Name: high-throughput and comprehensive drug surveillance using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry
Uploaded: 2019-04-23T12:30:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry at JoVE.com

P.B.M. tient à souligner l’appui financier de Sciences naturelles et génie conseil de recherches du Canada, la Fondation canadienne pour l’Innovation, Génome Canada et l’Université McMaster. Les auteurs remercient Howard Lee Seroclinix Corporation et le Dr Marcus Kim d’Agilent Technologies pour leurs discussions perspicaces. En outre, les auteurs remercient Dr Zainab Samaan du département de psychiatrie et Sciences du comportement à l’Université McMaster et clinique des troubles de l’humeurs à l’hôpital Saint-Joseph pour l’accès aux échantillons anonymisés patient urine utilisées dans cette étude .

Les échantillons d’urine aveugle ont été gracieusement fournis par Dr Zainab Samaan de la humeur trouble clinique à l’hôpital St. Joseph (Hamilton, ON, Canada), dont l’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de recherche intégrée Hamilton.
1. les réactifs et Solutions préparation des échantillons
<ol><li>
Préparation de fond électrolyte
	<ol>
<li>Préparer 50 mL d’acide formique à 1 M toutes les deux semaines, fond électrolyte (BGE), pH 1.8, avec 15 % v/v d’acétonitrile comme un modificateur organique.</li>
		<li>Aliquote 1,9 mL de concentré acide formique stock (26,5 M) dans une fiole jaugée de 50 mL et ajouter 7,5 mL d’acétonitrile et 40,6 mL d’eau désionisée pour porter le volume total à 50 mL. Ensuite, laisser agir la solution pendant 15 minutes et le transférer dans un flacon stérilisé avec étanche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation liquide de gaine
	<ol>
<li>Préparation de 200 mL de gaine solution liquide toutes les semaines, contenant de l’acide formique 0,1 % en 60/40 (MeOH:H2O).</li>
		<li>Aliquote 200 µL d’acide formique (stock de 26,5 M) dans un flacon de 120 mL de MeOH et 80 mL de H2O faire gaine liquide et il dégazer pendant 15 min.</li>
		<li>Ensuite, ajoutez 10 µL de chacune des ions de référence suivants, purine et hexakis (2,2,3,3-tetrafluoropropoxy) phosphazine (HP-921), dans le liquide de gaine à fournir des signaux de massives constantes à m/z 121.05087 et m/z 922.00979, respectivement. Remarque : Les ions de référence permettant une correction massive en temps réel et surveillent également ion induite par la matrice de suppression ou mise en valeur des effets possibles pendant la séparation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation-étalon
	<ol>
<li>Préparer une solution étalon contenant un mélange de 84 médicaments panneau 3 x seuil de dépistage clinique niveau (L6)14 dans 1 mL de méthanol, en utilisant les normes de médicaments achetés d’un fournisseur de produits chimique. Préparer séparément un mélange de 48 satisfaisant à la norme (d-ISs) de drogues internes deutérés à une concentration 10 fois supérieure à la mélange de 84-drogue dans 1 mL de méthanol. En outre, préparer une solution contenant 200 µM de 4-fluoro -L-phénylalanine (Phe-F) et 3-chloro -L-tyrosine (Tyr-Cl) dans 1 mL de désionisée H2O.</li>
		<li>Effectuer une dilution au quintuple du mélange 84-médicaments mentionnés ci-dessus (20 µL) et les d 48-ISs (20 µL), ainsi que d’une dilution décuplée de 4-fluorophénylalanine (F-Phe, 10 µL) et 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 µL) dans une matrice d’urine synthétique certifié (40 µL) au total volume de 100 µL dans un tube à centrifuger 250 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de courbe de calibration externe
	<ol>
<li>Préparer les courbes d’étalonnage externe de cinq points (comme décrit ci-dessous) en quatre exemplaires (n = 4) sur une plage dynamique 20 fois en utilisant le mélange standard de 84-drogue et 48 de leurs correspondants d-station spatiale internationale effectuée à l’étape 1.3.1. Par exemple, pour faire une courbe d’étalonnage externe de cinq points, sorte de diluer le mélange de 84-drogue (L6, étape 1.3.1) à 2, 4, 10, 20 et 40 fois, considérant qu’il est nécessaire de préparer une dilution quintuple des correspondants d-ISs (20 µL) et une dilution décuplée de (4-F-Phe 10 µL) et Cl-Tyr (10 µL) comme c’est un autre dans une matrice d’urine synthétique pour faire un volume total de 100 µL. Dans les cas quand un d-IS correspondant n’est pas disponible pour un médicament précis, utilisation 4-F-Phe comme substitut est pour la normalisation des données. NOTE : Éviter l’inclusion d’autres d-ISs qui nuisent à la croix (isobare) avec autres DoA dans le panneau si ils ne sont pas entièrement résolus par la séparation de CE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de l’échantillon urinaire
	<ol>
<li>Décongeler les échantillons d’urine de matin anonymisés d’une cohorte représentative des dix patients cliniquement déprimés avec une histoire de drogue de prescription connus. Stocker les échantillons d’urine à-80 ° C après le prélèvement, jusqu'à ce qu’ils doivent être décongelés pour analyse. Remarque : Éviter de multiples cycles de gel-dégel d’urine ou un retard de stockage à température ambiante, à la suite de la collection en raison de leur effet sur la stabilité chimique de certains métabolites DoA et leurs conjugués.</li>
		<li>Vortex l’urine du matin anonymisés des échantillons pendant 30 s et, ensuite, les centrifuger pendant 1 min à 14 000 x g pendant la sédimentation. Après cela, aliquote de 10 µL de ce qui précède traitées urine, 10 µL de d-est et 5 µL de F-Phe/Cl-Tyr et 25 µL de désionisée H2O et vortexer pendant 1 min (Répétez ces étapes en trois exemplaires pour évaluer la précision technique). Transférer une quantité de 20 µL du mélange décrite ci-dessus dans un flacon en polypropylène pour analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. configuration du système CE-TOF-MS
<ol><li>Non couché capillaire de silice fondue paramètres de conditionnement
	<ol>
<li>Assurez-vous que toutes les normes, courbes d’étalonnage externe et des échantillons d’urine préparés dans les sections 1.3 et 1,5 sont séparés à l’aide d’un capillaire de polyimide recouvert silice tubulaire-ouvert non couché avec un diamètre intérieur de 50 μm, un diamètre extérieur de 360 µm et un longueur capillaire totale de 135 cm. Remarque : Un outil de coupe de diamant est utilisé pour assurer les capillaires cohérentes qui sont davantage inspectés pour assurer une coupe lisse et ras.</li>
		<li>Déposer environ 7 mm de l’enduit de polyimide de distales capillaires extrémités, à l’aide d’un fabricant de fenêtre capillaire pour réduire le report de l’échantillon et pour prévenir les éventuel polyimide gonflement au contact de solvants organiques.</li>
		<li>Assurez vous de dépasser d’environ 2 mm de la sortie du capillaire de l’aiguille de pulvérisateur CE et installer l’entrée du capillaire dans la cartouche de CE en bouclant les deux tours de 360 °. Puis, soigneusement installer la cartouche CE a l’et placez le pulvérisateur CE hors de la source d’ions lorsque le capillaire de conditionnement. NOTE : Couper la sortie capillaire systématiquement car il est crucial d’assurer une electrospray stable actuelle lorsqu’elle est associée à la SP. Deux pulvérisateurs différentes ont été utilisées dans ce travail : un pulvérisateur CE a été utilisé pour l’analyse de l’échantillon, et un pulvérisateur de LC a été utilisé pour l’étalonnage de masse.</li>
		<li>Veillez à exécuter le capillaire de conditionnement avec le pulvérisateur de CE ne pas placé dans la source d’ions. Mettre le pulvérisateur LC dans la source d’ions. Remarque : Ceci permet d’étalonnage des masses tout en évitant toute contamination de l’interface liquide de gaine coaxial qui est ensuite couplé à la TOF-MS.</li>
		<li>Condition de nouveaux capillaires en sélectionnant la fonction flush (940 mbar) sur les logiciels du fournisseur utilisé pour contrôler l’instrument et de définir la durée de la chasse d’eau en 30 min chacun pour quatre différents solvants dans l’ordre suivant : méthanol, 1 NaOH M, eau désionisée eau et BGE. Prendre soin de mettre la pompe isocratique à veille au cours de la période de conditionnement capillaire.</li>
		<li>Essuyer le pulvérisateur CE-MS avec une lingette de tissu trempée dans MeOH/H2O pour éliminer les dépôts de sels résiduels.</li>
		<li>Effectuer l’entretien préventif quotidien du système CE-MS avant d’analyser les échantillons. Utiliser du méthanol à essuyer des électrodes CE (à l’entrée) mais utilisez un isopropanol et mélange (50/50) pour nettoyer l’interface CE-MS, ce qui est important pour éviter l’accumulation de sel et de limiter le potentiel report d’échantillon d’eau.</li>
		<li>Retirez le pulvérisateur LC hors de la source d’ions et positionnez le pulvérisateur nettoyé avec un capillaire nouvellement conditionné dans l’interface liquide de gaine coaxiale pour CE-MS.</li>
		<li>Allumer la pompe isocratique et appliquer une tension de 30 kV pendant 15 min à faire en sorte qu’un profil stable CE est atteint avant l’analyse d’urine.</li>
	</ol></li>
	<li>Conditions d’injection et de la séparation à l’aide de CE
	<ol>
<li>Ouvrez le logiciel de fournisseur utilisé pour contrôler l’instrument pour définir les paramètres de CE et sélectionnez l' étape de préconditionnement. La valeur rincer fonction 600 s et spécifiez une position de flacon BGE. Remarque : Un refroidisseur d’eau externe devrez peut-être être connectés aux réseaux CE que le manque de plateau échantillon refroidissement caractéristiques, tel que cela est nécessaire pour éviter l’évaporation de l’échantillon lors de l’analyse de grands lots d’échantillons de volume restreint.</li>
		<li>Définissez la fonction injection hydrodynamique injecter les échantillons à 100 mbar pour 5 s et injecter electrokinetically entretoises BGE à 30 kV pour 75 s. Remarque : Ce processus est répété avec chaque injection de l’échantillon (d’une position de différents flacon) suivie d’une entretoise BGE (à partir de la même position de flacon) qui s’effectue automatiquement dans un programme de méthode sur le logiciel pour un total de 11 échantillons discrets analysés dans la même parcours lorsque vous utilisez un format MSI. Analyser des échantillons d’urine 10 dans un ordre aléatoire après un mélange de drogue de 84-panneau à la seuil de dépistage niveau est injecté sous la première position de l’échantillon pour chaque exécution MSI-CE-MS.</li>
		<li>Régler tension appliquée à 30 kV, la température de la cartouche soit 25 ° C et la duree totale à 40 min. à l’aide du calendrier, appliquer un gradient de pression de 2 mbar/min de 0 min à 40 min pendant la séparation. NOTE : Une pression gradient est appliquée pendant la séparation afin de permettre l’élution des drogues qui migrent lentement, qui comprend certaines benzodiazépines faiblement, base et neutre/acide (par exemple, l’acétaminophène, barbituriques). Toutefois, DoA plus élémentaires et leurs métabolites migrent comme cations dans 25 min, y compris les amphétamines, opiacés et autres classes d’alcaloïdes.</li>
		<li>Après que l’acquisition de l’échantillon est terminée, veillez à rincer le tube capillaire à basse pression (50 mbar) avec BGE jusqu’au lendemain. Sinon, rincez le capillaire pour 600 s à pression élevée (900 mbar) avec de l’eau, puis pour 600 s avec de l’air et le stocker dans un porte-pulvérisateur jusqu'à la prochaine utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Pompe isocratique et gaine liquide
	<ol>
<li>Utiliser une pompe isocratique d’infini et d’un dégazeur infini pour fournir le liquide de gaine (60/40 MeOH:H2O à l’acide formique 0,1 % v/v) à un taux de 10 µL/min pour le pulvérisateur CE-MS.</li>
	</ol></li>
	<li>Paramètres de TOF-MS
	<ol>
<li>Veiller à ce qu’une TOF-MS, avec une source d’ionisation electrospray coaxial de gaine-liquide et gaz azote chauffée, est équipé d’une unité de CE.</li>
		<li>Exploiter la TOF-MS sous détection des ions positifs qui s’étend sur une masse de m/z 50-1 700, avec une fréquence d’acquisition de données de 500 ms/spectre. S’assurer que le profil et le centre de gravité données sont stockées dans un format de fichier « .d ».</li>
		<li>Définir les conditions d’ionisation par électronébulisation à : tension Vcap et buse à 2 000 V, le gaz nébuliseur à 10 lb/po2 et le séchage de gaz livré à 8 L/min à 300 ° C, avec un débit de gaz de gaine de 3.5 L/min à 195 ° C. En outre, de définir les paramètres de tension de MS de la fragmentor, écumoire et Oct1 RF à 120, 65 et 750 V, respectivement. NOTE : Tension Vcap et buse, mais aussi de gaz nébuliseur était éteints pendant la séquence d’injection de série échantillon utilisée dans CE-MSI-MS, mais l’electrospray a été programmé pour être refoulé sur 1 min après le début de la séparation par électrophorèse pour empêcher le courant erreurs dues à des effets à aspirer.</li>
		<li>Effectuer l’instrument contrôle et acquisition de données à l’aide du logiciel du fournisseur (Table des matières).</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse des données
	<ol>
<li>Analyser les données de CE-MSI-MS à l’aide de logiciels du fournisseur, y compris le traitement, les données de lissage et de l’intégration des électrophérogrammes ion extrait (EIEs) pour DoA représentant et de leurs métabolites.</li>
		<li>Ouvrez le logiciel et définir les paramètres suivants.<ol>
<li>Sous chromatogrammes, sélectionnez le format d’extraction de donnéeset format de données spectrales chromatogramme et masse en mode profil .</li>
			<li>Sélectionnez Quadratique/Cubic Savitzky Golay sous la fonction de lissage et la largeur de la fonction en 15 points.</li>
			<li>Puis, cliquez sur Intégrer (MS), définissez l’intégrateur d’être Agileet sélectionnez le nombre maximal de limite de pics avec le plus grand 11 sous les filtres de pointe.</li>
			<li>Cliquez sur affichage, cliquez sur intégration pic listeet sélectionnez le nombre maximum, temps de rétention (RT), surface de pic, hauteur du picet rapport signal sur bruit (SNR).</li>
			<li>Enregistrez ces paramètres sous un nom de méthode unique. Appliquer cette méthode au processus et interpréter chaque ensemble de données. NOTE : Un tableau récapitulatif avec nombre maximal, la RT, la surface du pic et hauteur et le SNR affiche sur le côté droit. Effectuer la normalisation de données pour RT mesurée et la surface du pic intégré pour chaque DoA pour un ou l’autre correspondant d-est ou (si non disponible) à F-Phe pour améliorer la précision analytique.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. analyse des échantillons d’Urine et des courbes d’étalonnage externe
<ol><li>
Configurations d’injection série différents utilisés dans MSI-CE-MS
	<ol>
<li>Pour la première configuration d’injection série échantillon, utilisée pour démontrer la résolution isomère/isobar de médicament (Figure 1 a), faire en sorte que cinq répété les injections sont effectuées sur un mélange de normes de drogue 84 avec d-est et 4-F-Phe/Cl-Tyr, suivie d’une sixième injection, qui est un échantillon en blanc dans l’urine synthétique, et cinq injections supplémentaires du mélange médicamenteux standard.</li>
		<li>Pour la deuxième série exemple de configuration injection, servi à justifier la détection de DoA dans les échantillons d’urine individuels de patients avec une prescription connue (Figure 2 a), faire en sorte que la première prise d’échantillon est un mélange de 84 médicaments mélange standard à un 1 x seuil de dépistage (contrôle positif) suivie d’une injection aléatoire de 10 échantillons d’urine diluée provenant de patients : 293 #, #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, 183 # et #50.</li>
		<li>Pour la troisième série exemple de configuration injection, utilisé pour illustrer l’acquisition des courbes d’étalonnage externe à un terme unique, ce que les solutions de degré pour DoA soient préparées sur une plage de dynamique linéaire 20 fois correspondant à 0,25 x, 0,5 x, 1 x, 2.5 x, et 5 fois le niveau de concentration seuil, avec correspondance d-IS et F-Phe/Cl-Tyr tel quel supplémentaire dans une matrice d’urine synthétique (n = 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Products - Vital Statistics Rapid Release - Provisional Drug Overdose Data Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/drug-overdose-data.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/drug-overdose-data.htm</a> (2018)</li><li>Olfson, M., King, M., Schoenbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Young+People+With+Antipsychotic+Medications+in+the+United+States.">Treatment of Young People With Antipsychotic Medications in the United States.</a> JAMA Psychiatry. 72, 867-874 (2015).</li><li>Moeller, K. E., Kissack, J. C., Atayee, R. S., Lee, K. 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Les auteurs divulguer un brevet américain (PCT/CA2014/050454) sur CE-MSI-MS comme une projection multiplexée "workflow" plate-forme et les données pour analyse chimique.

Des séparations chromatographiques conventionnelles s’appuient généralement sur une injection de l’échantillon unique par course, qui est ensuite suivie d’une élution gradient pour résoudre les mélanges complexes de drogue et reconditionnement de la colonne. Ces exigences fondamentalement limitent de débit de l’échantillon et le devoir même lorsqu’elle est à l’aide de programmes de commutation colonne optimales. Dans ce contexte, analyse urine volume élevé du médicament pour le lieu de travail, toxicologie ou des applications de surveillance thérapeutiques par GC-MS/MS et, de plus en plus, LC-MS/MS sont donc effectués en parallèle mais utilisé préférentiellement comme un deuxième-rangée ou de confirmation quand tester nécessaire (p. ex., contexte juridique ou médical). Cela est dû à l’investissements beaucoup plus élevés et coûts opérationnels, ainsi que des complications avec l’analyse des données lors de la comparaison des échantillons analysés sur plusieurs plateformes à joué un rôle important au sein d’un laboratoire accrédité. En conséquence, les immuno-essais restent encore la principale méthode de dépistage des drogues courantes en dépit d’être sujettes à des faux positifs et de faux-négatifs parmi plusieurs classes de médicaments, avec un accès limité aux réactifs d’anticorps pour les nouvelles drogues. Des études antérieures ont démontré que les séparations multiplexées basées sur MSI-CE-MS offrent une solution simple pour améliorer le débit de l’échantillon jusqu'à un ordre de grandeur. De plus, cette approche permet la conception de flux de données nouvelles pour découverte de biomarker d’avec fidélité élevée des données basée sur l’application de la correction de commandes efficace et contrôle de la qualité12,13,14. Toutefois, l’introduction de 10 ou plus séries hydrodynamiques injections chez MSI-CE-MS raccourcit la longueur capillaire utile nécessaire pour maintenir les séparations de haute efficacité, qui peuvent compromettre la sélectivité lorsqu’on analyse DoA et leurs métabolites dans urine humaine.
Ici, nous avons introduit une injection électrocinétique de la BGE après chaque injection de l’échantillon hydrodynamiques, telles que la séparation prend avantage de la longueur capillaire complet (120 cm), améliorant ainsi la résolution du médicament important isobares/isomères lors de l’utilisation balayage complet d’acquisition de données par TOF-MS (Figure 1 a). Par rapport à un récent rapport14, meilleure résolution est réalisée pour plusieurs importants isobare/isomères DoA et leurs métabolites, ce qui est essentiel lors de dépistage pour les panneaux de drogues. Par exemple, la résolution de plusieurs isomères de l’important groupe structurels et fonctionnels a été réalisée, y compris trois analogues opioïdes drogues et de métabolites (Figure 1 b), deux isobares opioïdes non apparentés (Figure 1) et deux de méthamphétamine isomères de position (Figure 1). Dans tous les cas, report d’échantillon de série injection de solutions calibrant différents dans une même course n’est pas significatif, comme l’a confirmé par un contrôle d’urine négative/blanc. En outre, une résolution améliorée est également réalisée plusieurs croix-interférences impliquant certains d-ISs avec isobares drogues au sein de la Commission, notamment la cotinine-d3 et 3, 4-méthylènedioxyamphétamine (MDA), EDDP-d3 et l’imipramine, norfentanyl-d5 et kétamine, codéine-d6 et sertraline et cocaïne-d3 et du zolpidem. Ce résultat est étendu aux autres interférences isobariques dans le panneau de la drogue qui ont été mieux réglées dans la présente étude (p. ex., noroxycodone/oxymorphone, normeperidine/méthylphénidate), ainsi que des interférences urinaire majeure de fond (par exemple , source fragmenter les ions de la créatinine avec amphétamine)14. En effet, accès à deux paramètres orthogonaux pour satisfaire l’identification présumée d’un DoA spécifique est essentiel à la réduction des faux positifs en raison des perturbations isobares, nommément précises masse combinées avec comigration avec d-ISs. En outre, la détection d’un ou plusieurs métabolites biotransformée de la molécule mère dans le même échantillon, tels que les drogues glucuronide hydroxylés, déméthylés ou intact conjugate(s), apporte encore plus de confiance envers l’identification du médicament lors de l’expansion de la fenêtre pour la détection.
Le niveau de seuil recommandé pour le dépistage de drogue d’urine varie considérablement pour les différentes classes de DoA (allant de 50 à 1 000 ng/mL) en fonction de leur pharmacocinétique, la toxicité et des perturbations de fond, afin de réduire le biais de la méthode fondée sur les directives de le Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA)14. Le potentiel de CE-MSI-MS détecter et identifier les différentes classes de DoA directement dans les urines avec prétraitement de l’échantillon minimal a été appliqué à un groupe de patients cliniquement déprimés avec une fiche de prescription connus. L’identification définitive de méthadone (prescrit), stimulants (Dilaudid/illicite), venlafaxine (prescrit) et prégabaline (prescrit) dans les échantillons d’urine diluée, mais nonhydrolyzed, a été démontrée lors de l’utilisation de CE-MSI-MS. Ceci a été basé sur une comparaison directe d’une drogue détectée dans une position d’injection spécifique par rapport au mélange 84-médicament introduit dans la première position de l’échantillon à la recommandée niveau de coupure qui sert une référence/QC interne et le contrôle positif de dépistage (Figure 2). Aussi, quantification absolue de drogue est réalisable à l’aide des courbes d’étalonnage externe (Figure 3) basés sur le taux de réponse d’ion mesurée pour un médicament par rapport à son d-est. À la différence des séparations chromatographiques plus, il n’y a aucun effet de deutérium, un impact sur les différences de temps de migration entre a et d-est et son médicament n puisqu’ils possèdent des mobilités électrophorétiques analogues en solution libre dans CE. En effet, le comportement de migration du DoA est fidèlement modélisé dans CE, basé sur leur structure chimique propriétés physico-chimiques fondamentaux, à savoir le volume moléculaire et charge effective (pKun)14. Étant donné que de nombreux médicaments subissent aussi important métabolisme secondaire avant l’excrétion dans l’urine (par exemple, la morphine glucuronide), seuil de dépistage niveaux nécessitent d’ajustement que leurs concentrations mesurées sont plus faibles que prévu par rapport aux méthodes qui utilisent par hydrolyse enzymatique pour la détection de drogues total. Un avantage majeur du dépistage des drogues urine « diluer-and-shoot », outre la réduction des coûts/temps, manipulation des échantillons et un biais potentiel ou des variations de lot en raison de l’hydrolyse enzymatique incomplète, est que les présumés cas de dépistées positives sont confirmées par le détection d’un ou plusieurs métabolites de drogue liés au sein d’un même échantillon. Cela fournit également des aperçus plus profondes de drogue exigences de dosage pharmacocinétique et optimum pour chaque patient tout en améliorant la détection des métaboliseurs « rapides » ou de médicaments prescrits/illicite ayant une demi-vie courte. En outre, comigration avec un correspondant d-fois deux fonctions importantes de drogue fiable de dépistage quand utilise CE-MSI-MS — nommément, il identifie la position d’injection échantillon exacte (i.e., patient n°) tout en corrigeant également des différences dans l’ion volumes de réponses/injection de meilleure précision et d’exactitude.
Travaux futurs a pour but de développer des outils logiciels personnalisés afin de faciliter le traitement automatisé des données des séparations multiplexés couplé à SGRH au besoin grand volume urine dépistage des drogues avec QC/QA. Validation rigoureuse du MSI-CE-MS pour le criblage à large spectre de DoA est également examinée parmi une plus grande cohorte de patients à haut risque afin d’évaluer objectivement le médicament prescrit l’adhérence et le potentiel abus/substitution pouvant compromettre l’efficacité du traitement, sécurité du patient et/ou évaluation/diagnostic psychiatrique. Une analyse complémentaire des classes acides/anionique du DoA et de leurs métabolites se fera par MSI-CE-MS dans des conditions alcalines avec détection mode ion négatif tel que requis pour le bilan complet des cannabinoïdes naturelles ou synthétiques. Ceci est important étant donné les implications de santé publique imminente de la légalisation de la marijuana récréative partout au Canada et plusieurs États américains. Un avantage majeur de l’acquisition de données de l’analyse complète par TOF-MS est que l’analyse rétrospective des échantillons peut être effectuée même lorsque les prélèvements d’urine ne sont plus disponibles pour les tests de suivi, alors que les autres mode de vie ou les expositions alimentaires peuvent être évaluées afin de mieux comprendre des réactions différentes aux traitements antirétroviraux. En résumé, une méthode de surveillance de drogue rapide mais précis de MSI-CE-MS offre des avantages significatifs aux classiques Immunoessais ciblées, ainsi qu’infusion directe/ambient méthodes d’ionisation-MS/MS qui sont sujettes aux interférences/biais lors de la résolution panneaux élargis du DoA et de leurs métabolites dans les échantillons biologiques complexes à des surcoûts.

Une augmentation alarmante dans l’utilisation abusive d’et la dépendance aux opioïdes pour le traitement de la douleur chronique représente une menace croissante pour la santé publique, avec plus 70 000 décès par surdose de drogue aux Etats-Unis estimé en 20171. De même, divers autres médicaments psychotropes sont également largement prescrit aux enfants et aux jeunes adultes pour le traitement de l’anxiété, la dépression et de problèmes de santé mentale2. En conséquence, les méthodes, largement développés pour le milieu de travail et de la toxicologie médico-légale, le dépistage des drogues urine sont d’importance vitale pour le suivi thérapeutique des médicaments prescrits qui sont sujettes à la tolérance et la dépendance de3,4. Ceci est nécessaire pour assurer le respect, efficacité thérapeutique optimale et sécurité des patients, tout en révélant la substitution potentielle, y compris les abus de drogues illicites ou Dilaudid. Actuellement, des tests de drogue urine pour DoA s’appuient sur une approche en deux volets, consistant en un immunodosage concurrentiel initial écran via des dispositifs de point-of-care ou analyseurs de laboratoire, suivie d’un test de confirmation avec une plus grande précision basée sur GC-MS/MS et, de plus en plus, LC-MS/MS5. Toutefois, les immuno-essais sont sujettes à la partialité, comme réactifs d’anticorps lient non spécifique aux différentes classes de médicaments pour générer un résultat présumé dépistées positives, qui empêche une identification fiable et la quantification de certaines drogues ou médicaments complexes 6de mélanges. Dans ce contexte, des tests de drogue urine plus précises sont nécessaires d’urgence étant donné le coût exorbitant des écrans de polytoxicomanie complet,7 y compris les drogues et produits d’urine synthétique qui échappent classiques ciblées des essais.
Haute efficacité des séparations en conjonction avec le MS à haute résolution (SGRH) à l’aide des analyseurs de masse TOF ou orbitrap valant ont été proposées comme une stratégie non ciblée pour la surveillance des médicaments à l’ère de la polypharmacie et expansion des panneaux de DoA8,9 . Cependant, conventionnelles LC séparations sont lent (> 15 min) due aux fois élution longue pour la résolution de chimiquement différentes classes de DoA et leurs métabolites à l’aide de programmes de gradient d’élution, qui limite le débit de l’échantillon pour le dépistage des drogues courantes. Alternativement, analyse directe méthodes basées sur la désorption d’ionisation (DESI)10 et la désorption thermique diode laser (LDTD) permettent des drogues plus rapide de dépistage sans séparation11. Cependant, ces méthodes d’ionisation ambiante sont sujettes aux interférences isobariques/isomères lors de l’analyse des échantillons d’urine complexes, ce qui nécessite des tests de confirmation indépendante.
Notre laboratoire a récemment développé une plateforme de séparation multiplexé pour augmenter le débit de l’échantillon tout en respectant la résolution et des données d’une haute efficacité de séparation basée sur MSI-CE-MS12. Flux de production de nouvelles données peut être conçus dans CE-MSI-MS pour le métabolite non ciblée profilage (c.-à-d., métabolomique) d’échantillons biologiques volume restreint, tandis que les contrôles de qualité (QC) permettent la correction de lot comme requis pour la population à grande échelle études,13. Dans ce cas, séparations sont effectuées au moyen d’un tampon isocratique avec ionisation solute se produisant sous régime stationnaire solvant lorsque vous utilisez une interface liquide gaine classique, qui permet pour les injections séries d’échantillons de 10 ou plus au sein d’un même courir pour le dépistage rapid et sélectif des divers types de DoA et leurs métabolites14. L’objectif de cette étude est de valider CE-MSI-MS pour l’analyse directe des échantillons d’urine authentique d’une cohorte représentative des patients cliniquement déprimés en utilisant une méthode de « diluer-and-shoot » qui évite la nécessité d’une enzyme hydrolyse15. En outre, la mise en œuvre d’une entretoise électrocinétique entre prises série échantillon dans CE-MSI-MS16 a été effectué à encore améliorer la résolution des différents isomères de drogue/isobares, formation des perturbations urinaires, et/ou Croix-interférences lors de grands panneaux de DoA de dépistage. La quantification absolue de DoA dans les échantillons d’urine lorsqu’à l’aide de correspondance deutéré étalons internes (d-est) est démontrée lors de l’utilisation de CE-MSI-MS. Cette approche facilite également l’identification du médicament, en plus de déduire la position de l’échantillon correct des cas dépistées positives par rapport à un mélange de panneau de drogue à la recommandée niveau de coupure qui fonctionne aussi comme une référence/QC interne au sein de dépistage le même parcours.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7100 Capillary Electrophoresis System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G7100A</td>
			<td>CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G6230B</td>
			<td>HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE-ESI-MS Sprayer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G1603A</td>
			<td>CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G1310B</td>
			<td>Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>--</td>
			<td>Software used for control of CE-MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>--</td>
			<td>Software used for processing of CE-MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortix Capillary Cutter</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>5813-4620</td>
			<td>Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Window Maker</td>
			<td>Microsolv Inc.</td>
			<td>07200-S</td>
			<td>Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused-silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies Inc.</td>
			<td>TSP05375</td>
			<td>Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)</td>
			<td>Cerilliant Inc.</td>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput and comprehensive drug surveillance using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry

Nouvelles méthodes d’analyse sont nécessaires d’urgence pour permettre le dépistage des drogues haut-débit, mais complet, donné une crise de drogues opioïdes et prescription alarmante en santé publique. Dépistage des drogues urine conventionnel basé sur un écran de test immunologique dualiste suivie d’une chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS/MS) ou la méthode de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS) sont coûteux et sujettes à un biais tout en étant limitée aux panneaux ciblée de médicaments connus d’abus (DoA). Ici, nous présentons une méthode améliorée pour la surveillance des médicaments qui permet la résolution et la détection d’un groupe élargi de DoA et leurs métabolites lorsque vous utilisez multisegment capillaires injection-électrophorèse-spectrométrie de masse (CE-MSI-MS). Multiplexés séparations de dix échantillons d’urine avec un contrôle de la qualité de CE (< 3 min par échantillon) en conjonction avec l’acquisition de données de l’analyse complète à l’aide d’un spectromètre de masse (TOF-MS) en vertu de la détection de mode ion positif permet d’identifier time-of-flight et quantification des DoA au-dessus niveau seuil recommandé. Une excellente résolution des isomères de la drogue et les isobares, y compris les interférences de l’arrière-plan, sont obtenus lorsque vous utilisez CE-MSI-MS avec une entretoise électrocinétique entre les segments de l’échantillon, le cas précis formule masse et moléculaire ainsi que de la comigration d’un jumelage deutéré étalon interne et la détection d’un ou plusieurs métabolites bio-transformés facilitent l’identification de DoA sur une fenêtre de détection plus large. En outre, les échantillons d’urine peuvent être analysés directement sans déconjugaison enzyme pour le dépistage rapid sans bilan compliqué d’échantillon. MSI-CE-MS permet la surveillance d’un large spectre de DoA qui est requis pour le suivi des traitements des patients à haut risque, y compris confirmant le respect des médicaments prescrits, révélant l’utilisation de drogues illicites/substitution et l’évaluation des régimes de dosage optimal comme l’exige pour les nouveaux progrès de la médecine de précision.

MSI-CE-MS permet l’injection série d’échantillons discrets dix ou plus dans un même essai, ce qui améliore considérablement le débit (< 3 min/échantillon) sans modifications instrumentales compliquées, programmes de commutation de colonne ou une infrastructure coûteuse investissements (Figure 1 a). Une série alternée d’injection hydrodynamique de l’échantillon et l’entretoise électrocinétique de BGE est exécutée dans un capillaire de silice fondue non modifié, où zonale séparation électrophorétique des ions se produire dans des conditions d’électrolyte fortement acides (pH 1.8). ionisation de soluté se produit également dans des conditions d’équilibre. Dans ce cas un liquide de gaine coaxial, avec un degré de masse, est utilisé comme une interface pour CE-MS dans la détection de mode ions positifs avec effets de suppression ou de mise en valeur ion minimale telle que mesurée par le signal d’ions de masse calibrant. TOF représente un SGRH robuste encore rentable avec une acquisition rapide des données parfaitement adaptée pour les applications de surveillance de dépistage non ciblées et les médicaments lors de l’utilisation de CE-MSI-MS. Par exemple, résolution impressionnante est obtenue pour divers isobare/isomères DoA et leurs métabolites, y compris les isomères structuraux des trois isomères structuraux opioïdes, nommément norhydrocodone, hydromorphone et la morphine (Figure 1 b). Dans ce cas, 30 résolu pics de 10 échantillons indépendants d’un mélange de drogue sont détectées sans report de l’échantillon. Un contrôle d’urine blanc/négatif urine synthétique est aussi inclus dans la série série injection (position #6 d’échantillonnage). En outre, deux autres opioïdes isobares, à savoir la 6-acétylmorphine (un métabolite inactif héroïne) et la naloxone (un antagoniste des récepteurs opioïdes utilisé pour le traitement d’urgence d’opioid overdose) sont entièrement résolus comme 20 pics distincts avec (acquisition de données de balayage complet La figure 1). De même, les deux isomères de position de stimulants sont entièrement résolus dans CE-MSI-MS à distinguer l’abus illicite de métamfétamine l’abus potentiel de la phentermine, un stimulant prescrit qui est utilisé comme coupe-faim pour perdre du poids.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig1.jpg"> Figure 1 : une série d’extraits d’ion électrophérogrammes (EIE) pour les isomères/les isobares DoA représentatives qui sont résolus par CE-MSI-MS en analysant dix échantillons et un blanc au sein d’un même essai. (A) schéma de MSI-CE-MS qui représente la configuration de série injection utilisée pour un groupe de 84-DoA dans l’urine synthétique. Cette méthode de séparation multiplexé utilise une série alternée d’injections hydrodynamiques de 11 échantillons discrets et blanc avec une injection électrocinétique d’un tampon pour lancer la séparation électrophorétique zonale des ions, suivie d’un balayage complet des données acquisition par TOF-MS avec détection mode ions positifs. (B) trois isobare groupe fonctionnel opioïdes isomères (m/z 286.1438), séparés par CE, comprenant 30 pics résolus de 10 injections échantillon discret, y compris les norhydrocodone, hydromorphone et la morphine. (C) deux isobares drogues opioïdes et leurs métabolites (m/z 328.1543), séparés par CE, comprenant 20 pics résolus de 10 injections d’échantillon discret, y compris 6-acétylmorphine (métabolite de l’héroïne) et la naloxone. (D), deux isomères de l’amphétamine d’isobare groupe fonctionnel, séparés par CE, comprenant 20 pics résolus de 10 injections d’échantillon discret, y compris la méthamphétamine et phentermine. Dans tous les cas, urine négative contrôles/flans a présenté à la sixième position de l’échantillon dans CE-MSI-MS avait preuve négligeable du report de l’échantillon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Pour écran DoA, une configuration série injection dans CE-MSI-MS a utilisé un mélange de 84 médicaments panneau à recommandé niveau concentration seuil de dépistage (comme la première position d’injection pour toutes les courses) suivie d’une analyse aléatoire d’urine représentant 10 échantillons de patients cliniquement déprimés ayant des antécédents connus de prescription. Par exemple, un dépistage positif test résultat pour la méthadone (m/z 310.2165) patient #208 (Figure 2 a) est déduit par une détection d’un pic de signal important (provenant de l’injection #9) qui migre avec la méthadone-d3 avec un faible erreur de masse (< 5 ppm). Aucun autre signal n’est détectés dans n’importe quel autres échantillons d’urine dans le même essai. La méthadone concentration dépasse 13 x la limite recommandée lorsqu’on compare son ratio de réponse ion mesurée dans l’échantillon (injection #9) avec la référence drogue mélange/QC (injection #1) et corrigé par un facteur de dilution urinaire par quatre. Ainsi, ce résultat confirme l’adhésion du patient au traitement d’entretien à la méthadone. Preuve de l’apport de stimulants Dilaudid (Figure 2 b) est illustré par des niveaux élevés de stimulants (m/z 136.1121) qui a été détecté seulement chez un patient (patient #50, en injection #11) dans la course de MSI-CE-MS. La concentration mesurée a légèrement dépassé le niveau de seuil recommandée (1,3 x). Il migre avec amphétamine-d5 et avait une faible erreur massive avec un match de classement de formule moléculaire. Un résultat positif pour l’antidépresseurs venlafaxine (m/z 278.2115), un inhibiteur de recapture sélectifs de la sérotonine-norépinéphrine, témoigne au patient #281 (injection #6). Dans ce cas, la concentration dépasse le niveau de seuil recommandée (15 x), cela est identifié par son exacte masse - ou formule moléculaire-match, ainsi que du poisson venlafaxine-d6 (Figure 2). Ce dernier critère n’est pas rempli pour une isobare inconnue qui est également détectée dans la trace de l’EIE, qui met en évidence la nécessité d’une mise en garde lorsque s’appuyant uniquement sur sa masse exacte. Aussi, une détection définitive de la prégabaline prescrite, ce qui est prescrit pour le traitement de la douleur neuropathique, ainsi que d’anxiété généralisée, est également démontrée pour patient #309, basée sur sa concentration exagérément élevée (64 x) ci-dessus recommandé niveau de seuil (Figure 2D). Il est, cependant, pas détectée dans les neuf autres les échantillons d’urine de patients analysés dans la même course. Comme dans les autres cas de dépistées positives, injection #4, migre avec la prégabaline-d6, qui est inclus dans tous les échantillons d’urine analysés par MSI-CE-MS.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig2.jpg"> Figure 2 : une série d’extraits ion électrophérogrammes (EIE) pour les résultats des tests drogue représentant urine dépistées positives d’une cohorte de 10 patients cliniquement déprimés comme confirmé lorsque l’utilisation de MSI-CE-MS, qui comprend un panneau de 84-drogue au recommandée seuil de concentration, injecté sous la première position d’injection échantillon servant de référence interne/QC. (A), EIE de recouvrement correspondant à la méthadone-d3, qui migre à la méthadone, mettant en évidence cet échantillon d’urine qu’une seule (injection position #9) trouve de fortes teneurs de méthadone qui dépassent le seuil de concentration. (B), EIE recouvrement correspondant aux amphétamines-d3, qui migre avec amphétamine, mettant en évidence cet échantillon d’urine qu’une seule (injection position #11) a élevé des concentrations au-dessus de niveau seuil. (C) EIE de recouvrement correspondant à la venlafaxine-d6, qui migre avec la venlafaxine, mettant en évidence cet échantillon d’urine qu’une seule (injection position #6) trouve de fortes teneurs au-dessus niveau seuil. (D), EIE de recouvrement correspondant à la prégabaline-d6, qui migre avec la prégabaline, mettant en évidence ce qu’un échantillon d’urine (injection position #4) a exagérément élevé des concentrations excédant les niveaux de seuil. Tous les échantillons d’urine ont été analysés directement après une quintuple dilution dans l’eau désionisée ainsi que l’ajout d’un correspondant d-(lorsque disponible). Un résultat dépistées positives dans CE-MSI-MS correspond à un médicament qui migre avec d-ISs avec une erreur de masse faible (< 5 ppm) et la formule moléculaire est correcte, dont la concentration est supérieure au seuil d’analyse au sein d’une même série comme référence interne/QC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
La quantification absolue du DoA et de leurs métabolites est également réalisée par MSI-CE-MS basé sur les courbes de calibration externe, en utilisant des étalons calibrant pour DoA qui sont acquis rapidement au sein d’un même essai. Par exemple, la dilution en série d’un mélange de 84 médicaments calibrant avec un correspondant d-est à une concentration fixe fournit une analyse quantitative fiable dans les échantillons d’urine complexes. Cela compense de potentiel suppression induite par la matrice ion ou d’amélioration, mais aussi des variations dans le volume d’injection dans le capillaire entre les échantillons. Dans le cas lorsqu’un correspondant d-IS est commercialement indisponible ou prohibitif pour certains DoA, un substitut est est utilisé pour la normalisation des données, comme un d-IS au sein de la même classe de médicaments ou une urine introuvable dans composé synthétique (F-Phe), tel que démontré précédemment 14. représentant EIEs et courbes d’étalonnage externe pour l’oxycodone sont indiquées dans la Figure 3 a, B. et pour le citalopram dans la Figure 3, D. Ceux-ci sont largement prescrits analgésiques et antidépresseurs, respectivement, avec le risque d’abus. Relative réponse rapports ioniques à leur correspondance d-est sont mesurés. Dans ce cas, une configuration de série injection dans MSI-CE-MS, comprenant cinq médicaments différents calibrants, sont analysés en double exemplaire au sein d’un même essai avec une urine synthétique blanc. Dans l’ensemble, bonne linéarité (R2 > 0,990) au-delà d’une concentration 20 fois portée a été obtenue avec suffisamment de sensibilité pour la détection de la majorité des DoA et leurs métabolites (c.-à-d., alcaloïdes cationiques) dans le panneau de 84-médicaments 14. dans tous les cas, leurs métabolites sont détectés comme limite leur ion moléculaire protoné [MH+] au-dessus de leur seuil de dépistage (> 50 ng/mL), à l’exception de certains médicaments acides/neutre qui ont un rendement médiocre d’ionisation en vertu de la mode d’ions positifs, tels que les cannabinoïdes (par exemple, THC-COOH), barbituriques (p. ex., sécobarbital) et carbamates (p. ex., carisoprodol).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig3.jpg"> Figure 3 : une série d’extraits d’ion électrophérogrammes (EIE) pour la quantification de la DoA représentant. Cela se fait en produisant des courbes d’étalonnage externe basées sur leur ratio de réponse relative ion avec un un correspondant d-est sur une plage dynamique linéaire 20 fois. (A) en double injection d’une courbe de cinq points d’étalonnage pour l’oxycodone calibrants avec l’oxycodone-d3 et un blanc. Courbe d’étalonnage externe (B) pour l’oxycodone, suite à la régression linéaire pour calculer la sensibilité (pente) et la linéarité (R2), avec des barres d’erreur représentant ±1σ (n = 4). (C) injection d’une courbe de cinq points d’étalonnage pour calibrants citalopram, citalopram-d6 ainsi qu’un espace vide en double. Courbe d’étalonnage externe (D) pour citalopram, suite à la régression linéaire pour calculer la sensibilité (pente) et la linéarité (R2), avec l’erreur barres représentant ±1 SD (n = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Nous décrivons ici une méthode de haut-débit pour la surveillance des médicaments complète qui permet la résolution améliorée et la détection de grands panneaux de drogues d’abus et de leurs métabolites, avec contrôle de la qualité basé sur l’injection multisegment-capillaire spectrométrie de masse à l’électrophorèse.

Surveillance des médicaments haut débit et complet à l’aide de la spectrométrie de masse de l’électrophorèse capillaire-Injection Multisegment

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Les stratégies actuelles pour un dépistage des drogues urinaires sont coûteuses à effectuer pour l’analyse systématique de groupes de plus en plus importants de drogues d’abus au besoin pour les tests sur le lieu de travail, ainsi que pour les applications thérapeutiques de surveillance des médicaments. En outre, les méthodes basées sur des analyses d’acides aminés sont sujettes à des biais et sont finalement limitées à l’analyse cible des panneaux de médicaments connus. Le principal avantage de notre méthode, appelée MSI-CE-MS, est qu’elle permet le dépistage rapide d’un panel de médicaments illimité et de leurs métabolites avec une grande précision et une accumulation minimale d’échantillons.Il est urgent d’avoir une méthode de dépistage à haut débit et abordable pour améliorer les résultats pour les patients en confirmant l’observance et en optimisant les régimes de dosage des drogues, tout en révélant la consommation de drogues illicites. Cette plate-forme de séparation multiplexe peut être appliquée à une variété d’autres domaines de recherche liés au profilage ciblé ou non ciblé des métabolites dans des échantillons biologiques complexes. Commencez par décongeler des échantillons d’urine du matin désidentés prélevés auprès de patients ayant des antécédents connus de médicaments d’ordonnance pour un stockage de moins 80 degrés Celsius sur la glace et en vortexant les échantillons décongelés pendant 30 secondes.Ensuite, sédimentez les échantillons par centrifugation et combinez trois aliquots de 10 microlitres de chaque échantillon avec 10 microlitres de normes internes deuté, cinq microlitres d’une solution 4-fluoro-L-phénylalanine et 3-chloro-L-tyrosine et 25 microlitres d’eau déionisée. Ensuite, centrifugez les mélanges pendant une minute et transférez 20 microlitres de chaque échantillon dans des flacons individuels de polypropylène. Pour définir les paramètres de conditionnement capillaires en silice fondue non encoated, coupez un diamètre intérieur de 135 centimètres de long, 50 micromètres et un capillaire de diamètre externe de 360 micromètres provenant d’une bobine.Utilisez un fabricant de fenêtres capillaires pour enlever environ 7 millimètres de revêtement en polyamide des deux extrémités de chaque capillaire. Ensuite, installez les entrées capillaires dans l’électrophoresis capillaire, ou cartouche CE, en boucle chaque capillaire pendant deux virages à 360 degrés, en prenant soin de dépasser environ deux millimètres des prises capillaires de l’aiguille du pulvérisateur CE. Lorsque tous les capillaires ont été installés, chargez soigneusement la cartouche CE dans le système CE et rangez le pulvérisateur CE hors de la source irion.Placez la chromatographie liquide, ou pulvérisateur LC, dans la source iréographique et sélectionnez la chasse d’eau dans le logiciel du système pour configurer le conditionnement capillaire. Réglez la durée du méthanol, d’un hydroxyde de sodium molaire, de l’eau déionisée et de la chasse d’eau d’électrolyte de fond à 30 minutes par chasse d’eau et placez la pompe isocratique en veille pendant la période de conditionnement capillaire. Après la dernière chasse d’eau, nettoyez le spectromètre de masse de l’électrophoresis capillaire, ou pulvérisateur CE-MS, et l’électrode CE avec des lingettes imbibées de méthanol.Nettoyez l’interface CE-MS avec une solution d’eau isopropanole un à une pour éliminer les dépôts de sel résiduels. Remplacez le pulvérisateur LC par le pulvérisateur CE-MS nettoyé et un capillaire nouvellement conditionné dans l’interface liquide de gaine coaxiale. Ensuite, allumez la pompe isocratique et appliquez une tension de 30 kilovolts pendant 15 minutes pour vous assurer qu’un profil de courant CE stable est atteint avant l’analyse d’urine.Dans le logiciel système, sélectionnez le préconditionnement, réglez la couleur à 600 secondes et spécifiez une position de fichier d’électrolyte de fond. Réglez l’injection pour injecter hydrodynamiquement les échantillons à 100 millibars pendant cinq secondes et injecter électrocinétiquement les espaceurs électrolytiques de fond à 30 kilovolts pendant 75 secondes. Réglez la tension appliquée à 30 kilovolts, la température de la cartouche à 25 degrés Celsius, et le temps de fonctionnement total à 40 minutes.Ensuite, à l’aide de l’horaire, appliquer un gradient de pression de deux millibars par minute de zéro à 40 minutes pendant la séparation. Lorsque l’acquisition de l’échantillon est terminée, rincer le capillaire à 50 millibars de pression avec les électrolytes de fond pendant la nuit pendant que le capillaire est dans le pulvérisateur CE dans la source iration. Définissez la détection d’ions positifs TOF-MS pour couvrir un rapport masse-charge de 50 pour 1 700, avec un taux d’acquisition de données de 500 millisecondes par spectre, et confirmez que le profil et les données centroïdes sont stockés au format de fichier D.Réglez les conditions d’ionisation de l’électrospray à des tensions capillaires et à la buse de 2000 volts chacune, le gaz nébuliseur à 10 livres par pouce carré, et la livraison de gaz de séchage à huit litres par minute à 300 degrés Celsius avec un flux de gaz de gaine de 3,5 litres par minute à 195 degrés Celsius lors de l’acquisition. Réglez ensuite les paramètres de tension MS du fragmenteur, de l’écumoire et de l’octapole d’une fréquence radio à 120, 65 et 750 volts, respectivement, et définissez les paramètres de contrôle des instruments et d’acquisition de données selon la conception de l’expérience. Pour l’analyse des données, ouvrez les données CE-MS multi-segments dans le logiciel système.Sous chromatogrammes, définissez les données d’extraction et les formats de données chromatogrammes et spectrales de masse en mode profil. Sous lissage, sélectionnez savitzky-golay cubique quadratique et réglez la largeur de la fonction à 15 points. Cliquez ensuite sur Intégrer MS et réglez l’intégrateur à agile.Sous les filtres de pointe, réglez le nombre maximum de pics à 11. En vue, cliquez sur la liste de pointe de l’intégration et sélectionnez le nombre de pointe, le temps de rétention, la zone de pointe, la hauteur de pointe et le rapport signal/bruit. Enregistrez ensuite les paramètres sous un nom de méthode unique et appliquez la méthode au processus d’interprétation de chaque ensemble de données.Dans cette analyse représentative de divers médicaments isoméniques isobitaux d’abus et de leurs métabolites, 30 pics résolus de 10 échantillons indépendants d’un mélange de drogue ont été détectés sans report d’échantillon. Deux autres opioïdes isobariques pourraient être entièrement résolus comme 20 pics distincts avec l’acquisition complète de données d’analyse. De même, deux isomères positionnels d’amphétamine ont été entièrement résolus dans cette analyse multise segmentée de CE-MS, pour distinguer l’abus illicite de méthamphétamine de l’abus potentiel de phentermine, un stimulant prescrit qui est employé comme coupe-faim pour la perte de poids.Dans cette analyse représentative du dépistage des médicaments, un résultat positif au test de dépistage de la méthadone a été déduit par la détection d’un pic de signal important co-migrant avec le pic de méthadone-d3 avec une erreur de faible masse. Aucun autre signal n’a été détecté dans d’autres échantillons d’urine au cours de la même course et la concentration détectée de méthadone a dépassé 13 fois la limite de coupure recommandée par rapport à son rapport de réponse ion mesurée dans l’échantillon et corrigée par un facteur de dilution de l’urine quatre fois, confirmant l’adhérence des patients à la thérapie d’entretien à la méthadone. Ici, une configuration d’injection en série dans le CE-MS multi-segment, comprenant cinq étalons différents de drogue, a été analysée en double dans un seul run avec l’urine synthétique vide.Les métabolites de drogue ont été détectés comme leurs ions moléculaires potéifiés au-dessus de leurs limites de coupure de criblage. Après cette procédure, un grand nombre de métabolites polaires et ioniques dans l’urine peuvent également être analysés par MSI CMS à l’appui de la recherche métabolique basée sur la découverte. En outre, une surveillance complète d’un large éventail de médicaments exogènes et de leurs métabolites peut être réalisée, y compris les médicaments non prescrits et les drogues illicites sujettes à l’abus.Cette méthode optimisée peut également être utilisée pour filtrer régulièrement d’autres drogues d’abus. Il peut s’agir de métabolites de cannabis ou d’alcool et notre méthode peut également différencier entre une matrice d’urine synthétique ou fausse et un échantillon d’urine naturel, réel, authentiquement donné ainsi. N’oubliez pas de toujours faire preuve de prudence lorsque vous travaillez avec des fluides biologiques.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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