Name: high-throughput and comprehensive drug surveillance using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry
Uploaded: 2019-04-23T12:30:00
Duration: 10 min 17 s
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P.B.M. vuole riconoscere finanziamento da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada, la Fondazione canadese per l'innovazione e McMaster University in Canada di genoma. Gli autori ringraziano Howard Lee Seroclinix Corporation e Dr. Marcus Kim da Agilent Technologies per le loro discussioni penetranti. Inoltre, gli autori riconoscono Dr. Zainab Samaan dal dipartimento di psichiatria e scienze comportamentali presso la McMaster University e la clinica di disordine di umore presso Ospedale San Giuseppe per l'accesso per i campioni di urina di pazienti compararli utilizzati in questo studio .

Campioni di urina cieco sono state gentilmente concesse da Dr. Zainab Samaan dalla clinica di disordine di umore all'ospedale di St. Joseph (Hamilton, ON, Canada), cui studio è stato approvato dal comitato di etica Hamilton integrata ricerca.
1. reagenti e preparazione di soluzioni del campione
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Preparazione dell'elettrolito di sfondo
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<li>Preparare 50 mL di acido formico per la elettrolita (BGE) sfondo bisettimanale, 1 M, pH 1.8, con 15% v/v acetonitrile come modificatore biologico.</li>
		<li>Aliquotare 1,9 mL di concentrato acido formico stock (26,5 M) in un matraccio tarato da 50 mL e aggiungere 7,5 mL di acetonitrile e 40,6 mL di acqua deionizzata per portare il volume totale di 50 mL. Sottoporre ad ultrasuoni soluzione per 15 minuti, quindi trasferirlo in un flacone sterilizzato con a tenuta ermetica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Guaina liquida preparazione
	<ol>
<li>Preparare 200 mL di guaina liquida soluzione settimanale, composto da acido formico 0.1% a 60: 40 (MeOH:H2O).</li>
		<li>Aliquotare e 200 µ l di acido formico (26,5 M stock) in una bottiglia contenente 120 mL di MeOH e 80 mL di H2O per rendere liquido del fodero e degassare esso per 15 min.</li>
		<li>Successivamente, aggiungere 10 µ l di ciascuno dei seguenti ioni di riferimento, purina e hexoctaedri (2,2,3,3-tetrafluoropropoxy) phosphazine (HP-921), nel liquido guaina per fornire segnali di massa costanti a m/z 121.05087 e m/z 922.00979, rispettivamente. Nota: Tali ioni di riferimento consentono per correzione di massa in tempo reale e monitorano anche per i potenziali effetti di soppressione o il potenziamento di ione indotta da matrice durante la separazione.</li>
	</ol>
</li>
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Preparazione standard
	<ol>
<li>Preparare una soluzione standard contenente una miscela di 84-droga pannello ai 3 x lo screening clinico cut-off livello (L6)14 in 1 mL di metanolo, utilizzando gli standard di droga acquistati da un fornitore chimico. Preparare a parte una miscela di 48 corrispondenza standard interni deuterati droga (d-ISs) a una 10 volte più alta concentrazione che la miscela di 84-droga in 1 mL di metanolo. Inoltre, preparare una soluzione contenente 200 µM di 4-fluoro -L-fenilalanina (F-Phe) e 3-chloro -L-tirosina (Cl-Tyr) in 1 mL di deionizzata H2O.</li>
		<li>Eseguire una diluizione quintuplo della suddetta miscela 84-droga (20 µ l) e 48 d-ISs (20 µ l), così come una diluizione dieci volte di 4-fluorophenylalanine (F-Phe, 10 µ l) e 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 µ l) in una matrice di urina sintetica certificata (40 µ l) per un totale volume di 100 µ l in una provetta da centrifuga 250 µ l.</li>
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</li>
	<li>
Preparazione di curva di calibrazione esterna
	<ol>
<li>Preparare le curve di calibrazione esterna di cinque-punto (come descritto di seguito) in quadruplice copia (n = 4) su una gamma dinamica 20 volte usando la miscela standard di 84-droga e 48 di loro corrispondenti d-ISs fatta al punto 1.3.1. Ad esempio, per fare una curva di calibrazione esterna cinque punti, assicurarsi di diluire la miscela 84-droga (L6, passo 1.3.1) a 2-, 4-, 10-, 20-e volta 40, considerando che è necessario preparare una diluizione quintuplo di corrispondenza d-ISs (20 µ l) e una diluizione dieci volte di (4-F-Phe 10 µ l) e Cl-Tyr (10 µ l) come un ulteriore è in una matrice di urina sintetica per fare un volume totale di 100 µ l. Nei casi quando un corrispondente d-IS non è disponibile per un farmaco specifico, uso 4-F-Phe come surrogato è per la normalizzazione dei dati. Nota: Evitare l'inclusione di ulteriori d-ISs che interferiscono Croce (isobarica) con altri DoA all'interno del pannello, se essi non sono completamente risolto tramite la separazione di CE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del campione di urina
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<li>Scongelare i campioni di urina di compararli mattina da un gruppo rappresentativo di dieci pazienti clinicamente depressi con una storia di droga di prescrizione noto. Conservare i campioni di urina a-80 ° C dopo la raccolta fino a quando essi devono essere scongelati per l'analisi. Nota: Evitare di più cicli di gelo-disgelo di urina o un deposito in ritardo a temperatura ambiente dopo la raccolta per il loro effetto sulla stabilità chimica di determinati metaboliti DoA e loro coniugati.</li>
		<li>Vortice le urine del mattino compararli campioni per 30 s e, poi, li Centrifugare per 1 min a 14.000 x g per sedimentazione. Dopo di che, aliquota 10 µ l di suddetti trattati urina, 10 µ l di d-è e 5 µ l di F-Phe/Cl-Tyr e 25 µ l di H2O deionizzata e vortexare per 1 min (ripetere questi passaggi in triplice copia per valutare la precisione tecnica). Trasferire un'aliquota di 20 µ l della miscela sopra ad un flacone in polipropilene per l'analisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. installazione del sistema CE-TOF-MS
<ol><li>Non patinata capillare di silice fusa condizionata parametri
	<ol>
<li>Assicurarsi che tutte le norme, curve di calibrazione esterna e preparati nelle sezioni 1.3-1.5 i campioni di urina sono separati tramite un capillare di polyimide-rivestito non rivestito silice fusa Apri-tubolare con un diametro interno di 50 μm, diametro esterno di 360 µm e un totale lunghezza capillare di 135 cm. Nota: Una fresa di diamante viene utilizzata per garantire la coerenti capillari che vengono ulteriormente controllati per garantire un taglio a filo e liscio.</li>
		<li>Rimuovere circa 7 mm del rivestimento polyimide da entrambe le distale estremità capillare, utilizzando una macchina per finestra capillare per ridurre provette e prevenire potenziali polyimide gonfiore a contatto con solventi organici.</li>
		<li>Assicurarsi che sporga di circa 2 mm la presa capillare fuori l'ago di spruzzatore CE e installare l'aspirazione capillare nella cartuccia CE conformando a due giri di 360 °. Quindi, con attenzione installare la cartuccia CE nella CE e posto lo spruzzatore CE fuori la sorgente di ioni quando condizionata del capillare. Nota: Tagliare la presa capillare costantemente come è fondamentale per garantire una stabile electrospray corrente quando agganciato al MS. Due spruzzatori differenti sono stati usati in questo lavoro: uno spruzzatore CE è stato utilizzato per l'analisi dei campioni, e uno spruzzatore di LC è stato utilizzato per la calibrazione di massa.</li>
		<li>Assicurarsi di eseguire il capillare condizionata con lo spruzzatore CE non inserito nella sorgente di ioni. Mettere lo spruzzatore di LC nella sorgente di ioni. Nota: In questo modo per la calibrazione di massa, evitando qualsiasi contaminazione dell'interfaccia coassiale guaina liquida che è successivamente accoppiato a TOF-MS.</li>
		<li>Condizione di nuovi capillari selezionando la funzione flush (940 mbar) il software del fornitore utilizzato per controllare lo strumento e impostare la durata dello sciacquone in 30 min ciascuno per quattro diversi solventi nel seguente ordine: metanolo, 1 M NaOH, deionizzata acqua e BGE. Assicuratevi di mettere la pompa isocratica in standby durante il periodo di capillare condizionata.</li>
		<li>Strofinare lo spruzzatore CE-MS con un tessuto imbevuto di MeOH/H2O per rimuovere eventuali depositi di sale residui.</li>
		<li>Eseguire la manutenzione preventiva quotidiana del sistema CE-MS prima di analizzare i campioni. Usavamo il metanolo per pulire giù dell'elettrodo CE (in ingresso) ma un isopropanolo e acqua (50: 50) miscela per pulire l'interfaccia CE-MS, che è importante per evitare l'accumulo di sale e limitare potenziali provette.</li>
		<li>Togliere lo spruzzatore di LC fuori la sorgente di ioni e posizionare lo spruzzatore pulito con un capillare appena condizionato nell'interfaccia coassiale guaina liquida per CE-MS.</li>
		<li>Accendere la pompa isocratica e applicare una tensione di 30 kV per 15 min per assicurarsi che un profilo corrente stabile di CE sia raggiunto prima l'analisi delle urine.</li>
	</ol></li>
	<li>Condizioni di separazione e iniezione usando CE
	<ol>
<li>Aprire il software del fornitore utilizzato per controllare lo strumento per impostare i parametri di CE e selezionare il passo di precondizionamento. Impostare la funzione a filo su 600 s e specificare una posizione di fiala BGE. Nota: Un refrigeratore di acqua esterno potrebbe essere necessario essere collegati a sistemi di CE che non dispongono di vassoio di campione raffreddamento caratteristiche, come questo è necessario per evitare l'evaporazione del campione durante l'analisi di grandi lotti di campioni di volume limitato.</li>
		<li>Impostare la funzione iniezione idrodinamicamente iniettare i campioni a 100 mbar per 5 s ed electrokinetically iniettare distanziali BGE a 30 kV per 75 s. Nota: Questo processo viene ripetuto con ogni iniezione del campione (da una posizione diversa flaconcino) seguita da un distanziatore BGE (dalla stessa posizione flaconcino) che viene eseguito automaticamente all'interno di un programma di metodo sul software per un totale di 11 campioni discreti analizzati nella stessa seduta quando si utilizza un formato MSI. Analisi di 10 campioni di urina in ordine casuale dopo una miscela di 84-pannello droga presso il cut-off di screening livello viene iniettato come la prima posizione di campione per ogni esecuzione di MSI-CE-MS.</li>
		<li>Impostare la tensione applicata a 30 kV, la temperatura di cartuccia da 25 ° C e il tempo di esecuzione totale di essere 40 min utilizzando il calendario, applicare un gradiente di pressione di 2 mbar/min da 0 min a 40 min durante la separazione. Nota: Una pressione gradiente viene applicata durante la separazione per consentire l'eluizione di farmaci lento-migrazione, che comprende alcune benzodiazepine debolmente, base e neutro/acido (ad es., paracetamolo, barbiturici). Tuttavia, DoA più elementari e dei loro metaboliti migrano come cationi entro 25 min, tra cui le anfetamine, oppiacei e altre classi di alcaloidi.</li>
		<li>Una volta completata l'acquisizione del campione, assicuratevi di risciacquare il capillare a bassa pressione (50 mbar) con BGE fino al giorno successivo. In caso contrario, sciacquare il capillare per 600 s ad alta pressione (900 mbar) con acqua e poi per 600 s con aria e riporlo in un supporto di spruzzatore fino al prossimo utilizzo.</li>
	</ol></li>
	<li>Pompa isocratica e guaina liquido
	<ol>
<li>Utilizzare Isocratic di Infinity, una pompa ed un degasatore di Infinity per fornire il liquido di guaina (60: 40 MeOH:H2O con l'acido formico 0.1% v/v) ad un tasso di 10 µ l/min per lo spruzzatore CE-MS.</li>
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	<li>Impostazioni di TOF-MS
	<ol>
<li>Garantire che un TOF-MS, con una sorgente di ioni coassiale guaina-liquido electrospray e gas azoto riscaldata, è dotato di un'unità di CE.</li>
		<li>Operare il TOF-MS sotto rilevazione di ioni positivi che attraversava una massa di m/z 50-1.700, con una velocità di acquisizione dati di 500 ms/spettro. Assicurarsi che il profilo e il baricentro sono memorizzati in un formato di file "/etc/rc".</li>
		<li>Impostare le condizioni di ionizzazione electrospray di essere: Vcap e ugello tensione a 2.000 V, il gas di nebulizzatore a 10 psi e l'essiccazione gas consegnato a 8 L/min a 300 ° C, con un flusso di gas di guaina di 3,5 L/min a 195 ° C. Inoltre, impostare le impostazioni di tensione MS del fragmentor, skimmer e Oct1 RF a 120, 65 e 750 V, rispettivamente. Nota: Tensione Vcap e ugello, così come nebulizzatore gas erano spento durante la sequenza di iniezione del campione seriale utilizzata nel MSI-CE-MS, ma l'electrospray è stato programmato per essere riattivata 1 min dopo l'inizio della separazione elettroforetica per evitare correnti errori dovuti a effetti di aspirazione.</li>
		<li>Eseguire l'acquisizione di dati e controllo dello strumento utilizzando il software del fornitore (Tabella materiali).</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dei dati
	<ol>
<li>Analizzare i dati di MSI-CE-MS utilizzando il software del fornitore, compresa l'elaborazione, dati smoothing e l'integrazione di ioni estratti elettroferogrammi (EIEs) per rappresentante DoA e loro metaboliti.</li>
		<li>Aprire il software e impostare i seguenti parametri.<ol>
<li>Sotto cromatogrammi, selezionare il formato di estrazione datie formattare dati spettrali cromatogramma e massa alla modalità di profilo .</li>
			<li>Selezionare Quadratica/Cubic Savitzky Golay sotto la funzione di smussatura e larghezza di funzione a 15 punti.</li>
			<li>Quindi, fare clic su Integrare (MS), impostare l'integratore di essere Agilee selezionare il numero massimo di limite di picchi per il più grande 11 sotto filtri di picco.</li>
			<li>Fare clic su Visualizza, fare clic su integrazione picco elencoe selezionare il numero massimo, tempo di ritenzione (RT), area di picco, altezza del piccoe rapporto segnale-rumore (SNR).</li>
			<li>Salvare questi parametri sotto un nome di metodo univoco. Applicare questo metodo al processo e interpretare ogni set di dati. Nota: Una tabella riassuntiva con numero di picco, la RT, l'area dei picchi e altezza e il SNR viene visualizzato sul lato destro. Eseguire la normalizzazione dei dati per RT misurato e area del picco integrato per ogni DoA per un abbinamento d-è o (se non disponibile) per F-Phe per migliorare la precisione analitica.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. analisi dei campioni di urina e curve di calibrazione esterna
<ol><li>
Configurazioni di diversi serial iniezione usati in MSI-CE-MS
	<ol>
<li>Per la prima configurazione di iniezione del campione seriale, utilizzata per illustrare la droga isomero/isobar risoluzione (Figura 1A), assicurarsi che cinque ripetute iniezioni vengono eseguite su una miscela di 84 standard di droga con d-è e 4-F-Phe/Cl-Tyr, seguita da un sesto iniezione, che è un campione in bianco in urina sintetica, e cinque ulteriori iniezioni della miscela farmacologica standard.</li>
		<li>Per la configurazione di iniezione di esempio seriale seconda, usata per dimostrare il rilevamento di DoA in campioni di urina individuali da pazienti con prescrizione medica conosciuta (Figura 2A), assicurarsi che la prima presa di campione è una miscela di miscela standard 84-droga a un 1 x livello di cut-off lo screening (controllo positivo) seguita da un'iniezione randomizzata di 10 campioni di urina diluita da pazienti: #293, #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, 183 # e #50.</li>
		<li>Per la terza configurazione di iniezione seriale esempio, usata per illustrare l'acquisizione delle curve di calibrazione esterna in un'unica seduta, garantire che soluzioni di calibratore per DoA sono preparati su una gamma dinamica lineare 20 volte corrispondenti a 0.25 x, 0.5 x, 1x, 2.5 x, e livelli di concentrazione di cut-off, insieme a d-IS e F-Phe/Cl-Tyr corrispondenti così come ulteriore sono in una matrice di urina sintetica: 5x (n = 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Products - Vital Statistics Rapid Release - Provisional Drug Overdose Data Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/drug-overdose-data.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/drug-overdose-data.htm</a> (2018)</li><li>Olfson, M., King, M., Schoenbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Young+People+With+Antipsychotic+Medications+in+the+United+States.">Treatment of Young People With Antipsychotic Medications in the United States.</a> JAMA Psychiatry. 72, 867-874 (2015).</li><li>Moeller, K. E., Kissack, J. C., Atayee, R. S., Lee, K. 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Gli autori divulgare un brevetto statunitense (PCT/CA2014/050454) su MSI-CE-MS come uno screening multiplex workflow piattaforma e dati per l'analisi chimica.

Separazioni cromatografiche convenzionali in genere utilizzano un'iniezione di singolo campione per corsa, che è poi seguita da un'eluizione di pendenza per la risoluzione di miscele complesse di droga e ricondizionamento di colonna. Tali requisiti fondamentalmente limitare rendimento del campione e duty cycle anche quando si utilizzano programmi di commutazione colonna ottimale. In questo contesto, analisi di droga delle urine ad alto volume per il posto di lavoro, tossicologia o applicazioni di monitoraggio terapeutiche di GC-MS/MS e, sempre più, LC-MS/MS sono così eseguite in parallelo ma usate preferenzialmente come un secondo livello o di conferma di prova quando necessario (cioè, contesto legale o medico). Questo è dovuto il molto più alti investimenti di capitale e costi operativi, così come le complicazioni con l'analisi dei dati quando si confrontano campioni analizzati su più piattaforme strumentali all'interno di un laboratorio accreditato. Di conseguenza, immunodosaggi rimangono ancora il metodo primario per lo screening di routine stupefacenti pur essendo incline a falsi positivi e falsi negativi tra molte classi di farmaci, con accesso limitato ai reagenti dell'anticorpo per droghe di designer emergenti. Precedenti studi hanno dimostrato che le separazioni multiplexate basate su MSI-CE-MS offrono una soluzione semplice per migliorare il rendimento del campione fino a un ordine di grandezza. Inoltre, questo approccio consente per la progettazione di flussi di lavoro nuovi dati per la scoperta del biomarcatore con fedeltà alta dati basato sull'attuazione di correzione efficace batch e controllo qualità12,13,14. Tuttavia, l'introduzione di 10 o più seriale iniezioni idrodinamiche in MSI-CE-MS accorcia la lunghezza capillare efficace deve mantenere le separazioni ad alta efficienza, che possono compromettere la selettività analizzando DoA e loro metaboliti in urina umana.
Nel presente documento, abbiamo introdotto un'iniezione Elettrocinetica di BGE dopo ogni iniezione idrodinamica campione, tale che la separazione si avvale della lunghezza completa capillare (120 cm), migliorando così la risoluzione di droga importante isobare/isomeri quando si utilizza scansione completa acquisizione dei dati da TOF-MS (Figura 1A). In confronto ad una recente relazione14, migliore risoluzione si ottiene per diversi importanti isobarica/isomerica DoA e loro metaboliti, che è critico quando lo screening per pannelli di grandi droga. Per esempio, la risoluzione di diversi isomeri di importante gruppo strutturale/funzionale è stata realizzata, tra cui tre farmaci oppioidi analoghi/metaboliti (Figura 1B), due isobare oppioidi non correlati (Figura 1) e due metanfetamine isomeri posizionali (Figura 1). In tutti i casi, provette da seriale iniezione di calibratore diverse soluzioni all'interno della stessa eseguire non è significativo, come confermato da un controllo delle urine negative/blank. Inoltre, la risoluzione migliorata è realizzata anche per diversi Croce-interferenze che coinvolge alcuni d-ISs con isobariche farmaci all'interno del pannello, come cotinina-d3 e 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA), EDDP-d3 e imipramina, norfentanyl-d5 e ketamina, codeina-d6 e sertralina e cocaina-d3 e zolpidem. Questo risultato è estesa a altre interferenze isobariche all'interno del pannello di droga che meglio sono stati risolti in questo studio (ad es., noroxycodone/oxymorphone, normeperidina/metilfenidato), così come disturbi urinari principali sfondo (per esempio. , in origine frammentare ioni di creatinina con anfetamine)14. Infatti, accesso ai due parametri ortogonali per soddisfare la presunta identificazione di un DoA specifici è fondamentale per ridurre i falsi positivi a causa di interferenze isobariche, vale a dire accurate massa combinate con comigration con d-ISs. Inoltre, il rilevamento di uno o più biotrasformato metaboliti della droga del genitore nello stesso campione, come glucuronide idrossilati, demethylated o intatto droga conjugate(s), aggiunge ulteriore fiducia verso identificazione droga allargando la finestra per il rilevamento.
I livelli di cut-off consigliati per lo screening delle urine droga variano ampiamente per le diverse classi di DoA (che vanno da 50 a 1.000 ng/mL) a seconda della loro farmacocinetica, tossicità e le interferenze di fondo, al fine di ridurre i pregiudizi metodo basato sugli orientamenti da La Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA)14. Il potenziale per MSI-CE-MS rilevare e identificare diverse classi di DoA direttamente nelle urine con il pretrattamento del campione minimo è stato applicato ad un gruppo di pazienti clinicamente depressi con un record di noti prescrizione. L'identificazione definitiva di metadone (prescritto), anfetamine (insiemein/illecito), venlafaxina (prescritto) e pregabalin (prescritto) in campioni di urina diluita, ma nonhydrolyzed, è stata dimostrata quando si utilizza MSI-CE-MS. Ciò è stata basata su un confronto diretto di una droga rilevato in una posizione di iniezione specifici rispetto la miscela di 84-farmaco introdotta nella prima posizione del campione a quella raccomandata livello di cut-off che serve come un riferimento interno a Sewss e controllo positivo di screening (Figura 2). Inoltre, quantificazione assoluta droga è fattibile quando utilizzando le curve di calibrazione esterna (Figura 3) sulla base del rapporto di risposta agli ioni misurati per un farmaco rispetto al suo d-è. A differenza di separazioni cromatografiche più, non c'è alcun effetto di deuterio che incidono le differenze di tempo di migrazione tra un d-è e sua nondeuterated droga poiché possiedono analoga mobilità elettroforetica in soluzione gratuita in CE. Infatti, il comportamento della migrazione di DoA è accuratamente modellato in CE, basata sulla loro struttura di proprietà chimico fisico-chimiche fondamentali, vale a dire volume molecolare e carica effettiva (pKun)14. Poiché molti farmaci anche subiscono significativo metabolismo secondario prima dell'escrezione nelle urine (ad es., glucuronide di morfina), cut-off per lo screening, livelli richiedono regolazione come loro concentrazioni misurate sono inferiori anticipato rispetto al metodi che utilizzano il idrolisi enzimatica per rilevamento di droga totale. Dei principali vantaggi di "diluire-and-shoot" urina test anti-droga, oltre a ridurre i costi/tempi, manipolazione del campione e una polarizzazione potenziale o batch variazioni a causa di idrolisi enzimatica incompleta, è che presuntivi casi di schermo-positivi sono ulteriormente confermati dalla individuazione di uno o più metaboliti della droga correlati nello stesso campione. Questo fornisce anche più profonde intuizioni droga farmacocinetica e ottimale la posologia per i singoli pazienti, migliorando il rilevamento per i metabolizzatori "veloci" o illecito prescritto farmaci con breve emivita. Inoltre, comigration con un corrispondente d-riproduce due funzioni importanti per la selezione quando affidabile della droga utilizza MSI-CE-MS — vale a dire, identifica la posizione di iniezione esatto del campione (cioè, pazienti #) durante la correzione anche per le differenze in ione volumi di risposte/iniezione per una migliore precisione e accuratezza.
Futuro lavoro mira a sviluppare strumenti di software su misura per facilitare il trattamento automatizzato di dati di multiplexate separazioni accoppiato al HRMS come richiesto per droga ad alto volume urina test con QC/QA. Convalida rigorosa di MSI-CE-MS per lo screening ad ampio spettro di DoA sarà studiata anche tra un più grande gruppo di pazienti ad alto rischio al fine di valutare oggettivamente il medicinale prescritto l'aderenza e il potenziale abuso/sostituzione che potrebbero compromettere la efficacia del trattamento, sicurezza del paziente e/o valutazione/diagnosi psichiatrica. Un'analisi complementare di acidi/anioniche classi di DoA e loro metaboliti è essere interpretata anche da MSI-CE-MS in condizioni alcaline con rilevamento modalità ioni negativi come richiesto per lo screening completo dei cannabinoidi naturali/sintetiche. Questo è importante dato l'incombente implicazioni di salute pubblica della legalizzazione della marijuana ricreativa attraverso il Canada e diversi Stati USA. Dei principali vantaggi dell'acquisizione dei dati di scansione completa da TOF-MS è che l'analisi retrospettiva dei campioni può essere eseguita anche quando i campioni di urina non sono più disponibili per il test di follow-up, mentre altri lifestyle o esposizioni alimentari possono essere valutate al meglio capire le diverse risposte alla terapia farmacologica. In sintesi, un metodo di sorveglianza di droga rapida ma accurata di MSI-CE-MS offre vantaggi significativi per test immunologici mirati convenzionali, così come infusione diretta/ambiente metodi di ionizzazione-MS/MS che sono soggetti a interferenze/bias durante la risoluzione di pannelli di espanso di DoA e loro metaboliti in campioni biologici complessi a costi incrementali.

Un allarmante aumento l'uso improprio di e della dipendenza da oppiacei per la gestione del dolore cronico rappresenta una minaccia crescente per la salute pubblica, con oltre 70.000 morti di overdose di droga negli Stati Uniti nel 20171stimata. Allo stesso modo, vari altri farmaci psicotropi sono anche ampiamente prescritto a bambini e giovani adulti per il trattamento di ansia, depressione e problemi di salute mentale2. Di conseguenza, droga urina test metodi, ampiamente sviluppati per il posto di lavoro e la tossicologia forense, è di vitale importanza per il monitoraggio terapeutico dei farmaci prescritti che sono inclini a tolleranza e dipendenza3,4. Ciò è necessario per garantire l'aderenza ottima efficacia terapeutica e sicurezza del paziente, pur rivelando potenziali sostituzione, uso improprio, illecito o insiemein droga. Attualmente, la droga delle urine per DoA si basano su un approccio a due livelli, composto da un immunoassay competitivo iniziale schermo tramite dispositivi point-of-care o analizzatori di laboratorio, seguita da un test di conferma con una maggiore specificità basata su GC-MS/MS e, sempre più, LC-MS/MS5. Tuttavia, test immunologici sono inclini a sbieco, come anticorpi legano non specifico per varie classi di farmaci per generare un risultato presuntivo positivo-screen, che impedisce un affidabile identificazione e quantificazione di farmaci specifici o complesso farmaco miscele6. In questo contesto, più accurati test di droga urina sono urgentemente necessari visti i costi esorbitanti di poliassunzione completa schermi,7 tra cui droghe e prodotti di urina sintetica che eludere convenzionali mirate analisi.
Le separazioni ad alta efficienza in combinazione con MS ad alta risoluzione (HRMS) utilizzando analizzatori di massa TOF o orbitrap sono stati proposti come una strategia immaturi per la sorveglianza dei medicinali in un'epoca di polypharmacy e pannelli di DoA8,9 in espansione . Tuttavia, le separazioni di LC convenzionali sono lento (> 15 min) a causa dei tempi lunghi di eluizione per la risoluzione di chimicamente diverse classi di DoA e loro metaboliti utilizzando programmi di eluizione di pendenza, che limita la velocità effettiva del campione per lo screening di routine stupefacenti. In alternativa, metodi di analisi diretta basano sul desorbimento ionizzazione (DESI)10 e laser diodo desorbimento termico (LDTD) consentono di selezione senza separazione11più veloce della droga. Tuttavia, questi metodi di ionizzazione ambientale sono soggetti a interferenze isobariche/isomerica analizzando campioni di urina complessa, che richiede una conferma di test indipendenti.
Il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato una piattaforma di separazione multiplex per aumentare la produttività del campione mantenendo la fedeltà ad alta risoluzione e dati di separazione ad alta efficienza basata su MSI-CE-MS12. Flussi di lavoro nuovi dati possono essere progettati in MSI-CE-MS per il metabolita immaturi profilatura (cioè, metabolomica) di volume limitato biospecimens, considerando che i controlli di qualità (QC) consentono per la correzione di batch come richiesto per popolazione su larga scala studi13. In questo caso, le separazioni vengono eseguite utilizzando un buffer di isocratic con ionizzazione soluto che si verificano in condizioni di stato stazionario solvente quando si utilizza un'interfaccia liquida guaina convenzionali, che consente per le iniezioni seriale di 10 o più campioni all'interno di un singolo eseguire per lo screening rapido ma selettivo di diverse classi di DoA e loro metaboliti14. Il focus di questo studio è quello di convalidare ulteriormente MSI-CE-MS per l'analisi diretta di campioni di urina autentico da un gruppo rappresentativo di pazienti clinicamente depressi utilizzando un metodo di "diluire-and-shoot" che evita la necessità di enzima idrolisi15. Inoltre, l'implementazione di un distanziale elettrocinetico tra seriale esempio tappi in MSI-CE-MS16 è stato effettuato per ulteriormente migliorare la risoluzione di vari isomeri di droga/isobare, disturbi urinari, di base e/o Croce-interferenze quando grandi pannelli di DoA di screening. La quantificazione assoluta di DoA in campioni di urina quando utilizzando la corrispondenza deuterated standard interni (d-è) è dimostrato quando si utilizza MSI-CE-MS. Questo approccio semplifica la identificazione di droga, nonché a dedurre la posizione corretta del campione di casi di schermo-positivi rispetto ad una miscela di pannello di droga presso la raccomandata livello di cut-off che funziona anche come un riferimento/controllo di qualità interno all'interno di screening l'esecuzione stessa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7100 Capillary Electrophoresis System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G7100A</td>
			<td>CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G6230B</td>
			<td>HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE-ESI-MS Sprayer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G1603A</td>
			<td>CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G1310B</td>
			<td>Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>--</td>
			<td>Software used for control of CE-MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>--</td>
			<td>Software used for processing of CE-MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortix Capillary Cutter</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>5813-4620</td>
			<td>Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Window Maker</td>
			<td>Microsolv Inc.</td>
			<td>07200-S</td>
			<td>Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused-silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies Inc.</td>
			<td>TSP05375</td>
			<td>Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)</td>
			<td>Cerilliant Inc.</td>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput and comprehensive drug surveillance using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry

Nuovi metodi analitici sono urgentemente necessari per attivare lo screening di stupefacenti ad alta produttività, ma completa, dato una crisi allarmante di droga di prescrizione e dell'oppioide nella sanità pubblica. Test anti-droga urina convenzionale basato su uno schermo a due livelli di immunoassay seguita da una gas cromatografia-spettrometria di massa (GC-MS/MS) o metodo di liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS) sono costosi e soggetti a bias pur essendo limitata ai pannelli mirati di noti farmaci d'abuso (DoA). Qui, descriviamo un metodo migliorato per la sorveglianza dei medicinali che consente la risoluzione e l'individuazione di un pannello espanso di DoA e loro metaboliti quando usando multisegmento iniezione-capillare elettroforesi-spettrometria totale (MSI-CE-MS). Multiplexati separazioni di dieci campioni di urina con un controllo di qualità da CE (< 3 min/campione) in congiunzione con acquisizione di dati di scansione completa utilizzando un tempo di volo (TOF-MS) di spettrometro di massa sotto rilevamento modalità ioni positivi consente l'identificazione e quantificazione di DoA sopra i livelli di cut-off consigliati. Un'eccellente risoluzione di droga isomeri e isobare, comprese le interferenze di sfondo, si ottengono quando si utilizza MSI-CE-MS con un distanziale elettrocinetico tra segmenti di campione, dove precisa formula molecolare massa insieme con il comigration di un corrispondenza deuterated standard interno e l'individuazione di uno o più metaboliti bio-trasformate facilitano l'identificazione di DoA sopra una finestra più ampia di rilevamento. Inoltre, i campioni di urina possono essere analizzati direttamente senza deconjugation di enzima per lo screening rapido senza il workup campione complicati. MSI-CE-MS consente la sorveglianza di un ampio spettro di DoA che è richiesto per il monitoraggio del trattamento dei pazienti ad alto rischio, compreso confermando l'aderenza del farmaco prescritto, rivelando l'uso di droghe illecite/sostituzione e regimi di dosaggio ottimale di valutazione come richiesto per nuovi progressi nella medicina di precisione.

MSI-CE-MS consente l'iniezione seriale di dieci o più campioni discreti all'interno di un singolo ciclo, che migliora notevolmente la velocità effettiva (< 3 min/campione) senza complicate modifiche strumentali, programmi di commutazione colonna o infrastrutture costose investimenti (Figura 1A). Una serie alternata di iniezioni idrodinamiche del campione e distanziale elettrocinetico di BGE viene eseguita all'interno di un capillare di silice fusa non modificato, dove mediante elettroforesi zonale separazioni di ioni si verificano condizioni di elettrolita fortemente acida (pH 1.8). ionizzazione soluto si verifica anche in condizioni di stato stazionario. In questo caso un liquido coassiale guaina, con un calibratore di massa, viene utilizzato come interfaccia per CE-MS sotto l'individuazione di modalità ioni positivi con effetti di soppressione o il miglioramento minimo ioni come controllato dal segnale di ioni di massa calibratore. TOF rappresenta un HRMS robusto ma conveniente con un'acquisizione veloce dei dati ideale per le applicazioni di sorveglianza immaturi screening/droga quando si utilizza MSI-CE-MS. Ad esempio, impressionante risoluzione si ottiene per vari isobarica/isomerica DoA e loro metaboliti, tra cui isomeri strutturali di tre isomeri strutturali dell'oppioide, vale a dire norhydrocodone, idromorfone e morfina (Figura 1B). In questo caso, 30 risolto picchi da 10 campioni indipendenti di una miscela di droga vengono rilevati senza riporto di campione. Un controllo vuoto/negativo urina urina sintetica è anche incluso all'interno della serie di iniezione seriale (campione posizione #6). Inoltre, vengono completamente risolti come 20 picchi distinti con acquisizione di dati di scansione completa (due altri oppioidi isobarico, vale a dire 6-acetylmorphine (un metabolita inattivo eroina) e naloxone (antagonista del ricevitore dell'oppioide utilizzato per il trattamento di emergenza di overdose da oppiacei) Figura 1). Allo stesso modo, i due isomeri posizionali di anfetamine sono risolto completamente in MSI-CE-MS per distinguere l'abuso della metamfetamina illecito dal potenziale abuso di fentermina, uno stimolante prescritto che viene utilizzato come un soppressore dell'appetito per la perdita di peso.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig1.jpg"> Figura 1: una serie di estratti ioni elettroferogrammi (EIE) per rappresentante DoA isomeri/isobare risolti da MSI-CE-MS analizzando 10 campioni e uno spazio vuoto all'interno di una singola esecuzione. (A) schematico di MSI-CE-MS che raffigura la configurazione seriale iniezione utilizzata per un pannello di 84-DoA in urina sintetica. Questo metodo di separazione multiplex utilizza una serie alternata di idrodinamiche iniezioni di 11 campioni discreti e vuoto con un'iniezione Elettrocinetica di un buffer per avviare la separazione elettroforetica zona degli ioni, seguita da una scansione completa dei dati acquisizione da TOF-MS con il rilevamento della modalità ioni positivi. (B) tre isobarica gruppo funzionale dell'oppioide isomeri (m/z 286.1438), separate da CE, che comprende 30 cime risolti da 10 iniezioni di campione discreti, tra cui norhydrocodone, idromorfone e morfina. (C), due farmaci oppioidi isobarico e loro metaboliti (m/z 328.1543), separate da CE, composto da 20 vette risolti da 10 iniezioni di campione discreti, comprese 6-acetylmorphine (metabolita di eroina) e naloxone. Gli isomeri dell'anfetamina isobarica gruppo funzionale (D) due, separati da CE, composto da 20 vette risolti da 10 iniezioni di campione discreti, tra cui metanfetamine e phentermine. In tutti i casi, i controlli delle urine negative/spazii in bianco introdotti in corrispondenza del sesto esempio MSI-CE-MS hanno avuti prova trascurabile di provette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per schermare DoA, una configurazione di iniezione seriale in MSI-CE-MS utilizzato una miscela di 84-droga pannello presso la raccomandata livelli di concentrazione di cut-off di screening (come la prima posizione di iniezione per tutte le esecuzioni) seguita da un'analisi randomizzata di urina rappresentante 10 campioni di pazienti clinicamente depressi con una storia conosciuta prescrizione. Per esempio, uno screening positivo risultato del test per metadone (m/z 310.2165) da paziente #208 (Figura 2A) è dedotto da un rilevamento di un picco di grandi segnali (provenienti da iniezione #9) che comigrates con metadone-d3 con un basso errore di massa (< 5 ppm). Nessun altri segnali vengono rilevati in qualsiasi altri campioni di urina all'interno della stessa esecuzione. Concentrazione di metadone supera il limite di taglio consigliata: 13x confrontando nel suo rapporto di risposta dello ione misurata nel campione (iniezione #9) con il riferimento droga miscela/QC (iniezione #1) e corretti con un fattore di diluizione dell'urina quadruplo. Così, questo risultato conferma l'aderenza del paziente alla terapia di manutenzione del metadone. Prova di assunzione insiemein anfetamina (Figura 2B) è indicato dai livelli elevati dell'anfetamina (m/z 136.1121) che è stato rilevato soltanto in un paziente (paziente #50, nell'iniezione #11) all'interno della serie MSI-CE-MS. La concentrazione misurata leggermente superato i livelli di cut-off raccomandato (1.3 x). Questo comigrates con anfetamina-d5 e aveva un basso errore di massa con un fiammifero di top-ranked formula molecolare. Un risultato positivo del test per l'antidepressivo venlafaxina (m/z 278.2115), un inibitore di reuptake della serotonina-norepinefrina selettiva, è anche dimostrata nel paziente #281 (iniezione #6). In questo caso, la concentrazione supera i livelli di cut-off raccomandato (15x), questo è identificato dal suo accurato massa - o formula molecolare-partita, insieme a comigrating venlafaxine-d6 (Figura 2). Quest'ultimo criterio non è soddisfatto per un'isobara sconosciuta che viene rilevata anche nella traccia EIE, che evidenzia l'esigenza di cautela quando basandosi esclusivamente sulla sua massa accurata. Inoltre, un rilevamento definitivo di pregabalin prescritta, che è prescritto per il trattamento del dolore neuropatico, così come di ansia generalizzata, è anche dimostrato per paziente #309, basato sulla sua grossolanamente elevata concentrazione (x 64) sopra la raccomandata livelli di cut-off (Figura 2D). Tuttavia, non viene rilevato in nove altri campioni di urina di pazienti analizzati all'interno della stessa esecuzione. Simile agli altri casi screen-positivo, iniezione #4, comigrates con pregabalin-d6, che è incluso in tutti i campioni di urina analizzati da MSI-CE-MS.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig2.jpg"> Figura 2: una serie di estratti ioni elettroferogrammi (EIE) per risultati di test di droga rappresentante schermo-positiva dell'urina da un gruppo di 10 pazienti clinicamente depressi come confermato quando consiglia di utilizzare MSI-CE-MS, che comprende un pannello di 84-droga alle livello di cut-off, iniettato come la prima posizione di iniezione del campione che serve come riferimento interno/QC. (A) EIE sovrapposizione corrispondente al metadone-d3, che comigrates con metadone, evidenziando quel campione di sola urina (iniezione posizione #9) ha elevato le concentrazioni di metadone superando di gran lunga il livello di cut-off. (B) EIE sovrapposizione corrispondente anfetamina-d3, che comigrates con anfetamine, evidenziando quel campione di sola urina (iniezione posizione #11) ha elevato le concentrazioni sopra i livelli di cut-off. (C) EIE sovrapposizione corrispondente alla venlafaxina-d6, che comigrates con venlafaxina, evidenziando quel campione di sola urina (iniezione posizione #6) ha elevato le concentrazioni sopra i livelli di cut-off. (D) EIE sovrapposizione corrispondente al pregabalin-d6, che comigrates con pregabalin, mettendo in evidenza che solo un campione di urina (iniezione posizione #4) grossolanamente ha elevato le concentrazioni superano livelli di cut-off. Tutti i campioni di urina sono stati analizzati direttamente dopo una quintuplo diluizione in acqua deionizzata con l'aggiunta di un abbinamento d-è (quando disponibile). Un risultato positivo dello schermo in MSI-CE-MS corrisponde ad una droga che comigrates con d-ISs con un basso errore di massa (< 5 ppm) e la formula molecolare corretta, cui concentrazione supera il cut-off che è analizzato all'interno della serie stessa come riferimento interno/QC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La quantificazione assoluta di DoA e loro metaboliti è raggiunto anche da MSI-CE-MS basato su curve di calibrazione esterna, utilizzando standard di riferimento calibratore per DoA che si acquisiscono rapidamente all'interno di una singola esecuzione. Per esempio, la diluizione seriale di una miscela di calibratore 84-droga insieme a un corrispondente d-è a una concentrazione fissa fornisce un'analisi quantitativa affidabile in campioni di urina complesse. Questo compensa per la soppressione dello ione indotta da matrice potenziale o il potenziamento, ma anche per le variazioni del volume di iniezione nel capillare tra i campioni. Nei casi quando un corrispondente d-IS è commercialmente disponibile o costo proibitivo per alcuni DoA, è un surrogato viene utilizzato per la normalizzazione dei dati, ad esempio un d-IS all'interno della stessa classe di farmaci o un sintetico composto non trovato in urina (F-Phe), come dimostrato in precedenza 14. rappresentante EIEs e curve di calibrazione esterna per l'ossicodone sono mostrate in Figura 3A, B. e per citalopram in Figura 3, D. Questi sono ampiamente prescritti analgesici e Antidepressive, rispettivamente, con potenziale di abuso. Ione relativa risposta rapporti ai loro corrispondenti d-si sono misurati. In questo caso, una configurazione di iniezione seriale in MSI-CE-MS, composto da cinque differenti droga calibranti, vengono analizzati in duplicato all'interno di una singola esecuzione insieme con un vuoto di urina sintetica. Nel complesso, buona linearità (R2 > 0.990) sopra una concentrazione 20 volte gamma è stata realizzata con un'adeguata sensibilità per il rilevamento della maggioranza di DoA e loro metaboliti (cioè, alcaloidi cationici) all'interno del pannello di 84-droga 14. in tutti i casi, metaboliti della droga vengono rilevati come limiti di loro ione molecolare protonati [MH+] sopra loro taglio di screening (> 50 ng/mL), con l'eccezione di alcuni farmaci acido/neutro che hanno un'efficienza di ionizzazione poveri sotto la modalità ioni positivi, quali i cannabinoidi (ad es., THC-COOH), barbiturici (ad es., secobarbital) e carbammati (ad es., carisoprodol).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig3.jpg"> Figura 3: una serie di estratti ioni elettroferogrammi (EIE) per quantificare il rappresentante DoA. Ciò avviene tramite la generazione di curve di calibrazione esterna sulla base del loro rapporto di risposta relativo ioni con un una corrispondenza d-è su una gamma dinamica lineare 20 volte. (A) duplicare l'iniezione di una curva di calibrazione di cinque-punto per l'ossicodone calibranti insieme ossicodone-d3 e uno spazio vuoto. (B) curva di calibrazione esterna per l'ossicodone, seguito di regressione lineare per derivare la sensibilità (pendenza) e linearità (R2), con barre di errore che rappresenta ±1σ (n = 4). (C) duplicare l'iniezione di una curva di calibrazione di cinque-punto per citalopram calibranti, insieme con citalopram-d6 e uno spazio vuoto. Curva di calibrazione esterna (D) per citalopram, seguito di regressione lineare per derivare la sensibilità (pendenza) e linearità (R2), con errore barre che rappresentano ± 1 SD (n = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Qui descriviamo un metodo ad alta produttività per la sorveglianza dei medicinali completa che permette la risoluzione migliorata e l'individuazione di grandi pannelli delle droghe d'abuso e loro metaboliti, con controllo di qualità basato su multisegmento iniezione-capillare elettroforesi-spettrometria totale.

Sorveglianza dei medicinali ad alta produttività e completa usando la spettrometria totale multisegmento elettroforesi di iniezione-capillare

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Le attuali strategie per uno screening dei farmaci per le urine sono costose da eseguire per l'analisi di routine di pannelli sempre più grandi di farmaci di abuso come richiesto per i test sul posto di lavoro, nonché per le applicazioni di monitoraggio terapeutico dei farmaci. Inoltre, i metodi basati su test ammino sono inclini alla distorsione e sono in ultima analisi limitati all'analisi target di pannelli di farmaci noti. Il vantaggio principale del nostro metodo, che viene indicato come MSI-CE-MS, è che consente lo screening rapido di un pannello di farmaci illimitato e dei loro metaboliti con alta precisione e lavoro minimo del campione.Vi è l'urgente necessità di un metodo di screening ad alta produttività e conveniente per migliorare i risultati dei pazienti confermando l'aderenza e ottimizzando i regimi di dosaggio dei farmaci, rivelando al contempo l'uso illecito di droghe. Questa piattaforma di separazione multiplexata può essere applicata a una varietà di altre aree di ricerca relative alla profilazione di metaboliti mirati o non mirati in campioni biologici complessi. Inizia scongelando campioni di urina mattutini non identificati raccolti da pazienti con una storia nota di farmaci soggetti a prescrizione medica per una conservazione di meno 80 gradi Celsius sul ghiaccio e vortexando i campioni scongelati per 30 secondi.Successivamente, sedimentare i campioni mediante centrifugazione e combinare tre aliquote da 10 microlitri di ciascun campione con 10 microlitri di norme interne deuterate, cinque microlitri di una soluzione di 4-fluoro-L-fenilalanina e 3-cloro-L-tirosina e 25 microlitri di acqua deionizzata. Quindi centrifugare le miscele per un minuto e trasferire 20 microlitri di ciascun campione in singoli flaconcini di polipropilene. Per impostare i parametri di condizionamento capillare della silice fusa non patinato, tagliare un diametro interno di 135 centimetri, 50 micrometri di diametro interno e un capillare di diametro esterno di 360 micrometri da una bobina.Utilizzare un produttore di finestre capillari per rimuovere circa 7 millimetri di rivestimento in poliammide da entrambe le estremità di ogni capillare. Successivamente, installare le insenature capillari nell'elettroforesi capillare, o cartuccia CE, facendo scorrere ogni capillare per due giri a 360 gradi, facendo attenzione a sporgere circa due millimetri delle prese capillari dall'ago dello spruzzatore CE. Una volta installati tutti i capillari, caricare con cura la cartuccia CE nel sistema CE e conservare lo spruzzatore CE dalla fonte di ioni.Posizionare la cromatografia liquida, o spruzzatore LC, nella sorgente ionica e selezionare lo scarico nel software del sistema per impostare il condizionamento capillare. Impostare la durata del metanolo, un idrossido di sodio molare, acqua deionizzata ed elettrolita di fondo a filo a 30 minuti per scarico e posizionare la pompa isocratica in standby durante il periodo di condizionamento capillare. Dopo l'ultimo lavaggio, pulire lo spettrometro di massa dell'elettroforesi capillare, o spruzzatore CE-MS, e l'elettrodo CE con salviette imbevute di metanolo.Pulire l'interfaccia CE-MS con una soluzione di acqua isopropanolo uno a uno per rimuovere eventuali depositi residui di sale. Sostituire lo spruzzatore LC con lo spruzzatore CE-MS pulito e un capillare appena condizionato nell'interfaccia liquida della pulitura coassiale. Quindi accendere la pompa isocratica e applicare una tensione di 30 kilovolt per 15 minuti per garantire che un profilo di corrente CE stabile sia raggiunto prima dell'analisi delle urine.Nel software di sistema, selezionare la precondizione, impostare lo scarico su 600 secondi e specificare una posizione del file elettrolita in background. Impostare l'iniezione per iniettare idrodinamicamente i campioni a 100 millibar per cinque secondi e per iniettare elettrocineticamente i distanziati elettrolitici di fondo a 30 kilovolt per 75 secondi. Impostare la tensione applicata su 30 kilovolt, la temperatura della cartuccia a 25 gradi Celsius e il tempo di esecuzione totale su 40 minuti.Quindi, utilizzando l'orario, applicare un gradiente di pressione di due millibar al minuto da zero a 40 minuti durante la separazione. Al termine dell'acquisizione del campione, sciacquare il capillare a 50 millibar di pressione con gli elettroliti di fondo durante la notte mentre il capillare si trova nello spruzzatore CE nella sorgente ionico. Impostare il rilevamento degli ioni positivi TOF-MS in modo che si estende su un rapporto massa-carica da 50 a 1.700, con una velocità di acquisizione dati di 500 millisecondi per spettro, e verificare che sia il profilo che i dati baricentri siano memorizzati in formato file D.Impostare le condizioni di ionizzazione elettrospray su capillare e su tensioni di ugello di 2000 volt ciascuna, il gas nebulizzatore a 10 libbre per pollice quadrato e l'erogazione del gas di essiccazione a otto litri al minuto a 300 gradi Celsius con un flusso di gas di focaia di 3,5 litri al minuto a 195 gradi Celsius durante l'acquisizione. Quindi impostare le impostazioni di tensione MS di fragmenter, skimmer e octapole una radiofrequenza rispettivamente a 120, 65 e 750 volt e impostare i parametri di controllo dello strumento e acquisizione dei dati in base alla progettazione dell'esperimento. Per l'analisi dei dati, aprire i dati CE-MS multi-segmento nel software di sistema.In cromatogrammi impostare i dati di estrazione e i formati cromatogramma e dati spettrali di massa sulla modalità profilo. In smussatura, selezionate savitzky-golay cubica quadratica e impostate la larghezza della funzione su 15 punti. Quindi fare clic su Integra MS e impostare l'integratore su agile.In Filtri di picco impostare il numero massimo di picchi su 11. In visualizzazione, fare clic sull'elenco dei picchi di integrazione e selezionare il numero di picco, il tempo di conservazione, l'area di picco, l'altezza di picco e il rapporto segnale/rumore. Salvare quindi i parametri con un nome di metodo univoco e applicare il metodo al processo per l'interpretazione di ogni set di dati.In questa analisi rappresentativa di vari farmaci isobarici isomerici di abuso e dei loro metaboliti, sono stati rilevati 30 picchi risolti da 10 campioni indipendenti di una miscela di farmaci senza riporto del campione. Altri due oppioidi isobarici potrebbero essere completamente risolti come 20 picchi distinti con l'acquisizione completa dei dati di scansione. Allo stesso modo, due isomeri posizionali delle anfetamine sono stati completamente risolti in questa analisi CE-MS multi-segmento, per distinguere l'abuso illecito di metanfetamina dal potenziale uso improprio della fentermina, uno stimolante prescritto che viene utilizzato come soppressore dell'appetito per la perdita di peso.In questa analisi rappresentativa dello screening farmacologico, un risultato positivo del test di screening per il metadone è stato dedotto dal rilevamento di un grande picco di segnale che co-migra con il picco metadone-d3 con un basso errore di massa. Nessun altro segnale è stato rilevato in altri campioni di urina all'interno della stessa corsa e la concentrazione di metadone rilevata ha superato 13 volte il limite di taglio raccomandato rispetto al rapporto di risposta ionica misurata nel campione e corretto da un fattore di diluizione delle urine di quattro volte, confermando l'aderenza dei pazienti alla terapia di mantenimento del metadone. Qui, una configurazione di iniezione seriale in CE-MS multi-segmento, composta da cinque diversi calibranti di farmaci, è stata analizzata in duplicato all'interno di una singola corsa insieme al vuoto di urina sintetico.I metaboliti del farmaco sono stati rilevati come i loro ioni molecolari potenati al di sopra dei loro limiti di taglio dello screening. Seguendo questa procedura, un gran numero di metaboliti polari e ionici nelle urine possono anche essere analizzati da MSI CMS a supporto della ricerca metabolica basata sulla scoperta. Inoltre, è possibile ottenere una sorveglianza completa di una vasta gamma di farmaci esogeni e dei loro metaboliti, compresi i farmaci non prescritti e le droghe illecite soggette ad abuso.Questo metodo ottimizzato può anche essere utilizzato per schermare regolarmente altre droghe di abuso. Questi potrebbero essere metaboliti di cannabis o alcol e il nostro metodo può anche distinguere tra una matrice di urina sintetica o falsa e anche un campione di urina naturale, reale e autenticamente donato. Ricordarsi di usare sempre cautela quando si lavora con fluidi biologici.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Ricerca

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