvågning af højrisiko patienter, herunder bekræfter foreskrevne narkotika tilslutning, afsløre ulovlige narkotika brug/substitution og evaluere optimal dosering regimer som det kræves for nye fremskridt i præcision medicin.

MSI-CE-MS giver mulighed for den serielle injektion af ti eller flere diskrete prøver inden for en enkelt run, som forbedrer i høj grad overførselshastighed (< 3 min/prøve) uden kompliceret instrumental ændringer, kolonne-switching programmer eller dyre infrastruktur investeringer (figur 1A). En skiftende række hydrodynamiske injektioner af prøven og elektrokinetiske spacer af BGE udføres inden for en uændret fused silica kapillær, hvor zonal elektroforetisk separation af ioner optræde under stærkt sur elektrolyt (pH 1.8). opløst stof ionisering opstår også under steady-state-betingelser. I dette tilfælde der en koaksial kappe væske, med en masse kalibratoren, bruges som grænseflade for CE-MS under positiv ion mode påvisning med minimal ion undertrykkelse eller ekstraudstyr effekter som overvåges af masse kalibratoren ioner signal. TOF repræsenterer en robust endnu omkostningseffektive HRMS med en hurtig datafangst velegnet til disse screening/drug overvågning applikationer, når du bruger MSI-CE-MS. For eksempel, er imponerende opløsning opnået for forskellige Isobar/isomer DoA og deres metabolitter, herunder strukturelle isomerer af tre opioid strukturelle isomerer, nemlig norhydrocodone, hydromorphone og morfin (figur 1B). I dette tilfælde løst 30 toppe fra 10 uafhængige prøver af et stof blanding registreres uden prøve fremførsel. En syntetisk urin blank/negativ urin kontrol er også medtaget i den serielle injektion serie (prøve position #6). Også, to andre Isobar opioider, nemlig 6-acetylmorphine (en inaktiv heroin metabolit) og naloxon (en opioide receptor antagonist anvendes til akut behandling af opioid overdosis) er fuldt ud løst som 20 forskellige toppe med full scan data erhvervelse ( Figur 1 c). Ligeledes er to amfetamin positionelle isomerer fuldt ud løst i MSI-CE-MS hen til skelne ulovlige methamfetamin misbrug fra potentielle misbrug af phentermin, en foreskrevne stimulans, der bruges som en appetitnedsættende til vægttab.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig1.jpg"> Figur 1: en serie af uddraget ion elektroferogrammer (EIE) for repræsentative DoA isomerer/isobarer, der løses af MSI-CE-MS ved at analysere 10 prøver og en tom inden for et enkelt run. (A) skematisk af MSI-CE-MS der skildrer den serielle injektion konfiguration anvendes til en 84-DoA panel i syntetisk urin. Denne multipleksede adskillelse metode bruger en vekslende række hydrodynamiske injektioner af 11 diskrete prøver og blank med en elektrokinetiske indsprøjtning af en buffer til indlede zonal elektroforetisk adskillelse af ioner, efterfulgt af et full scan data erhvervelse af TOF-MS med positiv ion mode detektion. (B) tre Isobar funktionsgruppe opioid isomerer (m/z 286.1438), adskilt af CE, bestående af 30 løst toppe fra 10 diskrete prøve injektioner, herunder norhydrocodone, hydromorphone og morfin. (C) to Isobar opioid narkotika og deres metabolitter (m/z 328.1543), adskilt af CE, bestående af 20 løst toppe fra 10 diskrete prøve injektioner, herunder 6-acetylmorphine (heroin metabolit) og naloxon. (D) to Isobar funktionsgruppe amfetamin isomerer, adskilt af CE, bestående af 20 løst toppe fra 10 diskrete prøve injektioner, herunder methamfetamin og phentermin. I alle tilfælde havde negative urin kontrol/tomme indført på prøve sjettepladsen i MSI-CE-MS ubetydelig bevis på prøve fremførsel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Gennemgå DoA, en seriel injektion konfiguration i MSI-CE-MS brugte en 84-drug panel blanding på de anbefalede screening cut-off koncentrationsniveauer (som den første injektion position for alle kørsler) efterfulgt af en randomiseret analyse af 10 repræsentative urin prøver fra klinisk deprimerede patienter med en kendt recept historie. For eksempel, en positiv screening test resultat for metadon (m/z 310.2165) fra patienten #208 (figur 2A) er udledt af en påvisning af en stor signal peak (med oprindelse fra injektion #9), som comigrates med metadon-d3 med et lavt masse fejl (< 5 ppm). Ingen andre signaler registreres i nogen andre urinprøver inden for samme køre. Metadon koncentration overstiger 13 x anbefalede cut-off grænse, når man sammenligner dets målte ion svar forhold i prøven (injektion #9) med henvisningen narkotika blanding/QC (injektion #1) og korrigeret af en firedoblet urin fortyndingsfaktoren. Således bekræfter dette resultat patientens overholdelse af metadon vedligeholdelsesbehandling. Dokumentation af nonprescribed amfetamin indtag (figur 2B) er vist ved forhøjet amfetamin niveauer (m/z 136.1121) som blev kun fundet i en patient (patienten #50, i injektion #11) inden for MSI-CE-MS run. Den målte koncentration lidt overskredet de anbefalede cut-off niveauer (1,3 x). Dette comigrates med amfetamin-d5 og havde en lav masse fejl med en top-rangerede molekylformel match. Et positivt testresultat for antidepressive Venlafaxin (m/z 278.2115), en selektiv serotonin-noradrenalin reuptake hæmmer, er også påvist i patienten #281 (injektion #6). I dette tilfælde koncentrationen overstiger de anbefalede cut-off niveauer (15 x), dette er identificeret ved sin nøjagtige masse - eller Molekylær formel-match, sammen med comigrating Venlafaxin-d6 (figur 2 c). Sidstnævnte kriterium ikke er opfyldt for en ukendt isobar, der er også fundet i sporingen af EIE, som understreger behovet for forsigtighed når stole udelukkende på dens nøjagtige masse. Også, en definitiv påvisning af foreskrevne pregabalin, som er ordineret til behandling af neuropatiske smerter samt af generaliseret angst, er også demonstreret for patienten #309, baseret på dens groft forhøjet koncentration (64 x) over det anbefalede cut-off niveauer (figur 2D). Det er, ikke dog opdaget i de ni andre patient urinprøver analyseres inden for samme køre. I lighed med de andre skærm-positive tilfælde, injektion #4, comigrates med pregabalin-d6, som er inkluderet i alle urinprøver analyseret af MSI-CE-MS.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig2.jpg"> Figur 2: en serie af uddraget ion elektroferogrammer (EIE) for repræsentative skærm-positive urin drug testresultater fra en kohorte af 10 klinisk deprimerede patienter som bekræftet, hvornår bruger MSI-CE-MS, som omfatter en 84-drug panel på anbefalet cut-off niveau, injiceres som den første prøve injektion holdning tjener som intern reference/QC. (A) EIE overlay svarende til metadon-d3, som comigrates med metadon, fremhæver at kun en urinprøve (injektion position #9) har forhøjet metadon koncentrationer langt over cut-off niveau. (B) EIE overlay svarende til amfetamin-d3, som comigrates med amfetamin, fremhæver at kun en urinprøve (injektion position #11) har forhøjede koncentrationer over cut-off niveauer. (C) EIE overlay svarende til Venlafaxin-d6, som comigrates med Venlafaxin, fremhæver at kun en urinprøve (injektion position #6) har forhøjede koncentrationer over cut-off niveauer. (D) EIE overlay svarende til pregabalin-d6, som comigrates med pregabalin, fremhæver at kun en urinprøve (injektion position #4) har groft forhøjede koncentrationer over cut-off niveauer. Alle urinprøver blev analyseret direkte efter en femdoblet fortynding i ionbyttet vand sammen med tilføjelsen af en matchende d-er (når de er tilgængelige). Et skærm-positive resultat i MSI-CE-MS svarer til et stof, der comigrates med d-ISs med en lav masse fejl (< 5 ppm) og den korrekte molekylformel, hvis koncentrationen overstiger cut-off, som er analyseret i det samme løb som intern reference/QC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Den absolutte kvantificering af DoA og deres metabolitter opnås også ved MSI-CE-MS baseret på eksterne kalibreringskurverne ved hjælp af reference-kalibratoren standarder for DoA, som er erhvervet hurtigt inden for et enkelt run. For eksempel, seriel fortynding af en 84-drug kalibratoren blandingen sammen med en matchende d-er på en fast koncentration giver en pålidelig kvantitativ analyse i komplekse urinprøver. Dette kompenserer for potentielle matrix-induceret ion undertrykkelse eller ekstraudstyr, men også for variationer i Injektionsvolumen i kapillær mellem prøverne. I tilfælde når en matchende d-er er kommercielt tilgængelig eller cost-uoverkommelige for visse DoA, et surrogat er bruges til yderligere oplysninger om datanormalisering, såsom en d-IS fra inden for det samme stof klasse eller en syntetisk stof ikke findes i urinen (F-Phe), som vist tidligere 14. repræsentant EIEs og eksterne kalibreringskurverne for oxycodon er vist i figur 3A, B. og for citalopram i figur 3 c, D. Disse er almindeligt ordineret smertestillende midler og antidepressiver, henholdsvis med misbrug potentiale. Relative ion svar nøgletal til deres tilsvarende d-er er målt. I dette tilfælde en seriel injektion konfiguration i MSI-CE-MS, bestående af fem forskellige stof calibrants, der analyseres i duplikat inden for en enkelt køre sammen med en syntetisk urin tom. Samlede, god linearitet (R2 > 0.990) over en 20-fold koncentration udvalg blev opnået med tilstrækkelig følsomhed til påvisning af fleste DoA og deres metabolitter (dvs., kationiske alkaloider) i panelet 84-stof 14. i alle tilfælde, narkotika metabolitter er registreret som deres protonated molekylarionen [MH+] over deres screening cut-off begrænser (> 50 ng/mL), med undtagelse af visse sure/neutral narkotika, der har en dårlig ionisering effektivitet under den positiv ion tilstand, såsom cannabinoider (fxTHC-COOH), barbiturater (fxsecobarbital) og carbamater (fxcarisoprodol).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig3.jpg"> Figur 3: en serie af uddraget ion elektroferogrammer (EIE) til kvantificering af repræsentant DoA. Dette gøres ved at generere eksterne kalibreringskurverne baseret på deres relative ion svar forhold med en en matchende d-er over en 20-fold lineære dynamiske område. (A) duplikere injektion af en fem-punkts kalibreringskurven for oxycodon calibrants sammen med oxycodon-d3 og en tom. (B) eksterne kalibreringskurven for oxycodon, efter lineær regression for at udlede følsomhed (hældning) og linearitet (R2), med fejllinjer repræsenterer ±1σ (n = 4). (C) kopiere injektion af en fem-punkts kalibreringskurven for citalopram calibrants, sammen med citalopram-d6 og en tom. (D) eksterne kalibreringskurven for citalopram, efter lineær regression for at udlede følsomhed (hældning) og linearitet (R2), med fejl barer repræsenterer ±1 SD (n = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry at JoVE.com

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Her beskriver vi en høj overførselshastighed metode for omfattende stof overvågning, der giver mulighed for bedre opløsning og påvisning af store paneler af narkotika misbrug og deres metabolitter, med kvalitetskontrol baseret på multisegment injektion-kapillær elektroforese-massespektrometri.

Høj overførselshastighed og omfattende stof overvågning ved hjælp af Multisegment injektion-kapillær elektroforese massespektrometri

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Nuværende strategier for en urin stof screening er dyre at udføre for rutinemæssig analyse af stadig større paneler af narkotika af misbrug som kræves for arbejdspladsen test, samt terapeutiske lægemiddelovervågning applikationer. Derudover, metoder baseret på amino analyser er tilbøjelige til bias og er i sidste ende begrænset til målanalyse af kendte stof paneler. Den største fordel ved vores metode, som omtales som MSI-CE-MS, er, at det giver mulighed for hurtig screening af en ubegrænset stof panel og deres metabolitter med høj nøjagtighed og minimal prøve workup.Der er et presserende behov for en høj-gennemløb og overkommelige screening metode til at forbedre patientens resultater ved at bekræfte overholdelse og optimere narkotika dosering regimer, samtidig med at afsløre ulovlig brug af narkotika. Denne multiplexed separation platform kan anvendes på en række andre forskningsområder relateret til målrettede eller ikke-målrettede metabolit profilering i komplekse biologiske prøver. Begynd med optøning af identificerede morgen urinprøver indsamlet fra patienter med en kendt receptpligtig medicin historie for minus 80 grader Celsius opbevaring på is og vortexing de optøede prøver i 30 sekunder.Dernæst sediment prøverne ved centrifugering og kombinere tre 10 mikroliter aliquots af hver prøve med 10 mikroliter af deutererede interne standarder, fem mikroliter af en 4-fluor-L-phenylalanin og 3-chloro-L-tyrosin opløsning og 25 mikroliter af deioniseret vand. Derefter centrifuges blandingerne i et minut og overføres 20 mikroliter af hver prøve til individuelle polypropylenhætteglas. For at indstille den ubestrøget smeltet silica kapillær conditioning parametre, skære en 135 centimeter lang, 50 mikrometer indre diameter, og 360 mikrometer ydre diameter kapillær fra en spole.Brug en kapillær vindue maker til at fjerne omkring 7 millimeter polyamid belægning fra begge ender af hver kapillær. Dernæst installere kapillær indløb i kapillær elektroforese, eller CE patron, ved looping hver kapillær i to 360 graders sving, idet man skal passe på at stikke omkring to millimeter af kapillær forretninger ud af CE sprøjten nålen. Når alle kapillærerne er installeret, skal CE-patronen forsigtigt indlæses i CE-systemet, og CE-sprøjten opbevares ud af ionkilden.Ansæt væskekromatografien eller LC-sprøjten i ionkilden, og vælg skyl i systemets software for at indstille kapillær konditionering. Indstil varigheden af methanol, en molar natriumhydroxid, deioniseret vand og baggrundselekttens skyller til 30 minutter pr. skylning, og anbring den isokratiske pumpe på standby under kapillær konditioneringsperioden. Efter den sidste skylning rengøres kapillær elektroforesemassespektrometeret eller CE-MS-sprøjten og CE-elektroden med methanols klude.Rengør CE-MS-grænsefladen med en en-til-en isopropanol-vandopløsning for at fjerne eventuelle resterende saltaflejringer. Udskift LC-sprøjten med den rensede CE-MS sprøjte og en nyligt konditioneret kapillær i koaksial kappe væske interface. Tænd derefter for den isokratiske pumpe og påfør en spænding på 30 kilovolt i 15 minutter for at sikre, at der opnås en stabil CE-strømprofil før urinanalysen.I systemsoftwaren skal du vælge forkonditionering, indstille skylning til 600 sekunder og angive en baggrundselelektrolytfilposition. Indsprøjtningen indstilles til hydrodynamisk at injicere prøverne ved 100 millibar i fem sekunder og til elektrokinetisk injicere baggrundselektrumlændingerne ved 30 kilovolt i 75 sekunder. Indstil den anvendte spænding til 30 kilovolt, patrontemperaturen til 25 grader Celsius og den samlede driftstid til 40 minutter.Derefter, ved hjælp af tidsplanen, anvende en trykgradient på to millibars i minuttet fra nul til 40 minutter under adskillelsen. Når prøveaneelsen er færdig, skylles kapillæren ved 50 millibar tryk med baggrundselektrolytter natten over, mens kapillæren er i CE-sprøjten i ionkilden. Indstil DETNE-MS-positivt iondetektion til at spænde over et masse-til-afgift-forhold på 50 til 1.700 med en dataopkøbshastighed på 500 millisekunder pr. spektrum, og bekræft, at både profil- og centroiddataene gemmes i D-filformat.Indstil elektrospray ionisering betingelser til kapillær og til dyse spændinger på 2000 volt hver, forstøver gas til 10 pounds per kvadrattomme, og tørring gas levering til otte liter i minuttet ved 300 grader Celsius med en kappe gasstrøm på 3,5 liter i minuttet ved 195 grader Celsius under erhvervelse. Indstil derefter MS-spændingsindstillingerne for fragmenter, skimmer og oktaol en radiofrekvens til henholdsvis 120, 65 og 750 volt, og indstil parametrene for instrumentkontrol og dataindsamling i henhold til eksperimentets design. Til dataanalyse skal du åbne CE-MS-dataene med flere segmenter i systemsoftwaren.Under kromatogrammer skal udtræksdataene og kromatogram- og massespektraldataformaterne indstilles til profiltilstand. Under udjævning skal du vælge kvadratisk kubisk Savitzky-Golay og indstille funktionsbredden til 15 punkter. Klik derefter på Integrer MS, og indstil integratoren til agil.Under spidsfiltre skal du indstille det maksimale antal toppe til 11. Klik på integrationstoppeliste under visning, og vælg højeste antal, retentionstid, topområde, tophøjde og signal til støj-forhold. Gem derefter parametrene under et entydigt metodenavn, og anvend metoden på processen til fortolkning af hvert datasæt.I denne repræsentative analyse af forskellige isomerriske isomiske stoffer af misbrug og deres metabolitter, 30 løst toppe fra 10 uafhængige prøver af en lægemiddelblanding blev opdaget uden prøve overførsel. To andre isoobariske opioider kunne løses fuldt ud, da 20 forskellige toppe med den fulde indsamling af scanningsdata. Tilsvarende, to amfetamin positionelle isomerer blev fuldt ud løst i denne multi-segment CE-MS analyse, at skelne ulovlige metamfetamin misbrug fra den potentielle misbrug af phentermin, en ordineret stimulerende, der bruges som en appetitnedsættende for vægttab.I denne repræsentative lægemiddelscreeningsanalyse blev et positivt screeningstestresultat for metadon fremkaldt af påvisning af et stort signaltop, der var co-migrerende med metadon-d3-toppen med en lav massefejl. Ingen andre signaler blev påvist i andre urinprøver inden for samme løb, og den påviste metadonkoncentration oversteg 13 gange den anbefalede cutoff-grænse sammenlignet med den målte ionresponsforhold i prøven og korrigeret med en fire gange urinfortyndingsfaktor, hvilket bekræfter patienternes tilslutning til metadonvedligeholdelsesbehandling. Her blev en seriel injektionskonfiguration i multisegmentet CE-MS, bestående af fem forskellige lægemiddelkalibrer, analyseret i to eksemplarer inden for et enkelt løb sammen med den syntetiske urinstr..Lægemidlet metabolitter blev opdaget som deres potenated molekylære ioner over deres screening cutoff grænser. Efter denne procedure, et stort antal polære og ioniske metabolitter i urinen kan også analyseres af MSI CMS til støtte for opdagelse-baserede metaboliske forskning. Derudover kan omfattende overvågning af en bred vifte af udefrakommende lægemidler og deres metabolitter opnås, herunder ikke-ordineret medicin og ulovlige stoffer tilbøjelige til misbrug.Denne optimerede metode kan også bruges til rutinemæssigt at screene andre stoffer af misbrug. Disse kunne være cannabis eller alkohol metabolitter og vores metode kan også skelne mellem en syntetisk eller en falsk urin matrix og en naturlig, reel, autentisk doneret urinprøve samt. Husk altid at være forsigtig, når du arbejder med biologiske væsker.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Rapid High Throughput Amylose Bestemmelse i frysetørret kartoffelknolden Prøver

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analyserer Protein Dynamics hjælp af brint Exchange massespektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

En High-throughput-kompatible FRET-baseret platform til identifikation og karakterisering af botulinumneurotoksin lyskæde modulatorer

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Forbedret i-gel Reduktive β-Elimination for Omfattende O-bundne og sulfo-Glykobiologi ved massespektrometri

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

Analyse af flygtige og oxidationsfølsomme Forbindelser med kold indsugningssystem og Electron Impact massespektrometri

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Deacetylering Analyser til Løs Samspil mellem sirtuins (SIRT2) og specifikt protein-substrater

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Hurtig High-throughput Arter Identifikation af Botanisk Materiale Brug Direct Analyse i Real Time High Resolution massespektrometri

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...