Name: high-throughput and comprehensive drug surveillance using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry
Uploaded: 2019-04-23T12:30:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry at JoVE.com

P.B.M. wenst te erkennen van de financiering van de steun van de natuurwetenschappen, Engineering Research Council of Canada en de Stichting van Canada voor innovatie, genoom Canada en McMaster University. De auteurs bedanken Howard Lee bij Seroclinix Corporation en Dr. Marcus Kim van Agilent Technologies voor hun inzichtelijke discussies. Bovendien, erkennen de auteurs Dr. Zainab Samaan van de afdeling van psychiatrie en Gedragswetenschappen op McMaster University en de stemmingen stoornis kliniek van St. Joseph's Hospital voor toegang tot de deidentified patiënt urine monsters gebruikt in deze studie .

Geblindeerde urine monsters werden vriendelijk geleverd door Dr. Zainab Samaan uit de stemmingen stoornis kliniek van St. Joseph's Hospital (Hamilton, ON, Canada), wiens studie werd goedgekeurd door de Hamilton geïntegreerde onderzoek Ethics Board.
1. reagentia en de bereiding van de oplossingen van de monsters
<ol><li>
Achtergrond elektrolyt voorbereiding
	<ol>
<li>50 mL achtergrond elektrolyt (BGE) tweewekelijkse, 1 M mierenzuur, pH 1.8, met 15% v/v acetonitril als een biologische modifier voor te bereiden.</li>
		<li>Aliquoot 1.9 mL geconcentreerd mierenzuur voorraad (26.5 M) in een maatkolf van 50 mL en voeg 7,5 mL acetonitril en 40.6 mL gedeïoniseerd water toe zodat het totale volume 50 mL. Vervolgens bewerk ultrasone trillingen ten de oplossing gedurende 15 minuten en overbrengen naar een gesteriliseerde fles met strak afdichting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Schede vloeibare voorbereiding
	<ol>
<li>200 mL schede vloeibare oplossing wekelijks, bestaande uit mierenzuur van 0,1% in 60:40 (MeOH:H2van O) voor te bereiden.</li>
		<li>Aliquot 200 µL van mierenzuur (26.5 M stock) in een fles met 120 mL MeOH en 80 mL H2O schede vloeistof en ontgas het gedurende 15 minuten te maken.</li>
		<li>Voeg vervolgens 10 µL van elk van de volgende verwijzing ionen, purine en hexakis (2,2,3,3-tetrafluoropropoxy) phosphazine (HP-921), in de schede vloeistof tot constante massa signalen op m/z 121.05087 en m/z 922.00979, respectievelijk. Opmerking: Deze referentie-ionen zorgen voor real-time massa correctie en ook controleren voor potentiële matrix-geïnduceerde ion onderdrukking of toebehoren effecten tijdens de scheiding.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Standaard voorbereiding
	<ol>
<li>Een standaard oplossing, bevattende een mengsel van 84-drug paneel met de 3 x klinische screening cut-off niveau (L6),14 in 1 mL methanol, met behulp van de normen van de drug gekocht van een chemische leverancier voor te bereiden. Bereiden afzonderlijk een mengsel van 48 bijpassende Halfzwaar interne drug standaard (d-ISs) bij een 10-fold hogere concentratie dan de 84-drug mengsel in 1 mL van methanol. Daarnaast bereiden een stamoplossing met 200 µM van 4-fluoro -L-fenylalanine (F-Phe) en 3-chloro -L-tyrosine (Cl-Tyr) in 1 mL gedeïoniseerd H2O.</li>
		<li>Uitvoeren van een vijfvoudige verdunning van het bovengenoemde 84-drug mengsel (20 µL) en de 48 d-ISs (20 µL), evenals een tienvoudige verdunning van 4-fluorophenylalanine (F-Phe, 10 µL) en 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 µL) in een gecertificeerde synthetische urine matrix (40 µL) om een totaal volume van 100 ÂµL in een centrifugebuis 250 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Externe kalibratie kromme voorbereiding
	<ol>
<li>Vijf-punts externe kalibratiekrommen bereiden (zoals hieronder beschreven) in viervoud (n = 4) over een 20-fold dynamische bereik met behulp van het standaard mengsel van 84-drug en 48 van hun overeenkomstige d-ISs gemaakt in stap 1.3.1. Bijvoorbeeld voor het maken van een vijf-punts externe kalibratie-curve, zorgen verdunnen het 84-drug mengsel (L6, stap 1.3.1) 2-, 4 - 10-, 20-, en 40-fold, overwegende dat er noodzaak doen rijzen een vijfvoudige verdunning van d-ISs (20 µL) en een tienvoudige verdunning van 4-F-Phe (matching 10 µL) en Cl-Tyr (10 µL) als een extra in een synthetische urine matrix te maken van een totaal volume van 100 ÂµL. In gevallen wanneer een overeenkomende d-IS is niet beschikbaar voor een specifieke drug, IS gebruik 4-F-Phe als een surrogaat voor de normalisatie van de gegevens. Opmerking: Voorkomen dat de opneming van aanvullende d-ISs-die kruis-interfereren met andere DoA binnen het paneel als ze niet volledig worden opgelost door de CE-scheiding (isobaar).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van de monsters van de urine
	<ol>
<li>Ontdooi deidentified ochtend urine monsters van een representatieve cohort van tien klinisch depressieve patiënten met een geschiedenis van de drug bekend recept. Slaan de urine monsters bij-80 ° C na collectie totdat zij moeten worden ontdooid voor analyse. Opmerking: Vermijd meerdere bevriezen-ontdooien cycli van urine of een vertraagde opslag bij kamertemperatuur na de collectie als gevolg van hun effect op de chemische stabiliteit van bepaalde DoA metabolieten en hun geconjugeerde.</li>
		<li>Vortex de deidentified ochtend urine monsters voor 30 s samen en, vervolgens, centrifugeer ze voor 1 min bij 14.000 x g voor sedimentatie. Daarna verwerkt aliquoot 10 µL van de bovengenoemde urine, 10 µL van d-IS, en 5 µL van F-Phe/Cl-Tyr en 25 µL gedeïoniseerd H2O en vortex voor 1 min (Herhaal deze stappen in drievoud te beoordelen van technische precisie). Een hoeveelheid van 20 µL van het mengsel van bovengenoemde overbrengen in een polypropyleen flesje voor analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. installatie van de CE-TOF-MS-systeem
<ol><li>Ongecoate gesmolten siliciumdioxide capillair conditioning parameters
	<ol>
<li>Ervoor te zorgen dat alle normen, externe kalibratiekrommen en urine monsters opgesteld in gedeelten 1.3-1.5 zijn gescheiden met behulp van een ongecoate open-buisvormige gesmolten siliciumdioxide polyimide beklede capillair met een inwendige diameter van 50 μm, een buitendiameter van 360 µm, en een capillaire totaallengte van 135 cm. Opmerking: Een diamant cutter hulpmiddel wordt gebruikt om consistente haarvaten, die verder worden gecontroleerd om ervoor te zorgen een flush en glad gesneden.</li>
		<li>Verwijderen van ongeveer 7 mm polyimide laklaag van zowel de distale capillaire einden, met behulp van een capillaire window maker, te verminderen "Carry-over monster" en om te voorkomen dat potentiële polyimide zwelling bij aanraking met organische oplosmiddelen.</li>
		<li>Zorg ervoor dat ongeveer 2 mm van de capillaire uitlaat uit de CE sproeier naald uitsteken en de capillaire inlaat in de CE cartridge installeren door twee 360 ° draait in een lus. Daarna zorgvuldig de CE cartridge installeren in de CE en plaats de CE spuitmachine uit de bron van de ion wanneer conditionering van het capillair. Opmerking: Cut de capillaire outlet consequent als het is van cruciaal belang om te zorgen voor een stabiele electrospray huidige wanneer gekoppeld aan MS. Twee verschillende Spuittoestellen werden gebruikt in dit werk: een CE-sproeier werd gebruikt voor de analyse van het monster, en een LC-spuittoestel werd gebruikt voor de massale kalibratie.</li>
		<li>Zorg ervoor dat het capillair conditionering met de CE-sproeier niet geplaatst in de ion-bron uitvoeren. Zet de LC-sproeier in de ion-bron. Opmerking: Dit zorgt voor massale kalibratie terwijl het vermijden van verontreiniging van de coaxiale schede vloeibare interface die wordt vervolgens gekoppeld aan de TOF-MS.</li>
		<li>Nieuwe haarvaten voorwaarde door het selecteren van de flush functie (940 mbar) op van de leverancier software die wordt gebruikt om te controleren van het instrument en de duur van de flush instellen op 30 minuten, elk voor vier verschillende oplosmiddelen in de volgende volgorde: methanol, 1 M NaOH, gedeïoniseerd water en BGE. Zorg ervoor dat de pomp isocratic op stand-by zetten tijdens de periode van de capillaire conditionering.</li>
		<li>Veeg de CE-MS sproeier met een weefsel doekje gedrenkt in MeOH/H2O te verwijderen van alle resterende zout deposito's.</li>
		<li>Voer de dagelijkse preventief onderhoud van het systeem van de CE-MS voordat het analyseren van de monsters. Het gebruik van methanol veeg neer van CE elektrode (bij de inlaat) maar gebruiken een isopropanol en water (50:50) mengsel voor het reinigen van de CE-MS-interface, die is belangrijk om te voorkomen dat zout opbouw en beperken van potentiële monster "Carry-over".</li>
		<li>Verwijderen van de LC-spuitmachine uit de ion-bron en de positie van de schoongemaakte machine met een nieuw geconditioneerde capillair in de coaxiale schede vloeibare interface voor CE-MS.</li>
		<li>De pomp isocratic inschakelen en toepassen van een spanning van 30 kV voor 15 min om ervoor te zorgen dat een stabiele CE huidige profiel wordt bereikt vóór de analyse van de urine.</li>
	</ol></li>
	<li>Injectie en scheiding voorwaarden met behulp van CE
	<ol>
<li>Open de software van de leverancier gebruikt voor het beheersen van het instrument om de CE parameters instellen en selecteer de conditionering van stap. Spoelen functie ingesteld op 600 s en geeft u een BGE flacon positie. Opmerking: Een externe water chiller moet mogelijk worden verbonden met CE-systemen dat het gebrek aan monster lade koeling van functies, zoals dit is nodig om te voorkomen dat monster verdamping bij het analyseren van grote hoeveelheden van volume-beperkte monsters.</li>
		<li>Instellen van de functie van de injectie te injecteren hydrodynamica de monsters op 100 mbar voor 5 s en electrokinetically injecteren BGE spacers om 30 kV voor 75 s. Opmerking: Dit proces wordt herhaald met de injectie van elk monster (vanuit een positie van verschillende vial) gevolgd door een spacer BGE (uit dezelfde flacon positie), die automatisch wordt uitgevoerd binnen een programma van de methode op de software voor een totaal van 11 afzonderlijke monsters geanalyseerd in de dezelfde uitvoeren wanneer met behulp van een MSI-indeling. 10 urine monsters analyseren in willekeurige volgorde na een mengsel van 84-panel drug met de licht-donkerscheiding screening niveau als de eerste positie van het monster voor elk MSI-CE-MS run wordt geïnjecteerd.</li>
		<li>Stel de spanning toegepast als 30 kV, de cartridge temperatuur 25 ° C, en de totale runtime moet 40 min. met behulp van het tijdschema, toepassen op een drukverschil van 2 mbar/min vanaf 0 min 40 min tijdens de scheiding. Opmerking: Een kleurovergang druk wordt toegepast tijdens de scheiding te voorzien in de elutie van slow-migratie, waarin sommige benzodiazepinen zwak, fundamentele en neutrale/zure drugs (bijvoorbeeldparacetamol, barbituraten). Echter, meest elementaire DoA en hun metabolieten migreren als caties binnen 25 min, met inbegrip van amfetaminen, opioïden en andere klassen van alkaloïden.</li>
		<li>Na de overname van de steekproef is voltooid, zorg ervoor dat het capillair spoelen bij een lage druk (50 mbar) met BGE tot de volgende dag. Anders, spoel het capillair voor 600 s bij een hoge druk (900 mbar) met water en vervolgens voor 600 s met lucht, en bewaren het in een sproeier houder tot het volgende gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Isocratic pump en schede vloeistof
	<ol>
<li>Gebruik een Infinity Isocratic Pump en een Infinity Degasser te leveren van de schede vloeistof (60:40 MeOH:H,2O met mierenzuur van 0,1% v/v) met een snelheid van 10 µL/min naar de CE-MS spuitmachine.</li>
	</ol></li>
	<li>TOF-MS instellingen
	<ol>
<li>Ervoor zorgen dat een TOF-MS, met een coaxiale schede-liquid electrospray ion bron en verwarmde stikstofgas, is voorzien van een CE-apparaat.</li>
		<li>Werken de TOF-MS onder positief ion detectie die een massa van m overspannen/z 50-1700, met een gegevenssnelheid voor de verwerving van 500 ms/spectrum. Ervoor zorgen dat zowel het profiel en de gegevens worden opgeslagen in een bestandsindeling ".d" zwaartepunt.</li>
		<li>De electrospray ionisatie voorwaarden te zijn: Vcap en mondstuk spanning aan 2.000 V, de vernevelaar gas bij 10 psi en het drogen gas geleverd op 8 L/min bij 300 ° C, met een schede gasstroom van 3,5 L/min bij 195 ° C. Bovendien, het instellen van de MS voltage instellingen van de fragmentor, skimmer en Oct1 RF 120, 65 en 750 V, respectievelijk. Opmerking: Vcap en mondstuk spanning, evenals vernevelaar gas werden uitgeschakeld tijdens de seriële monster injectie volgorde gebruikt in MSI-CE-MS, maar de electrospray was geprogrammeerd om terug worden gedraaid op 1 min na de inleiding van de elektroforetische scheiding om te voorkomen dat de huidige fouten als gevolg van het suctioning van effecten.</li>
		<li>Uitvoeren van het instrument besturingselement en gegevens verkrijgen met behulp van software van de leverancier (Tabel van materialen).</li>
	</ol></li>
	<li>Data-analyse
	<ol>
<li>Het analyseren van de gegevens van de MSI-CE-MS met behulp van de leverancier software, met inbegrip van verwerking, gegevens vloeiend maken, en de integratie van uitgepakte ion electropherograms (is) voor vertegenwoordiger DoA en hun metabolieten.</li>
		<li>Open de software en de volgende parameters instellen.<ol>
<li>Onder chromatogrammen, selecteert u de notatie van de gegevens van de extractieen chromatografische en massa spectrale gegevens opmaken naar profiel -modus.</li>
			<li>Selecteer Quadratic/Cubic Savitzky Golay onder de smoothing functie en de functie breedte op 15 punten.</li>
			<li>Klik vervolgens Integreren (MS), de integrator als Agileinstellen en selecteert u het maximale aantal pieken limiet aan de grootste 11 onder piek filters.</li>
			<li>Klik op weergave, klik op integratie piek lijsten selecteer het nummer van de piek retentietijd (RT), piekoppervlakte, piekhoogteen signaal - ruisverhouding (SNR).</li>
			<li>Sla deze parameters onder de naam van een unieke methode. Deze methode toepassen op het proces en interpreteren van elke gegevensset. Opmerking: Een overzichtstabel met piek nummer, de RT de piekoppervlakte en hoogte en de SNR weergegeven aan de rechterkant. Normalisatie van gegevens uitvoeren voor gemeten RT en geïntegreerde piekoppervlakte voor elke DoA ofwel een matching d-IS of (indien niet beschikbaar) voor F-Phe ter verbetering van analytische precisie.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. analyse van de Urine monsters en externe kalibratiekrommen
<ol><li>
Verschillende seriële injectie configuraties gebruikt in MSI-CE-MS
	<ol>
<li>Voor de eerste seriële monster injectie configuratie, gebruikt om aan te tonen van de drug isomeer/isobar resolutie (figuur 1A), er zorg voor dat vijf herhaalde injecties worden uitgevoerd op een mengsel van 84 drug normen met d-IS en 4-F-Phe/Cl-Tyr, gevolgd door een zesde injectie, oftewel een blancomonster in synthetische urine, en vijf aanvullende injecties van het standaard drug-mengsel.</li>
		<li>Voor de tweede seriële monster injectie configuratie, gebruikt om aan te tonen van de opsporing van DoA in individuele urine monsters van patiënten met een bekend recept (figuur 2A), er zorg voor dat de stekker van de eerste steekproef is een mengsel van 84-drug standaard mengsel bij een 1 x licht-donkerscheiding screening niveau (positieve controle) gevolgd door een gerandomiseerde injectie van 10 monsters van de verdunde urine van patiënten: #293, #88 #309, #43, #281, #64, #221, #208, #183 en #50.</li>
		<li>Voor de derde seriële monster injectie configuratie, gebruikt ter illustratie van het verwerven van externe kalibratiekrommen in een enkele run, zorgen dat kalibrant oplossingen voor DoA bereid zijn over een 20-fold lineaire dynamische bereik overeenkomt met 0,25 x, 0,5 x, 1 x 2.5 x, en 5 x cut-off concentratieniveaus, samen met bijpassende d-IS en F-Phe/Cl-Tyr als extra IS in een matrix van synthetische urine (n = 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Products - Vital Statistics Rapid Release - Provisional Drug Overdose Data Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/drug-overdose-data.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/drug-overdose-data.htm</a> (2018)</li><li>Olfson, M., King, M., Schoenbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Young+People+With+Antipsychotic+Medications+in+the+United+States.">Treatment of Young People With Antipsychotic Medications in the United States.</a> JAMA Psychiatry. 72, 867-874 (2015).</li><li>Moeller, K. E., Kissack, J. C., Atayee, R. S., Lee, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Interpretation+of+Urine+Drug+Tests:+What+Clinicians+Need+to+Know+About+Urine+Drug+Screens.">Clinical Interpretation of Urine Drug Tests: What Clinicians Need to Know About Urine Drug Screens.</a> Mayo Clinic Proceedings. 92, 774-796 (2017).</li><li>Levy, S., Siqueira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committee+on+Substance+Abuse.+Testing+for+Drugs+of+Abuse+in+Children+and+Adolescents.">Committee on Substance Abuse. Testing for Drugs of Abuse in Children and Adolescents.</a> American Academy of Pediatrics. 133, e1798 (2015).</li><li>Pesce, M., Mikel, C., West, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+two+drug+testing+technologies:+GC-MS+and+LC-MS/MS.">A tale of two drug testing technologies: GC-MS and LC-MS/MS.</a> American Society of Interventional Pain Physicians. 13, 91-92 (2010).</li><li>Saitman, A., Park, H. -. D., Fitzgerald, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False-Positive+Interferences+of+Common+Urine+Drug+Screen+Immunoassays:+A+Review.">False-Positive Interferences of Common Urine Drug Screen Immunoassays: A Review.</a> Journal of Analytical Toxicology. 38, 387-396 (2014).</li><li>In Pursuit of Liquid Gold. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2017/12/27/business/urine-test-cost.html">https://www.nytimes.com/interactive/2017/12/27/business/urine-test-cost.html</a> (2017)</li><li>Wu, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+liquid+chromatography-high+resolution+mass+spectrometry+(LC-HR/MS)+in+clinical+toxicology.">Role of liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HR/MS) in clinical toxicology.</a> Clinical Toxicology. 50, 733-742 (2012).</li><li>Guale, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+LC-TOF-MS+Screening+for+Drugs,+Metabolites,+and+Collateral+Compounds+in+Forensic+Toxicology+Specimens.">Validation of LC-TOF-MS Screening for Drugs, Metabolites, and Collateral Compounds in Forensic Toxicology Specimens.</a> Journal of Analytical Toxicology. 37, 17-24 (2013).</li><li>Kaupilla, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+metabolites+and+drugs+of+abuse+from+urine+samples+by+desorption+electrospray+ionization-mass+spectrometry.">Rapid analysis of metabolites and drugs of abuse from urine samples by desorption electrospray ionization-mass spectrometry.</a> The Analyst. 132, 868-875 (2007).</li><li>Bynum, N. D., Moore, K. N., Grabenauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Laser+Diode+Thermal+Desorption-Tandem+Mass+Spectrometry+(LDTD-MS-MS)+in+Forensic+Toxicology.">Evaluation of Laser Diode Thermal Desorption-Tandem Mass Spectrometry (LDTD-MS-MS) in Forensic Toxicology.</a> Journal of Analytical Toxicology. 38, 528-535 (2014).</li><li>Kuehnbaum, N. L., Kormendi, A., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisegment+Injection-Capillary+Electrophoresis-Mass+Spectrometry:+A+High-Throughput+Platform+for+Metabolomics+with+High+Data+Fidelity.">Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry: A High-Throughput Platform for Metabolomics with High Data Fidelity.</a> Analytical Chemistry. 85, 10664-10669 (2013).</li><li>Nori de Macedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sweat+Metabolome+of+Screen-Positive+Cystic+Fibrosis+Infants:+Revealing+Mechanisms+Beyond+Impaired+Chloride+Transport.">The Sweat Metabolome of Screen-Positive Cystic Fibrosis Infants: Revealing Mechanisms Beyond Impaired Chloride Transport.</a> ACS Central Science. 3, 904-913 (2017).</li><li>DiBattista, A., Rampersaud, D., Lee, H., Kim, M., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Throughput+Screening+Method+for+Systematic+Surveillance+of+Drugs+of+Abuse+by+Multisegment+Injection-Capillary+Electrophoresis-Mass+Spectrometry.">High Throughput Screening Method for Systematic Surveillance of Drugs of Abuse by Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 89, 11853-11861 (2017).</li><li>Cao, Z., Kaleta, E., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantitation+of+78+Drugs+and+Metabolites+in+Urine+with+a+Dilute-And-Shoot+LC-MS-MS+Assay.">Simultaneous Quantitation of 78 Drugs and Metabolites in Urine with a Dilute-And-Shoot LC-MS-MS Assay.</a> Journal of Analytical Toxicology. 29, 335-346 (2015).</li><li>Drouin, N., Rudaz, S., Schappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Supported+Liquid+Membrane+for+Electromembrane+Extraction+of+Polar+Basic+Endogenous+Metabolites.">New Supported Liquid Membrane for Electromembrane Extraction of Polar Basic Endogenous Metabolites.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 159, 53-59 (2018).</li></ol>

De auteurs vermelden een octrooi in de VS (PCT/CA2014/050454) op MSI-CE-MS als een multiplexed screening platform en gegevens workflow voor chemische analyse.

Conventionele chromatografische scheidingen is meestal afhankelijk van een injectie van één monster per run, die dan wordt gevolgd door een kleurovergang elutie voor het oplossen van complexe drug mengsels en kolom reconditionering. Deze vereisten beperken fundamenteel monsters worden verwerkt en plicht cyclus zelfs wanneer optimale kolom-switching programma gebruikt. In dit verband, hoogvolume urine geneesmiddelenanalyse voor de werkplek, toxicologie of therapeutische monitoring toepassingen door GC-MS/MS en in toenemende mate, LC-MS/MS zijn dus parallel uitgevoerde maar gebruikt bij voorkeur als een tweede laag of een bevestigende testen wanneer nodig (dat wil zeggen, juridische of medische context). Dit is te wijten aan de veel hogere investeringen en operationele kosten, evenals de complicaties met data-analyse bij het vergelijken van monsters geanalyseerd op meerdere instrumentale platforms binnen een erkende laboratorium. Dientengevolge, steeds immunoassay nog de primaire methode voor routinematige drug screening ondanks het feit dat gevoelig is voor de vals-positieven en vals-negatieven onder veel klassen van de drug, met beperkte toegang tot antilichaam reagentia voor opkomende "designer drugs". Eerdere studies hebben aangetoond dat multiplexed scheidingen gebaseerd op MSI-CE-MS een eenvoudige oplossing bieden om de monsters worden verwerkt tot een orde van grootte. Bovendien is deze benadering biedt voor het ontwerp van nieuwe gegevens werkstromen voor ontdekking van biomarker met hoge gegevens trouw op basis van de uitvoering van effectieve batch correctie en kwaliteitscontrole12,13,14. Echter, de invoering van 10 of meer seriële hydrodynamische injecties in MSI-CE-MS verkort capillaire lengte te handhaven van hoogrenderende scheidingen, waardoor de selectiviteit gevaar komen kunnen bij het analyseren van DoA en hun metabolieten in menselijke urine.
Hierin, introduceerden we een Elektrokinetische injectie van de BGE na elke hydrodynamische monster injectie, zodanig dat de scheiding gebruik van de volledige capillaire lengte (120 cm) maakt, waardoor de resolutie van belangrijke drug isobaren/isomeren worden verbeterd bij het gebruik van Full-scan data-acquisitie door TOF-MS (figuur 1A). In vergelijking met een recente verslag14, wordt betere resolutie bereikt voor verschillende belangrijke isobaar/isomere DoA en hun metabolieten, die is van cruciaal belang wanneer screening voor grote drug panelen. Bijvoorbeeld, werd de resolutie van verschillende belangrijke structurele/functionele groep isomeren gerealiseerd, waaronder drie analoog opioïde drugs/metabolieten (figuur 1B), twee ongerelateerde opioïden isobaren (Figuur 1 c) en twee metamfetamine positionele isomeren (Figuur 1 d). In alle gevallen is monster overdracht van seriële injectie van verschillende kalibrant oplossingen binnen hetzelfde uitvoeren niet significant zoals bevestigd door een negatieve urine controle/blank. Daarnaast verbeterde resolutie wordt ook gerealiseerd voor diverse Kruis-storingen waarbij bepaalde d-ISs met isobaar drugs in het deelvenster, zoals cotinine-d3 en 3,4-methyleendioxyamfetamine (MDA), EDDP-d3 en imipramine, norfentanyl-d5 en ketamine, codeine-d6 en sertraline, en cocaïne-d3 en zolpidem. Dit resultaat wordt uitgebreid tot andere isobaar storingen binnen het deelvenster drug die beter waren opgelost in deze studie (b.v., noroxycodone/oxymorphone, normeperidine/methylfenidaat), evenals grote achtergrond urine storingen (bv , in-source fragment ionen van creatinine met amfetamine)14. Inderdaad, toegang tot twee orthogonale parameters om te voldoen aan de vermeende identificatie van een specifieke DoA is kritiek aan het verminderen van vals-positieven te wijten aan isobarische storingen, namelijk nauwkeurige massa gecombineerd met comigration met d-ISs. Ook de detectie van een of meer biotransformed metabolieten van de drug van de bovenliggende binnen hetzelfde monster, zoals gehydroxyleerde, demethylated of intact glucuronide drug conjugate(s), voegt verder vertrouwen richting drug identificatie terwijl het uitbreiden van het venster voor de detectie.
De licht-donkerscheiding aanbevolen niveaus voor urine drug screening variëren voor verschillende klassen van DoA (variërend van 50 tot 1000 ng/mL) afhankelijk van hun farmacokinetiek, toxiciteit en achtergrond storingen, teneinde het vooroordeel van de methode op basis van richtsnoeren van de Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA)14. Het potentieel voor MSI-CE-MS op te sporen en te identificeren van verschillende klassen van DoA rechtstreeks in urine met minimal steekproef voorbehandeling werd toegepast op een groep van klinisch depressieve patiënten met een bekend recept-record. De definitieve identificatie van methadon (voorgeschreven), amfetamine (nonprescribed/illegale), venlafaxine (voorgeschreven) en pregabaline (voorgeschreven) in verdunde, maar nonhydrolyzed, urine monsters werd aangetoond bij het gebruik van MSI-CE-MS. Dit was gebaseerd op een directe vergelijking van een drug gedetecteerd in een specifieke injectie positie ten opzichte van het mengsel van de 84-drug geïntroduceerd in de eerste positie van het monster op de aanbevolen bestandscontrole van de licht-donkerscheiding niveau dat als een interne verwijzing/QC en de positieve controle fungeert (Figuur 2). Ook de absolute drug kwantificering is haalbaar wanneer voor een geneesmiddel ten opzichte van haar d met behulp van externe kalibratie curven (Figuur 3) op basis van de verhouding van de reactie ion gemeten-IS. In tegenstelling tot de meest chromatografische scheidingen, er is geen deuterium-effect invloed van migratie tijdverschillen tussen een d-IS en zijn nondeuterated drug aangezien zij analoge elektroforetische mobiliteiten in gratis oplossing in CE bezitten. Inderdaad, het gedrag van de migratie van DoA is nauwkeurig gemodelleerd in CE, gebaseerd op hun fundamentele fysisch-chemische eigenschappen/chemische structuur, namelijk de moleculaire volume en de effectieve kosten (pKeen)14. Omdat veel drugs ook ondergaan belangrijke secundaire metabolisme vóór uitscheiding in de urine (bijvoorbeeldmorfine glucuronide), screening cut-off niveaus aanpassing de gemeten concentraties zijn lager dan verwacht in vergelijking vereisen met methoden die gebruik maken van enzym hydrolyse voor totale drug detectie. Een groot voordeel van "Verdun-en-shoot" urine drug testen, naast het reduceren van kosten/tijd, monster gehanteerd, en een potentiële vertekening of batch schommelingen als gevolg van onvolledige enzym hydrolyse, is dat de vermoedelijke scherm-positieven verder zijn bevestigd door de detectie van een of meer verwante drug metabolieten binnen hetzelfde monster. Dit biedt ook diepere inzichten in drug farmacokinetiek en optimale dosering vereisten voor elke patiënt terwijl het verbeteren van de detectie voor "snelle" metabolizers of voorgeschreven/illegale drugs met korte halfwaardetijd. Bovendien, comigration met een bijpassende d-speelt twee belangrijke functies voor betrouwbare drug screening wanneer gebruikt MSI-CE-MS — namelijk, het duidt de exacte monster injectie positie (dat wil zeggen, patiënt #) terwijl ook corrigeren voor verschillen in ion Reacties/injectie volumes voor verbeterde precisie en nauwkeurigheid.
Voortzetting van de werkzaamheden is gericht op het ontwikkelen van aangepaste softwaretools ter vergemakkelijking van de geautomatiseerde verwerking van gegevens van multiplexed scheidingen gekoppeld aan HRMS zoals vereist voor hoog-volume urine drug testende met QC/QA. Strenge validatie van MSI-CE-MS voor de breedspectrum screening van DoA zal ook worden onderzocht onder een grotere cohort van hoog-risico patiënten om objectief evalueren voorgeschreven geneesmiddel hechting en potentieel misbruik/vervanging die in gevaar kunnen brengen behandeling werkzaamheid, veiligheid van de patiënt en/of psychiatrische evaluatie/diagnose. Een aanvullende analyse van zure/anionogene soorten DoA en hun metabolieten zal ook worden uitgevoerd door MSI-CE-MS onder alkalische omstandigheden met negatief ion modus detectie als vereist voor de alomvattende screening van natuurlijke/synthetische cannabinoïden. Dit is belangrijk, gelet op de dreigende volksgezondheid implicaties van de legalisatie van marihuana recreatieve in heel Canada en verschillende Amerikaanse Staten. Een groot voordeel van full-scan data-acquisitie door TOF-MS is dat retrospectieve analyse van monsters kan worden uitgevoerd, zelfs wanneer de urine exemplaren zijn niet langer beschikbaar voor het testen van de follow-up, terwijl andere levensstijl of dieet posities kunnen beter worden beoordeeld begrijpen differentiële reacties op medicamenteuze therapie. Kortom biedt een snelle maar toch nauwkeurige drug surveillance methode door MSI-CE-MS aanzienlijke voordelen aan conventionele gerichte immunoassay, evenals directe infusie/ambient ionisatie-MS/MS-methoden die gevoelig voor storingen/bias zijn bij het oplossen van uitgebreide panels van DoA en hun metabolieten in complexe biologische monsters op incrementele kosten.

Een alarmerende toename van het misbruik van en de verslaving aan opioïden voor het beheer van chronische pijn vertegenwoordigt een groeiende bedreiging voor de volksgezondheid, met meer dan 70.000 overdosis sterfgevallen in de Verenigde Staten in 20171geschat. Ook zijn diverse andere psychotrope medicijnen ook op grote schaal voorgeschreven aan kinderen en jonge volwassenen voor de behandeling van angst, depressie en psychische problemen2. Dientengevolge, is urine drugstests methoden, grote schaal ontwikkeld voor de werkplek en forensische toxicologie, van vitaal belang voor de therapeutische monitoring van voorgeschreven medicatie die gevoelig voor tolerantie en afhankelijkheid3,4 zijn. Dit is nodig om te zorgen voor naleving, optimale therapeutische werkzaamheid en veiligheid van de patiënt, terwijl het openbaren van potentiële vervanging, met inbegrip van illegale of nonprescribed drugs misbruik. Op dit moment urine drugtests voor DoA vertrouwen op een tweeledige aanpak, bestaande uit een eerste concurrerende immunoassay scherm via point-of-care apparaten of laboratorium analysers, gevolgd door een bevestigingstest met grotere specificiteit op basis van GC-MS/MS en, in toenemende mate LC-MS/MS5. Immunoassay zijn echter gevoelig voor de vertekening, zoals antilichaam reagentia nonspecifically aan verschillende klassen van de drug binden voor het genereren van een vermoedelijke scherm-positief resultaat, waardoor een betrouwbare identificatie en kwantificering van specifieke drugs of complexe drug mengsels6. In dit verband nauwkeuriger urine drugtests zijn dringend nodig gezien de exorbitante kosten van uitgebreide polydrugsgebruik schermen,7 met inbegrip van "designer drugs" en synthetische urine producten die conventionele ontsnappen gerichte tests.
Hoogrenderende scheidingen in combinatie met hoge resolutie MS (HRMS) met behulp van TOF of orbitrap massa analysers zijn voorgesteld als een nontargeted strategie voor drug surveillance in een tijdperk van Polyfarmacie en uitbreiden van de panels van DoA8,9 . Conventionele LC scheidingen zijn echter traag (> 15 min) als gevolg van de lange elutie tijden voor de resolutie van chemisch verschillende klassen van DoA en hun metabolieten met kleurovergang elutie programma's, waardoor de monsters worden verwerkt voor routinematige drug screening wordt beperkt. U kunt ook directe analysemethoden op basis van de desorptie ionisatie (DESI)10 en laserdiode thermische desorptie (LDTD) zorgen voor snellere drug screening zonder scheiding11. Deze ambient ionisatie-methoden zijn echter vatbaar voor isobaar/isomere storingen bij het analyseren van complexe urine specimens, waarvoor derhalve onafhankelijke bevestigende tests.
Ons laboratorium heeft onlangs een multiplexed scheiding platform om te monster doorvoer verhogen met behoud van de resolutie en gegevens trouw van een scheiding van de hoogrendabele gebaseerd op MSI-CE-MS12ontwikkeld. Nieuwe gegevens werkstromen kunnen worden ontworpen in MSI-CE-MS voor de nontargeted metaboliet (d.w.z., metabolomica) profilering van volume-beperkte biospecimens, overwegende dat de kwaliteitscontrole (QC) toestaan voor de correctie van de partij zoals vereist voor grootschalige bevolking studies13. In dit geval zijn scheidingen uitgevoerd met behulp van een buffer isocratic met opgeloste ionisatie onder steady-state oplosmiddel omstandigheden voorkomende bij het gebruik van een conventionele schede vloeibare interface, waarmee voor seriële injecties van 10 of meer monsters binnen één Voer voor de snelle maar selectieve screening van verschillende soorten DoA en hun metabolieten14. De focus van deze studie is om te verder valideren MSI-CE-MS voor de directe analyse van authentieke urine monsters van een representatieve cohort van klinisch depressieve patiënten met behulp van een "Verdun-en-shoot"-methode die de noodzaak voor enzym hydrolyse15 vermijdt. Bovendien, de uitvoering van een Elektrokinetische spacer tussen seriële monster stekkers in MSI-CE-MS16 werd uitgevoerd naar verdere verbetering van de resolutie van de verschillende drugs isomeren/isobaren, achtergrond urine storingen, en/of Kruis-storingen bij het screenen van grote panels van DoA. De absolute kwantificering van DoA in urine exemplaren als met behulp van bijpassende Halfzwaar interne standaarden (d-IS) wordt aangetoond bij het gebruik van MSI-CE-MS. Deze aanpak ook vergemakkelijkt drug identificatie, evenals het afleiden van de positie van de juiste monster van scherm-positieven in vergelijking met een paneel van het mengsel van de drug met de aanbevolen bestandscontrole van de licht-donkerscheiding niveau die ook fungeert als een interne verwijzing/QC binnen het zelfde punt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7100 Capillary Electrophoresis System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G7100A</td>
			<td>CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G6230B</td>
			<td>HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE-ESI-MS Sprayer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G1603A</td>
			<td>CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G1310B</td>
			<td>Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>--</td>
			<td>Software used for control of CE-MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>--</td>
			<td>Software used for processing of CE-MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortix Capillary Cutter</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>5813-4620</td>
			<td>Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Window Maker</td>
			<td>Microsolv Inc.</td>
			<td>07200-S</td>
			<td>Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused-silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies Inc.</td>
			<td>TSP05375</td>
			<td>Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)</td>
			<td>Cerilliant Inc.</td>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput and comprehensive drug surveillance using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry

Nieuwe analytische methoden zijn dringend noodzakelijk om high-throughput, maar complete drug screening, gegeven een alarmerend opioïden en prescription drug crisis in de volksgezondheid. Conventionele urine drug tests, gebaseerd op een tweeledige immunoassay scherm gevolgd door een gaschromatografie-tandem massaspectrometrie (GC-MS/MS) of vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) methode zijn duur en gevoelig voor bias terwijl ze beperkt tot gerichte panelen van bekende drugs van misbruik (DoA). Hierin duidelijk naar voren komt een verbeterde methode voor drug surveillance waarmee voor de resolutie en de opsporing van een uitgevouwen paneel van DoA en hun metabolieten bij het gebruik van multisegment injectie-capillaire elektroforese-massaspectrometrie (MSI-CE-MS). Multiplexed scheidingen van tien monsters van de urine met een kwaliteitscontrole door CE (< 3 min/sample) in combinatie met full-scan data-acquisitie met behulp van een time-of-flight massaspectrometer (TOF-MS) onder positief ion modus detectie de identificatie maakt en kwantificering van DoA boven het niveau van de licht-donkerscheiding aanbevolen. Een uitstekende resolutie van de drug isomeren en isobaren, met inbegrip van storingen van de achtergrond, worden bereikt bij het gebruik van MSI-CE-MS met een Elektrokinetische spacer tussen monster segmenten, waar nauwkeurige massa/moleculaire formule samen met de comigration van een bijpassende Halfzwaar interne standaard en de opsporing van een of meer bio-getransformeerd metabolieten DoA identificatie te vergemakkelijken over een bredere detectie-venster. Bovendien kunnen urine monsters worden geanalyseerd rechtstreeks zonder enzym deconjugation voor de snelle screening zonder ingewikkelde monster workup. MSI-CE-MS in staat stelt het toezicht op een breed spectrum van DoA die nodig is voor het toezicht op behandeling van patiënten met een hoog risico, met inbegrip van de bevestiging van de naleving van de voorgeschreven geneesmiddel, onthullend illegale drug gebruik/vervanging en het evalueren van de optimale dosering regimes zoals vereist voor nieuwe vooruitgang in de geneeskunde van de precisie.

MSI-CE-MS in staat stelt de seriële injectie van tien of meer discrete monsters binnen een enkele run, die sterk doorvoer verbetert (< 3 min/sample) zonder ingewikkelde instrumentale wijzigingen, kolom-switching's of kostbare infrastructuur investeringen (figuur 1A). Een alternerende reeks hydrodynamische injecties van het monster en Elektrokinetische spacer van BGE wordt uitgevoerd binnen een ongewijzigde gesmolten siliciumdioxide capillair, waar zonale elektroforetische scheidingen van ionen in sterk zure elektrolyt (pH voordoen 1.8). solute ionisatie vindt ook plaats onder steady-state omstandigheden. In dit geval wordt een coaxiale schede vloeistof, met een massa kalibrant, gebruikt als een interface voor CE-MS onder het positieve ion modus opsporen met minimale ion onderdrukking of toebehoren effecten zoals gecontroleerd door de massale kalibrant ionen signaal. TOF vertegenwoordigt een krachtige en toch rendabele HRMS met een snelle data-acquisitie bij uitstek geschikt voor de nontargeted screening/drug surveillancetoepassingen bij het gebruik van MSI-CE-MS. Bijvoorbeeld, de indrukwekkende resolutie wordt bereikt voor verschillende isobaar/isomere DoA en metabolieten ervan, met inbegrip van structurele isomeren van drie opioïden structurele isomeren, namelijk norhydrocodone, hydromorfon en morfine (figuur 1B). In dit geval 30 opgelost pieken van 10 onafhankelijke steekproeven uit een mengsel van drugs worden gedetecteerd zonder monster "Carry-over". Een synthetische urine leeg/negatieve urine controle is ook opgenomen in de serie seriële injectie (monster standpunt #6). Ook zijn twee andere isobaar opioïden, namelijk 6-acetylmorphine (een metaboliet van inactieve heroïne) en naloxon (een opioïde receptor antagonist gebruikt voor de dringende behandeling van opioïden overdosis) volledig opgelost als 20 verschillende toppen met full-scan data acquisitie) Figuur 1 c). Twee amfetamine positionele isomeren zijn ook volledig opgelost in MSI-CE-MS om te onderscheiden van illegale methamphetaminemisbruik van het potentiële misbruik van phentermine, een voorgeschreven stimulerende middelen die wordt gebruikt als een eetlust suppressant voor gewichtsverlies.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig1.jpg"> Figuur 1: een reeks uitgepakte ion electropherograms (EIE) voor representatieve DoA isomeren/isobaren die door MSI-CE-MS worden verholpen door het analyseren van tien monsters en een leeg binnen een enkele run. (A) schematische van MSI-CE-MS die de configuratie van de seriële injectie gebruikt voor een 84-DoA panel in synthetische urine verbeeldt. Deze methode multiplexed scheiding wordt gebruikt als een wisselend aantal hydrodynamische injecties van 11 afzonderlijke monsters en leeg met een Elektrokinetische injectie van een buffer de zonale elektroforetische scheiding van ionen, gevolgd door de gegevens van een full-scan overname door TOF-MS met positieve ion modus detectie. (B) drie isobaar functionele groep opioïdengebruikers isomeren (m/z 286.1438), gescheiden door CE, bestaande uit 30 opgelost pieken van 10 discrete monster injecties, en norhydrocodone, hydromorfon, morfine. (C) twee isobaar opioïde drugs en hun metabolieten (m/z 328.1543), gescheiden door CE, bestaande uit 20 opgelost pieken van 10 discrete monster injecties, waaronder 6-acetylmorphine (heroïne metaboliet) en naloxon. (D) twee isobaar functiegroep amfetamine isomeren, gescheiden door CE, bestaande uit 20 opgelost pieken van 10 discrete monster injecties, met inbegrip van metamfetamine en phentermine. Negatieve urine controles/leeg ingevoerd bij de zesde positie van het monster in MSI-CE-MS had in alle gevallen te verwaarlozen bewijs van monster "Carry-over". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Naar screen DoA, de configuratie van een seriële injectie in MSI-CE-MS gebruikt een mengsel van 84-drug paneel op de aanbevolen screening concentratieniveaus van de licht-donkerscheiding (als de eerste positie van de injectie van alle runs) gevolgd door een gerandomiseerde analyse van 10 representatieve urine monsters van klinisch depressieve patiënten met een geschiedenis van het bekende recept. Bijvoorbeeld, een positieve screening testresultaten voor methadon (m/z 310.2165) van de patiënt #208 (figuur 2A) wordt afgeleid door een opsporing van een grote signaal piek (afkomstig van injectie #9) die comigrates met methadon-d3 met een laag massa fout (< 5 ppm). Geen andere signalen worden aangetroffen in andere urine monsters binnen hetzelfde uitgevoerd. Methadon concentratie 13 x de aanbevolen cut-off limiet overschrijdt bij het vergelijken van de verhouding tussen de gemeten ion reactie in de steekproef (injectie #9) met de verwijzing drug mengsel/QC (injectie #1) en gecorrigeerd door een viervoudige verdunningsfactor van urine. Dus, bevestigt dit resultaat van de patiënt naleving van methadon onderhoud therapie. Bewijs van nonprescribed amfetamine inname (figuur 2B) wordt weergegeven door verhoogde amfetamine niveaus (m/z 136.1121) die alleen bij één patiënt (patiënt #50, in de injectie #11) binnen de MSI-CE-MS run werd ontdekt. De gemeten concentratie iets overschreden de licht-donkerscheiding aanbevolen niveaus (1.3 x). Dit comigrates met amfetamine-d5 en had een lage massa fout met een top-ranked molecuulformule wedstrijd. Een positief testresultaat voor het antidepressivum venlafaxine (m/z 278.2115), een selectieve serotonine-Noradrenaline reuptake inhibitor, wordt ook aangetoond bij patiënt #281 (injectie #6). In dit geval de concentratie overschrijdt de licht-donkerscheiding aanbevolen niveaus (15 x), dit wordt aangeduid door zijn nauwkeurige massa - of molecuulformule-wedstrijd, samen met comigrating venlafaxine-d6 (figuur 2C). Het laatste criterium is niet voldaan voor een onbekende isobar die ook binnen de EIE trace, waarin wordt gewezen op de noodzaak tot voorzichtigheid wanneer een beroep uitsluitend op de nauwkeurige massa is gedetecteerd. Ook een definitieve detectie van voorgeschreven pregabaline, die is voorgeschreven voor de behandeling van neuropatische pijn, alsmede van gegeneraliseerde angst, is ook aangetoond voor patiënt #309, gebaseerd op de grove verhoogde concentratie (64 x) boven de aanbevolen licht-donkerscheiding niveaus (figuur 2D). Het is, echter niet gedetecteerd in de negen andere patiënt urine monsters geanalyseerd binnen hetzelfde uitgevoerd. Vergelijkbaar met de andere scherm-positieven, injectie #4, comigrates met pregabaline-d6, die is opgenomen in alle urine monsters geanalyseerd door MSI-CE-MS.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig2.jpg"> Figuur 2: een reeks uitgepakte ion electropherograms (EIE) voor representatieve scherm-positieve urine drug testresultaten van een cohort van 10 klinisch depressieve patiënten als bevestigd wanneer het gebruik van MSI-CE-MS, waarin een 84-drug panel op Aanbevolen licht-donkerscheiding niveau, als het eerste monster injectie standpunt dienen als interne verwijzing/QC geïnjecteerd. (A) EIE overlay overeenkomt met methadon-d3, die comigrates met methadon, benadrukken dat slechts één urine monster (injectie positie #9) methadon concentraties ver boven het niveau van de licht-donkerscheiding heeft verheven. (B) EIE overlay overeenkomt met amfetamine-d3, die comigrates met amfetamine, benadrukken dat slechts één urine monster (injectie positie #11) verhoogde concentraties boven het niveau van de licht-donkerscheiding. (C) EIE overlay overeenkomt met venlafaxine-d6, die comigrates met venlafaxine, benadrukken dat slechts één urine monster (injectie positie #6) verhoogde concentraties boven het niveau van de licht-donkerscheiding. (D) EIE overlay overeenkomt met pregabaline-d6, die comigrates met pregabaline, benadrukken dat slechts één voorbeeld van de urine (injectie positie #4) Grove verhoogde concentraties cut-off niveaus overschrijdt. Alle urine monsters werden geanalyseerd direct na een vijfvoudige verdunning in gedeïoniseerd water samen met de toevoeging van een overeenkomende d-IS (indien beschikbaar). Een scherm-positief resultaat in MSI-CE-MS komt overeen met een medicijn dat comigrates met d-ISs met een lage massa fout (< 5 ppm) en de juiste molecuulformule, waarvan de concentratie overschrijdt de licht-donkerscheiding die binnen de dezelfde uitvoeren als interne verwijzing/QC is geanalyseerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
De absolute kwantificering van DoA en hun metabolieten wordt ook bereikt door MSI-CE-MS gebaseerd op externe kalibratiekrommen, met behulp van referentie kalibrant standaarden voor DoA die snel worden verworven binnen een enkel punt. Bijvoorbeeld, de seriële verdunning van een 84-drug kalibrant mengsel samen met een bijpassende d-IS bij een vaste concentratie biedt een betrouwbare kwantitatieve analyse in complexe urine monsters. Dit compenseert voor de potentiële matrix-geïnduceerde ion onderdrukking of verbetering maar ook voor variaties in het geïnjecteerde volume in het capillair tussen de monsters. In gevallen wanneer een overeenkomende d-IS commercieel niet beschikbaar of kosten-verbiedend voor bepaalde DoA is, een surrogaat IS wordt gebruikt voor de normalisatie van de gegevens, zoals een d-IS van binnen dezelfde drug klasse of een synthetisch samengestelde niet gevonden in urine (F-Phe), zoals eerder 14. vertegenwoordiger EIEs en externe kalibratiekrommen voor Oxycodon zijn weergegeven in figuur 3A, B. en voor citalopram in Figuur 3 c, D. Deze zijn algemeen voorgeschreven tot pijnstillers en antidepressiva, respectievelijk met potentieel misbruik. Relatieve ion reactie ratio's hun matching d-IS worden gemeten. In dit geval een seriële injectie configuratie in MSI-CE-MS, bestaande uit vijf verschillende drug kalibranten, worden geanalyseerd in tweevoud binnen een enkele run samen met een synthetische urine leeg. Algemene, goede lineariteit (R2 > 0.990) over een 20-fold concentratie binnen het deelvenster 84-drug bereik was bereikt met voldoende gevoeligheid voor de detectie van de meerderheid van de DoA en hun metabolieten (d.w.z., kationische alkaloïden) 14. in alle gevallen, drug metabolieten worden gedetecteerd als hun geprotoneerd molecuulion [MH+] boven hun screening cut-off beperkt (> 50 ng/mL), met uitzondering van bepaalde zuur/neutraal drugs die hebben een slechte ionisatie-efficiëntie onder de positief ion modus, zoals cannabinoïden (bijvoorbeeldTHC-COOH), barbituraten (bijvoorbeeldsecobarbital) en carbamaten (bijvoorbeeldcarisoprodol).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig3.jpg"> Figuur 3: een reeks uitgepakte ion electropherograms (EIE) voor de kwantificering van de vertegenwoordiger DoA. Dit wordt gedaan door het genereren van externe kalibratiekrommen op basis van hun relatieve ion reactie verhouding met een een bijpassende d-IS over een 20-fold lineaire dynamische bereik. (A) dubbele injectie van een vijf-punts kalibratiecurve voor Oxycodon kalibranten samen met Oxycodon-d3 en een leeg. (B) externe kalibratiekromme voor Oxycodon, lineaire regressie om te ontlenen gevoeligheid (helling) en de lineariteit (R2), na met foutbalken vertegenwoordigen ±1σ (n = 4). (C) dubbele injectie van een vijf-punts kalibratiecurve voor citalopram kalibranten, samen met citalopram-d6 en een leeg. (D) externe kalibratiekromme voor citalopram, lineaire regressie om te ontlenen gevoeligheid (helling) en de lineariteit (R2), met fout na bars vertegenwoordigen ±1 SD (n = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry at JoVE.com

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor uitgebreide drug surveillance waarmee voor de betere resolutie en detectie van grote panelen van drugs van misbruik en hun metabolieten, met kwaliteitscontrole op basis van multisegment injectie-capillair elektroforese-massaspectrometrie.

High-throughput en uitgebreide Drug Surveillance met behulp van spectrometrie van de massa van het Multisegment injectie-capillaire elektroforese

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Huidige strategieën voor een urine drug screening zijn duur uit te voeren voor routine-analyse van steeds grotere panelen van drugs van misbruik zoals vereist voor werkplek testen, evenals therapeutische drug monitoring toepassingen. Bovendien, methoden op basis van amino testen zijn gevoelig voor bias en zijn uiteindelijk beperkt tot doelanalyse van bekende drug panelen. Het belangrijkste voordeel van onze methode, die wordt aangeduid als MSI-CE-MS, is dat het zorgt voor de snelle screening van een onbeperktd medicijnpaneel en hun metabolieten met hoge nauwkeurigheid en minimale sample workup.Er is dringend behoefte aan een hoge doorvoer en betaalbare screening methode om de resultaten van de patiënt te verbeteren door de naleving te bevestigen en het optimaliseren van drugsdosering regimes, terwijl de onthulling van illegale drugsgebruik. Dit multiplexed scheidingsplatform kan worden toegepast op een verscheidenheid van andere onderzoeksgebieden die verband houden met gerichte of niet-gerichte metabolietprofilering in complexe biologische monsters. Begin met het ontdooien van ontkende ochtendurinemonsters verzameld van patiënten met een bekende voorgeschreven medicijngeschiedenis voor min 80 graden Celsius opslag op ijs en het vortexen van de ontdooide monsters gedurende 30 seconden.Vervolgens sediment de monsters door centrifugatie en combineer drie 10 microliter aliquots van elk monster met 10 microliter van deuterated interne normen, vijf microliters van een 4-fluoro-L-fenylalanine en 3-chloor-L-tyrosine oplossing en 25 microliter van gedeïmiseerd water. Centrifugeren de mengsels vervolgens gedurende één minuut en breng 20 microliter van elk monster over in afzonderlijke polypropyleen flacons. Om de ongecoate gesmolten silica capillaire conditionering parameters, snijd een 135 centimeter lang, 50 micrometer binnendiameter, en 360 micrometer buitenste diameter capillaire uit een spoel.Gebruik een capillaire raammaker om ongeveer 7 millimeter polyamidecoating van beide uiteinden van elke capillaire te verwijderen. Installeer vervolgens de capillaire inlaten in de capillaire elektroforese, of CE-cartridge, door elke capillaire looping voor twee 360 graden bochten, waarbij ervoor wordt gezorgd dat ongeveer twee millimeter van de capillaire uitlaten uit de CE-spuitnaald uitsteken. Wanneer alle haarvaten zijn geïnstalleerd, laadt u de CE-cartridge voorzichtig in het CE-systeem en slaat u de CE-sproeier uit de ionenbron.Plaats de vloeibare chromatografie, of LC sproeier, in de ionenbron en selecteer flush in de software van het systeem om de capillaire conditionering in te stellen. Stel de duur van methanol, een molaire natriumhydroxide, gedeïmiseerd water en achtergrondelektrolyt flush in op 30 minuten per flush en plaats de isocratische pomp op stand-by tijdens de capillaire conditioneringsperiode. Reinig na de laatste flush de capillaire elektroforese massaspectrometer of CE-MS sproeier en de CE-elektrode met methanol doorweekte doekjes.Reinig de CE-MS-interface met een één-op-één isopropanol wateroplossing om eventuele resterende zoutafzettingen te verwijderen. Vervang de LC sproeier door de gereinigde CE-MS sproeier en een nieuw geconditioneerde capillair in de coaxiale schede vloeistof interface. Schakel vervolgens de isocratische pomp in en breng gedurende 15 minuten een spanning van 30 kilovolt aan om ervoor te zorgen dat een stabiel CE-stroomprofiel wordt bereikt voorafgaand aan de urineanalyse.Selecteer in de systeemsoftware preconditionering, stel de flush in op 600 seconden en geef een achtergrondelelektrolyt-bestandspositie op. Stel de injectie in om de monsters gedurende vijf seconden hydrodynamisch te injecteren op 100 millibar en om de achtergrondelelektrolyt-afstandsruimters gedurende 75 seconden elektrokinetisch te injecteren op 30 kilovolt. Stel de toegepaste spanning in op 30 kilovolt, de cartridgetemperatuur op 25 graden Celsius en de totale looptijd op 40 minuten.Breng vervolgens, volgens het tijdschema, een drukgradiënt van twee millibar per minuut toe van nul tot 40 minuten tijdens de scheiding. Wanneer de monstervername is voltooid, spoelt u de capillaire op 50 millibar druk met de achtergrondelektrolyten 's nachts terwijl de capillaire zich in de CE-sproeier in de ionenbron bevindt. Stel de tof-MS positieve ionendetectie in op een massa-ladingverhouding van 50 tot 1,700, met een gegevensverwervingssnelheid van 500 milliseconden per spectrum, en bevestig dat zowel het profiel als de centroid-gegevens worden opgeslagen in D-bestandsformaat.Stel de elektrospray ionisatie voorwaarden op capillaire en mondspanningen van 2000 volt elk, de vernevelmgas tot 10 pond per vierkante inch, en het drogen gas levering tot acht liter per minuut op 300 graden Celsius met een schede gasstroom van 3,5 liter per minuut op 195 graden Celsius tijdens de aankoop. Stel vervolgens de MS-spanningsinstellingen van de fragmenter, skimmer en octapool één radiofrequentie in op respectievelijk 120, 65 en 750 volt en stel de parameters voor instrumentcontrole en gegevensverwerving in op basis van het ontwerp van het experiment. Open voor data-analyse de multi-segment CE-MS-gegevens in de systeemsoftware.Stel onder chromatogrammen de extractiegegevens en de chromatogram- en massaspectrale gegevensindelingen in op de profielmodus. Selecteer onder smoothing de quadratische kubieke Savitzky-Golay en stel de functiebreedte in op 15 punten. Klik vervolgens op MS integreren en stel de integrator in op agile.Stel onder piekfilters het maximum aantal pieken in op 11. Klik onder de weergave op de lijst integratiepiek en selecteer piekaantal, retentietijd, piekgebied, piekhoogte en signaal-ruisverhouding. Sla vervolgens de parameters op onder een unieke methodenaam en pas de methode toe op het proces voor de interpretatie van elke gegevensset.In deze representatieve analyse van verschillende isobarische isomerische drugs van misbruik en hun metabolieten, 30 opgelost pieken van 10 onafhankelijke monsters van een geneesmiddel mengsel werden ontdekt zonder monster overdracht. Twee andere isobarische opioïden kunnen volledig worden opgelost als 20 verschillende pieken met de volledige scan gegevensverwerving. Ook twee amfetamine positionele isomeren werden volledig opgelost in deze multi-segment CE-MS analyse, om illegale methamfetamine misbruik te onderscheiden van het potentiële misbruik van phentermine, een voorgeschreven stimulerend middel dat wordt gebruikt als een eetlustremmer voor gewichtsverlies.In deze representatieve analyse van de drugscreening werd een positief screeningtestresultaat voor methadon afgeleid door de detectie van een grote signaalpiek die comigreert met de methadon-d3-piek met een lage massafout. Er werden geen andere signalen gedetecteerd in andere urinemonsters binnen dezelfde run en de gedetecteerde methadonconcentratie overschreed 13 keer de aanbevolen cutoff-limiet in vergelijking met de gemeten ionenresponsratio in het monster en gecorrigeerd door een viervoudige urineverdunningsfactor, wat bevestigt dat de patiënten zich aan de onderhoudstherapie voor methadon houden. Hier werd een seriële injectieconfiguratie in multi-segment CE-MS, bestaande uit vijf verschillende drug calibrants, geanalyseerd in tweevoud binnen een enkele run samen met de synthetische urine leeg.De drug metabolieten werden ontdekt als hun potenated moleculaire ionen boven hun screening cutoff grenzen. Na deze procedure kan een groot aantal polaire en ionische metabolieten in urine ook worden geanalyseerd door MSI CMS ter ondersteuning van op ontdekkingen gebaseerd metabolisch onderzoek. Bovendien kan uitgebreid toezicht worden gehouden op een breed scala aan exogene geneesmiddelen en hun metabolieten, waaronder niet-voorgeschreven medicijnen en illegale drugs die vatbaar zijn voor misbruik.Deze geoptimaliseerde methode kan ook worden gebruikt om routinematig andere drugs van misbruik te screenen. Dit kunnen cannabis of alcoholmetabolieten zijn en onze methode kan ook onderscheid maken tussen een synthetische of een valse urinematrix en een natuurlijk, echt, authentiek gedoneerd urinemonster. Vergeet niet om altijd voorzichtig te zijn bij het werken met biologische vloeistoffen.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Rapid High Throughput Amylose Bepaling in gevriesdroogde aardappelknol Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Verbeterde In-gel Reductive β-eliminatie voor Comprehensive O-gebonden en Sulfo-glycomics door massaspectrometrie

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

Analyse van vluchtige en oxidatie gevoelige verbindingen met behulp van een Cold Inlaat Systeem en Electron Impact Massaspectrometrie

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Deacetylering Testen om de wisselwerking tussen Sirtuins (SIRT2) en specifiek eiwit-substraten Ontrafel

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Rapid High-throughput Species Identificatie van Botanical Material gebruik van Direct Analysis in Real Time met hoge resolutie massaspectrometrie

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...