Name: high-throughput and comprehensive drug surveillance using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry
Uploaded: 2019-04-23T12:30:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry at JoVE.com

P.B.M. ønsker å anerkjenne finansiering støtte fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada, Canada grunnlaget for innovasjon, Genome Canada og McMaster University. Forfatterne takker Howard Lee hos Seroclinix Corporation og Dr. Marcus Kim Agilent teknologi for diskusjonene innsiktsfulle. I tillegg bekrefter forfatterne Dr. Zainab Samaan fra Department of Psychiatry og opptreden vitenskap ved McMaster University og humør lidelse klinikken ved St. Joseph's Hospital for tilgang til de deidentified pasienten urinprøver brukes i denne studien .

Blendet urinprøver fotograferingen av Dr. Zainab Samaan fra humør lidelse klinikken ved St. Joseph's Hospital (Hamilton, Storbritannia), der studie ble godkjent av Hamilton integrert forskning etikk styret.
1. reagenser og prøve løsninger forberedelse
<ol><li>
Bakgrunn elektrolytt forberedelse
	<ol>
<li>Forberede 50 mL av bakgrunnen elektrolytt (BGE) annenhver uke, 1 M maursyre, pH 1.8, med 15% v/v acetonitrile som en organisk modifikator.</li>
		<li>Aliquot 1,9 mL konsentrert maursyre lager (26.5 M) i en 50 mL volumetriske kolbe og legge 7,5 mL av acetonitrile og 40.6 mL deionisert vann for å bringe det totale volumet til 50 ml passer. Deretter sonicate løsningen for 15 min og overføre den til en sterilisert flaske med tett forsegling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Skjede flytende forberedelse
	<ol>
<li>Forberede 200 mL skjede flytende løsning ukentlig, bestående av 0,1% maursyre i 60: 40 (MeOH:H2O).</li>
		<li>Aliquot 200 µL av maursyre (26.5 M stock) i en flaske som inneholder 120 mL av MeOH og 80 mL H2O å gjøre skjede væske og degas det i 15 min.</li>
		<li>Deretter legger til 10 µL av hver av følgende referanse ioner, purine og hexakis (2,2,3,3-tetrafluoropropoxy) phosphazine (HP-921), i skjede væsken å gi konstant masse signaler på m/z 121.05087 og m/z 922.00979, henholdsvis. Merk: Disse referanse ioner tillater sanntid masse korreksjon og også overvåke for potensielle matrix-indusert ion undertrykkelse eller forbedring effekter under separasjon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Standard forberedelse
	<ol>
<li>Forberede en standard løsning som inneholder en 84-stoff panelet blanding på 3 x klinisk screening cut-off nivå (L6)14 i 1 mL av metanol, bruker narkotika standarder kjøpt fra en leverandør av kjemikalier. Forbered separat en blanding av 48 matchende deuterated interne narkotika standard (d-ISs) på en 10 ganger høyere konsentrasjon enn 84-stoff blandingen i 1 mL av metanol. I tillegg klargjør en lagerløsning inneholder 200 µM 4-fluoro -L-fenylalanin (F-Phe) og 3-klor -L-tyrosin (Cl-ty) i 1 mL av deionisert H2O.</li>
		<li>Utføre en femdoblet fortynning av ovennevnte 84-stoff blandingen (20 µL) og 48 d-ISs (20 µL), samt en tidoblet fortynning av 4-fluorophenylalanine (F-Phe, 10 µL) og 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 µL) i en sertifisert syntetiske urin matrix (40 µL) å gjøre totalt volum på 100 µL i et 250 µL sentrifuge rør.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eksterne kalibrering kurve forberedelse
	<ol>
<li>Forberede fem-punkts eksterne kalibrering kurver (som beskrevet nedenfor) i quadruplicate (n = 4) over en 20-fold dynamisk område med 84-stoff standard blandingen og 48 av deres tilsvarende d-ISs gjorde i trinn 1.3.1. For eksempel for å gjøre en fem-punkts eksterne kalibreringskurven, sikre fortynne 84-stoff blandingen (L6, trinn 1.3.1) til 2 - 4 - 10-, 20-, og 40-fold, mens det er nødvendig å forberede en femdoblet fortynning av d-ISs (20 µL) og en tidoblet fortynning av 4-F-Phe ( 10 µL) og Cl-Tyr (10 µL) som en ekstra er i en syntetisk urin matrix å gjøre et totalt volum på 100 µL. I tilfeller når en samsvarende d-er ikke er tilgjengelig for et bestemt legemiddel, er bruk 4-F-Phe som et surrogat for data normalisering. Merk: Unngå inkludering av flere d-ISs som cross-påvirke (isobar) med andre DoA panelet hvis de ikke fullt løses av CE separasjon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Urin eksempel forberedelse
	<ol>
<li>Tine deidentified morgenen urinprøver fra en representant kohort av ti klinisk deprimerte pasienter med kjente reseptbelagte stoffet historie. Lagre urinprøver ved-80 ° C etter samling før de måtte være tint for analyse. Merk: Unngå flere fryse-Tin sykluser av urin eller en forsinket bagasje ved romtemperatur etter samlingen på grunn av deres virkning på den kjemiske stabiliteten av visse DoA metabolitter og deres conjugates.</li>
		<li>Vortex deidentified morgen urinen prøver for 30 s og deretter virvel dem for 1 min 14.000 x g for sedimentering. Etter at aliquot 10 µL av de ovennevnte behandlet urin, 10 µL av d-er, og 5 µL av F-Phe/Cl-Tyr og 25 µL av deionisert H2O og vortex for 1 min (Gjenta disse trinnene i tre eksemplarer å vurdere tekniske presisjon). Overføre en 20 µL aliquot av ovenfor beskrevet blandingen til polypropylen ampuller for analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. oppsett av CE-TOF-MULTIPLE Sclerosis systemet
<ol><li>Ubestrøket smeltet silica kapillær condition parametere
	<ol>
<li>Kontroller at alle standarder, eksterne kalibrering kurver og urinprøver i inndelinger 1,3 til 1,5 atskilles med en ubestrøket åpen-rørformede smeltet silica polyimid (pi)-belagt kapillær med en indre diameter på 50 μm, en ytre diameter på 360 µm, og kapillær totallengde 135 cm Merk: En diamond cutter verktøyet brukes til å sikre konsekvent kapillærene som undersøkes ytterligere for å sikre en flush og glatt kutt.</li>
		<li>Fjern ca 7 mm Beleggets polyimid (pi) fra både distale kapillær ender, med en kapillær vinduet maker å redusere eksempel bære-over og forhindre potensielle polyimid (pi) hevelse når i kontakt med organiske løsemidler.</li>
		<li>Kontroller at stikker ca 2 mm av kapillær utløpet av CE sprøyta nålen og installere kapillær innløp i CE kassetten av looping to 360-graders svinger. Deretter forsiktig installere CE kassetten i CE og plasser sprøyta CE av ion kilden når condition av kapillær. Merk: Klipp kapillær uttaket konsekvent som det er avgjørende for å sikre en stabil electrospray gjeldende kombinert til MS. To forskjellige sprøyter ble brukt i dette arbeidet: en CE sprayer ble brukt for eksempel analyse og en LC sprøyta ble brukt for masse kalibreringen.</li>
		<li>Pass på å utføre av kapillær condition med CE sprøyta ikke plassert i ion kilden. LC sprøyta innlegge ion kilden. Merk: Dette gir masse kalibrering og unngå enhver kontaminering av koaksial skjede flytende grensesnittet som er deretter koblet til TOF-MS.</li>
		<li>Tilstand nye kapillærene ved å velge flush-funksjonen (940 mbar) på leverandørens programvare brukes til å kontrollere apparatet og Still inn varigheten for flush 30 minutter hver for fire forskjellige løsemidler i følgende rekkefølge: metanol, 1 M NaOH, vaskebuffer vann og BGE. Pass på å sette isocratic pumpen i ventemodus i kapillær condition perioden.</li>
		<li>Tørk CE-MS sprøyta med en vev tørke dynket i MeOH/T2O å fjerne eventuelle gjenværende saltavleiringer.</li>
		<li>Utføre daglig forebyggende vedlikehold av CE-MS systemet før analysere prøvene. Bruk metanol tørk av CE elektroden (på innløpet) men bruke en isopropanol og vann (50/50) blandingen å rengjøre CE-MS grensesnittet, som er viktig å unngå salt oppbygging og begrense potensielle eksempel bære-over.</li>
		<li>Fjerne LC sprøyta av ion kilden og plasser renset sprøyta med en nylig betinget kapillær i koaksial skjede flytende grensesnittet i CE-MS.</li>
		<li>Slå på isocratic pumpen og bruke en spenning på 30 kV i 15 min slik at en stabil CE gjeldende profil er oppnådd før urin analysen.</li>
	</ol></li>
	<li>Injeksjon og separasjon vilkår bruker CE
	<ol>
<li>Åpne leverandør programvaren brukes for å styre maskinen sette CE parameterne og velg den preconditioning trinn. Angi flush funksjonen til 600 s og angi en BGE medisinglass posisjon. Merk: En ekstern vann chiller må være koblet til CE systemer som mangler eksempel skuffen kjøling funksjoner, som dette er nødvendig for å hindre eksempel fordampning når analysere store grupper av volum-begrenset prøver.</li>
		<li>Angi injeksjon funksjonen å injisere hydrodynamically prøvene på 100 mbar for 5 s og electrokinetically injisere BGE avstandsstykker 30 kV for 75 s. Merk: Denne prosessen gjentas med hvert eksempel injeksjon (fra en annen medisinglass posisjon) etterfulgt av en BGE for avstand (fra samme flaske plasseringen) som utføres automatisk et metoden program på programvare for totalt 11 diskret prøver analysert i den samme kjøre når du bruker et MSI-format. Analysere 10 urinprøver i tilfeldig rekkefølge etter en 84-panel narkotika blanding på screening cut-off injiseres nivå som første eksempel plassering for hver MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis kjøre.</li>
		<li>Angi den anvendt spenning å være 30 kV, patron temperatur 25 ° C, og total kjøretid skal 40 min. med tidsplanen gjelder en trykkgradient av 2 mbar/min fra 0 min 40 min under separasjon. Merk: En gradient trykket brukes under separasjon å tillate tilsettes langsom-migrering narkotika, som inkluderer noen svakt, grunnleggende benzodiazepiner og nøytral/syreholdig stoffer (f.eks, Paracetamol, barbiturater). Men overføre mest grunnleggende DoA og deres metabolitter som kasjoner innen 25 min, inkludert amfetamin, opioider og andre klasser av alkaloider.</li>
		<li>Når prøven oppkjøp er fullført, må du skylle av kapillær ved lave trykk (50 mbar) med BGE før neste dag. Ellers, skyll av kapillær for 600 s ved høyt trykk (900 mbar) med vann og deretter 600 s med luft, og lagre den i en sprøyta holder fram til neste bruk.</li>
	</ol></li>
	<li>Isocratic pumpe og skjede væske
	<ol>
<li>Bruke en uendelig Isocratic pumpe og en uendelig Degasser for å levere skjede væske (60: 40 MeOH:H2O med 0,1% v/v maursyre) med en hastighet på 10 µL/min til CE-MS sprøyta.</li>
	</ol></li>
	<li>TOF-MS innstillinger
	<ol>
<li>Kontroller at en TOF-MS, koaksial skjede-flytende electrospray ion kilde og oppvarmet nitrogen gass, er utstyrt med en CE-enheten.</li>
		<li>Operere TOF-MS under positivt ion oppdagelsen som varte en masse m/z 50-1700, med en datahastighet for kjøp av 500 ms/spektrum. Kontroller at både profilen og centroid data er lagret i et filformat med ".d".</li>
		<li>Angi electrospray ionization forhold skal: Vcap og munnstykke spenningsnivået 2000 V forstøveren gassen på 10 psi og tørking gass levert på 8 L/min ved 300 ° C, med en skjede gasstrømmen på 3,5 L/min på 195 ° C. I tillegg angi MS spenning innstillinger av fragmentor, skimmer og Oct1 RF 120, 65 og 750 V, henholdsvis. Merk: Vcap og munnstykke spenning, samt forstøveren gass ble slått av under føljetong eksempel injeksjon sekvensen i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis, men electrospray var programmert til å være slått tilbake på 1 min etter initiering av electrophoretic separasjon å hindre gjeldende feil på grunn av utsuging effekter.</li>
		<li>Utføre instrument kontroll og datafangst med leverandørens programvare (Tabell for materiale).</li>
	</ol></li>
	<li>Dataanalyse
	<ol>
<li>Analysere MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis dataene med leverandørens programvare, inkludert behandling, data utjevning, og integrering av utdraget ion electropherograms (EIEs) for representant DoA og deres metabolitter.</li>
		<li>Åpne programvaren og følgende parametere.<ol>
<li>Under chromatograms, velg utvinning dataformatog chromatogram og masse spektraldata format til profil -modus.</li>
			<li>Velg Kvadratiske/Cubic Savitzky Golay under utjevning funksjonen og funksjonen bredde 15 poeng.</li>
			<li>Klikk deretter Integrere (MS), angi integrator skal Agileog velg maksimalt antall topper grensen til de største 11 under topp filtrene.</li>
			<li>Klikk Vis, klikk integrering topp-listen, og velg toppen antall, tiden (RT), peak området, topp høydeog signal-til-støy-forhold (SNR).</li>
			<li>Lagre disse parameterne under en unik metodenavn. Bruk denne metoden til prosessen og tolke hvert datasett. Merk: En tabell med toppen antall, RT, peak området og høyde og SNR vises på høyre side. Utføre data normalisering for målte RT og integrert peak området for hver DoA til enten en tilsvarende d-er eller (hvis ikke tilgjengelig) til F-Phe å forbedre analytisk presisjon.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. analyse av urinprøver og eksterne kalibrering kurver
<ol><li>
Annen seriell injeksjon konfigurasjoner brukes i MSI-CE-MS
	<ol>
<li>Den første serielle eksempel injeksjon konfigurasjonen, brukes til å vise narkotika isomer/isobar oppløsning (figur 1A), sikre at fem gjentatt injeksjoner utføres på en blanding av 84 narkotika standarder med d-er og 4-F-Phe/Cl-Tyr, etterfulgt av en sjette injeksjon, som er et tomt utvalg i syntetisk urin, og fem ekstra injeksjoner av standard dopingtest blandingen.</li>
		<li>For andre serielle eksempel injeksjon konfigurasjonen, brukes til å vise påvisning av DoA i individuelle urinprøver fra pasienter med kjente resept (figur 2A), påse at første eksempel pluggen er en blanding av 84-stoff standard blanding på en 1 x cut-off screening nivå (positiv kontroll) etterfulgt av en randomisert injeksjon av 10 utvannet urinprøver fra pasienter: #293, #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, #183 og #50.</li>
		<li>For tredje føljetong eksempel injeksjon konfigurasjonen, brukes for å illustrere oppkjøpet av eksterne kalibrering kurver i en enkelt kjøre, sikre at calibrant løsninger for DoA tilberedes over en 20-fold lineær dynamiske område tilsvarer 0,25 x, 0.5 x, 1 x 2.5 x og 5 x cut-off konsentrasjon nivåer, sammen med matchende d-er og F-Phe/Cl-Tyr flere er i en syntetisk urin matrise (n = 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Products - Vital Statistics Rapid Release - Provisional Drug Overdose Data Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/drug-overdose-data.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/drug-overdose-data.htm</a> (2018)</li><li>Olfson, M., King, M., Schoenbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Young+People+With+Antipsychotic+Medications+in+the+United+States.">Treatment of Young People With Antipsychotic Medications in the United States.</a> JAMA Psychiatry. 72, 867-874 (2015).</li><li>Moeller, K. E., Kissack, J. C., Atayee, R. S., Lee, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Interpretation+of+Urine+Drug+Tests:+What+Clinicians+Need+to+Know+About+Urine+Drug+Screens.">Clinical Interpretation of Urine Drug Tests: What Clinicians Need to Know About Urine Drug Screens.</a> Mayo Clinic Proceedings. 92, 774-796 (2017).</li><li>Levy, S., Siqueira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committee+on+Substance+Abuse.+Testing+for+Drugs+of+Abuse+in+Children+and+Adolescents.">Committee on Substance Abuse. Testing for Drugs of Abuse in Children and Adolescents.</a> American Academy of Pediatrics. 133, e1798 (2015).</li><li>Pesce, M., Mikel, C., West, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+two+drug+testing+technologies:+GC-MS+and+LC-MS/MS.">A tale of two drug testing technologies: GC-MS and LC-MS/MS.</a> American Society of Interventional Pain Physicians. 13, 91-92 (2010).</li><li>Saitman, A., Park, H. -. D., Fitzgerald, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False-Positive+Interferences+of+Common+Urine+Drug+Screen+Immunoassays:+A+Review.">False-Positive Interferences of Common Urine Drug Screen Immunoassays: A Review.</a> Journal of Analytical Toxicology. 38, 387-396 (2014).</li><li>In Pursuit of Liquid Gold. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2017/12/27/business/urine-test-cost.html">https://www.nytimes.com/interactive/2017/12/27/business/urine-test-cost.html</a> (2017)</li><li>Wu, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+liquid+chromatography-high+resolution+mass+spectrometry+(LC-HR/MS)+in+clinical+toxicology.">Role of liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HR/MS) in clinical toxicology.</a> Clinical Toxicology. 50, 733-742 (2012).</li><li>Guale, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+LC-TOF-MS+Screening+for+Drugs,+Metabolites,+and+Collateral+Compounds+in+Forensic+Toxicology+Specimens.">Validation of LC-TOF-MS Screening for Drugs, Metabolites, and Collateral Compounds in Forensic Toxicology Specimens.</a> Journal of Analytical Toxicology. 37, 17-24 (2013).</li><li>Kaupilla, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+metabolites+and+drugs+of+abuse+from+urine+samples+by+desorption+electrospray+ionization-mass+spectrometry.">Rapid analysis of metabolites and drugs of abuse from urine samples by desorption electrospray ionization-mass spectrometry.</a> The Analyst. 132, 868-875 (2007).</li><li>Bynum, N. D., Moore, K. N., Grabenauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Laser+Diode+Thermal+Desorption-Tandem+Mass+Spectrometry+(LDTD-MS-MS)+in+Forensic+Toxicology.">Evaluation of Laser Diode Thermal Desorption-Tandem Mass Spectrometry (LDTD-MS-MS) in Forensic Toxicology.</a> Journal of Analytical Toxicology. 38, 528-535 (2014).</li><li>Kuehnbaum, N. L., Kormendi, A., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisegment+Injection-Capillary+Electrophoresis-Mass+Spectrometry:+A+High-Throughput+Platform+for+Metabolomics+with+High+Data+Fidelity.">Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry: A High-Throughput Platform for Metabolomics with High Data Fidelity.</a> Analytical Chemistry. 85, 10664-10669 (2013).</li><li>Nori de Macedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sweat+Metabolome+of+Screen-Positive+Cystic+Fibrosis+Infants:+Revealing+Mechanisms+Beyond+Impaired+Chloride+Transport.">The Sweat Metabolome of Screen-Positive Cystic Fibrosis Infants: Revealing Mechanisms Beyond Impaired Chloride Transport.</a> ACS Central Science. 3, 904-913 (2017).</li><li>DiBattista, A., Rampersaud, D., Lee, H., Kim, M., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Throughput+Screening+Method+for+Systematic+Surveillance+of+Drugs+of+Abuse+by+Multisegment+Injection-Capillary+Electrophoresis-Mass+Spectrometry.">High Throughput Screening Method for Systematic Surveillance of Drugs of Abuse by Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 89, 11853-11861 (2017).</li><li>Cao, Z., Kaleta, E., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantitation+of+78+Drugs+and+Metabolites+in+Urine+with+a+Dilute-And-Shoot+LC-MS-MS+Assay.">Simultaneous Quantitation of 78 Drugs and Metabolites in Urine with a Dilute-And-Shoot LC-MS-MS Assay.</a> Journal of Analytical Toxicology. 29, 335-346 (2015).</li><li>Drouin, N., Rudaz, S., Schappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Supported+Liquid+Membrane+for+Electromembrane+Extraction+of+Polar+Basic+Endogenous+Metabolites.">New Supported Liquid Membrane for Electromembrane Extraction of Polar Basic Endogenous Metabolites.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 159, 53-59 (2018).</li></ol>

Forfatterne avsløre en US patent (PCT/CA2014/050454) på MSI-CE-MS som en multiplex screening plattform og data arbeidsflyt for kjemiske analyser.

Vanlig brukt kromatografiske separasjoner er vanligvis avhengige av en enkelt prøve injeksjon per kjørt, som etterfølges av en gradient tilsettes for å løse komplekse narkotika blandinger og justering av kolonnen. Disse kravene fundamentalt begrense utvalg ytelse og plikt syklus selv når du bruker optimal kolonnen bytte programmer. I denne sammenheng, høyt volum urin drug analyse for arbeidsplassen, toksikologi eller terapeutiske overvåking programmer av GC--MS-/ MS og stadig, LC--MS-/ MS er dermed utføres parallelt, men brukes fortrinnsvis som et andre lag eller bekreftende teste når nødvendig (dvs., juridiske eller medisinske sammenheng). Dette er på grunn av mye høyere investeringer og driftskostnader, samt komplikasjoner med dataanalyse når sammenligne analyserte på flere instrumental plattformer innen akkreditert laboratorium prøver. Resultatet fortsatt immunanalyser Hovedmetode for rutinemessig narkotikarelaterte screening tross utsatt for falske positiver og USANN-negativer blant mange narkotika klasser, med begrenset tilgang til antistoff reagenser for nye syntetiske medikamenter. Tidligere studier har vist at multiplex separasjoner basert på MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis tilbyr en enkel løsning for å forbedre utvalget gjennomstrømningen til en størrelsesorden. I tillegg gir denne tilnærmingen for design av romanen data arbeidsflyter for biomarkør oppdagelsen med høy kvalitet basert på gjennomførelsen effektiv satsvis og kvalitetskontroll12,13,14. Men forkorter innføringen av 10 eller flere serielle etter injeksjoner i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis den effektive kapillære lengden forpliktet til høy effektivitet separasjoner, noe som kan kompromittere selektivitet når du analyserer DoA og deres metabolitter i menneskelige urin.
Her, innført vi en electrokinetic injeksjon av BGE etter hver etter eksempel injeksjon, slik at avstanden utnytter full kapillær lengden (120 cm), dermed forbedre oppløsningen på stoffet Isobarene/isomerene ved full-scan datainnsamling av TOF-MS (figur 1A). I forhold til en siste rapport14oppnås bedre oppløsning for flere viktige isobar/isomere DoA og deres metabolitter, som er kritisk når screening for store narkotika paneler. For eksempel ble oppløsningen for flere viktige strukturelle/funksjonelle gruppen isomerene realisert, inkludert tre analoge opioider narkotika/metabolitter (figur 1B), to urelaterte opioider Isobarene (figur 1 c) og to metamfetamin posisjonelle isomerene (figur 1 d). I alle tilfeller er eksempel carry-over fra føljetong injeksjon av ulike calibrant løsninger innen samme kjøre ikke betydelig som bekreftes av en negativ urin kontroll/tom. I tillegg forbedret oppløsning er også innsett for flere kryss-forstyrrelser med visse d-ISs med isobar narkotika panelet, som cotinine-d3 og 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA), EDDP-d3 og imipramin, norfentanyl-d5 og Ketamin, kodein-d6 og sertraline, og kokain-d3 og zolpidem. Dette resultatet er utvidet til andre isobar forstyrrelser narkotika panelet som var bedre løst i denne studien (f.eksnoroxycodone/oxymorphone, normeperidine/metylfenidat), samt store bakgrunn urin forstyrrelser (f.eks , i kildekode fragmentere ioner av creatinine med amfetamin)14. Tilgang til to ortogonale parametere å tilfredsstille antatte identifisering av en bestemt DoA er faktisk avgjørende for å redusere false-positiv på grunn av isobar forstyrrelser, nemlig nøyaktig masse kombinert med comigration med d-ISs. Også gjenkjenning av ett eller flere biotransformed metabolitter av overordnede innenfor samme prøven, som hydroxylated, demethylated eller intakt glucuronide narkotika conjugate(s), legger ytterligere tillit mot narkotika identifikasjon mens utvide vinduet for gjenkjenning.
Anbefalte cut-off nivåene for urin narkotikarelaterte screening varierer for ulike klasser av DoA (alt fra 50 til 1000 ng/mL) avhengig av farmakokinetikken, toksisitet, og bakgrunnen forstyrrelser, for å redusere metoden bias basert på retningslinjer fra Rusmiddelmisbruk og psykiske tjenester administrasjon (SAMHSA)14. Potensialet for MSI-CE-MS å oppdage og identifisere ulike klasser av DoA direkte i urin med minimal eksempel forbehandling ble brukt til en gruppe klinisk deprimerte pasienter med kjente resept posten. Definitive identifikasjon av metadon (reseptbelagte), amfetamin (nonprescribed/ulovlig), venlafaxine (reseptbelagte) og pregabalin (reseptbelagte) i utvannet, men nonhydrolyzed, urinprøver ble demonstrert ved MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis. Den var basert på en direkte sammenligning av et medikament oppdaget i en bestemt injeksjon posisjon i forhold til 84-stoff blandingen i første eksempel stilling ved de anbefalte screening cut-off nivå som fungerer som en intern referanse/QC og positiv kontroll (Figur 2). Også absolutt medikamentfri kvantifisering er mulig ved hjelp av eksterne kalibrering kurver (Figur 3) basert på ion svar forholdet målt for et stoff i forhold til sin d-er. I motsetning til mest brukt kromatografiske separasjoner, det er ingen deuterium effekt påvirker overføring tid forskjellene mellom en d-er og dens nondeuterated narkotika siden de har tilsvarende electrophoretic mobilities i gratisløsning CE. Migrasjon virkemåten til DoA er faktisk nøyaktig modellert i CE, basert på deres grunnleggende mekanisk-egenskaper/kjemisk struktur, nemlig molekylær volum og effektiv kostnad (pKen)14. Siden mange legemidler gjennomgår også betydelige sekundære metabolisme før utskillelse i urin (f.eksmorfin glucuronide), screening cut-off nivåer krever justering som deres konsentrasjonene er lavere enn forventet sammenlignet metoder som bruker enzym hydrolyse for totale gjenkjenning. En stor fordel av "fortynne-og-shoot" urin narkotikatesting, i tillegg til å redusere kostnader/tid, prøve-håndtering, og en potensielle skjevhet eller satsvis variasjoner på grunn av ufullstendige enzym hydrolyse, er at presumptive skjermen-positive tilfeller blir ytterligere bekreftet av den gjenkjenning av ett eller flere relaterte narkotika metabolitter i samme utvalget. Dette gir også dypere innsikt i stoffet farmakokinetikken og optimal dosering krav for individuelle pasienter samtidig forbedre gjenkjenning for "rask" metabolizers eller foreskrevet/illegale rusmidler med korte halv-liv. I tillegg comigration med tilsvarende d-spiller to viktige funksjoner for pålitelig narkotikarelaterte screening når bruker MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis, nemlig den identifiserer nøyaktig utvalg injeksjon posisjon (dvs., pasient #) mens også korrigerer for forskjeller i ion svar/injeksjon volumer for forbedret presisjon og nøyaktighet.
Fremtiden fungere som mål å utvikle tilpasset programvareverktøy å Letter automatisert databehandling av multiplex separasjoner koplet til HRMS som kreves for høyt volum urin-narkotikatesting med QC/QA. Strenge validering av MSI-CE-MS for bredspektret screening av DoA vil også bli undersøkt en større kohort av høy-risiko pasienter for å objektivt vurdere foreskrevet narkotika etterlevelse og potensielle misbruk/substitusjon som kan kompromittere behandling effekt, pasientens sikkerhet eller psykiatrisk evaluering/diagnose. En supplerende analyse av Sure/anionic klasser av DoA og deres metabolitter vil også bli fremført av MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis under alkaliske forhold med negative ion modus gjenkjenning som kreves for omfattende screening av naturlige/syntetisk cannabinoider. Dette er viktig gitt truende folkehelsen implikasjonene av legalisering av marihuana rekreasjons over Canada og flere amerikanske stater. En stor fordel av full skanning datainnsamling av TOF-MS er at retrospektiv av prøver kan utføres selv når urin prøver er ikke lenger tilgjengelig for oppfølging testing, mens andre livsstil eller kosthold eksponeringer kan bli vurdert bedre forstå differensial Svar å bedøve terapi. I sammendraget tilbyr rask men presis narkotika overvåking metode av MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis betydelige fordeler til konvensjonelle målrettet immunanalyser, samt direkte infusjon/ambient ionisering--MS-/ MS metoder som er utsatt for forstyrrelser/bias ved løsing utvidet paneler DoA og deres metabolitter i komplekse biologiske prøver inkrementelle kostnader.

En alarmerende økning i misbruk av og avhengighet til opioider for behandling av kroniske smerter representerer en økende trussel mot folkehelsen, med over 70 000 overdosedødsfall i USA i 20171. Tilsvarende er ulike andre psykotrope medikamenter også mye foreskrevet til barn og unge voksne for behandling av angst, depresjon og psykiske problemer2. Urin narkotikatesting metoder, mye utviklet for arbeidsplassen og rettsmedisinske toksikologi, er resultatet av avgjørende betydning for den terapeutiske overvåking av foreskrevet medisiner som er utsatt for toleranse og avhengighet3,4. Dette er nødvendig for å sikre overholdelse, optimal terapeutiske effekten og pasientsikkerhet, mens avsløre potensielle substitusjon, inkludert ulovlig eller nonprescribed rusmiddelmisbruk. Foreløpig urin narkotikatesting for DoA stole på en to lagdelt tilnærming, bestående av et innledende konkurransedyktig immunanalyse skjermen via point-of-care enheter eller laboratorium analyserer, etterfulgt av en bekreftende test med større spesifisitet er basert på GC--MS-/ MS og stadig, LC--MS-/ MS5. Men er immunanalyser utsatt for bias, som antistoff reagenser binde nonspecifically til ulike narkotika klasser til å generere en presumptive skjermen-positive resultatet, som hindrer en pålitelig ID og kvantifisering av spesifikke medikamenter eller komplekse narkotika blandinger6. I denne sammenheng mer nøyaktig urin-narkotikatesting trengs haster gitt den ublu kostnadene ved omfattende blandingsbruk skjermbilder,7 inkludert syntetiske medikamenter og syntetisk urin produkter som unnvike konvensjonelle målrettet analyser.
Høy effektivitet separasjoner i forbindelse med høy oppløsning MS (HRMS) bruker TOF eller orbitrap masse analyserer foreslått som en nontargeted strategi for narkotikaovervåking i en tid med polypharmacy og utvide paneler DoA8,9 . Men er konvensjonelle LC separasjoner treg (> 15 min) på grunn av lang elueringsrør tider for oppløsning av kjemisk ulike klasser av DoA og deres metabolitter i gradient elueringsrør-programmer, som begrenser utvalget gjennomstrømmingen for rutinemessig narkotikarelaterte screening. Alternativt, direkte analyse baseres på desorpsjon ionization (tegning)10 og laser diode termisk desorpsjon (LDTD) tillater raskere narkotikarelaterte screening uten separasjon11. Men er metodene ambient ionisering utsatt for isobar/isomere forstyrrelser når analysere komplekse urin prøver, dermed krever uavhengig bekreftende testing.
Vårt laboratorium har nylig utviklet en multiplex separasjon plattform for å øke utvalg ytelse samtidig beholde oppløsning og data gjengivelsen av en høy effektivitet separasjon basert på MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis12. Romanen data arbeidsflyter kan være utformet på MSI-CE-MS for nontargeted metabolitten profilering (dvs.metabolomics) av volum-begrenset biospecimens, mens kvalitetskontroll (QC) tillater for satsvis korreksjon som kreves for store befolkning studier13. I dette tilfellet utføres separasjoner ved hjelp av en isocratic buffer med stoff ionisering oppstår under stabil løsemiddel forhold når du bruker en konvensjonell skjede flytende grensesnitt, som gir føljetong injeksjoner av 10 eller flere prøver i ett kjøre rask men selektiv screening av ulike klasser av DoA og deres metabolitter14. Fokus for denne studien er å ytterligere validere MSI-CE-MS for direkte analyse av autentisk urinprøver fra en representant kohort av klinisk deprimerte pasienter med en "fortynne-og-shoot" metode som kontorplass enzym hydrolyse15. I tillegg gjennomføringen av en electrokinetic mellomrom mellom føljetong eksempel plugger i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis16 ble utført ytterligere forbedre oppløsningen på forskjellige narkotika isomerene/Isobarene, bakgrunn urin forstyrrelser, og/eller Cross-forstyrrelser når screening store paneler av DoA. Den absolutte kvantifiseringen av DoA i urin prøver når bruker matchende deuterated interne standarder (d-er) er demonstrert ved MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis. Denne tilnærmingen også forenkler narkotika identifikasjon, samt deducing riktig utvalg plasseringen av skjermen-positive tilfeller i forhold til en narkotika-panelet blanding på de anbefalte screening cut-off nivå som også fungerer som en intern referanse/QC innen samme løp.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7100 Capillary Electrophoresis System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G7100A</td>
			<td>CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G6230B</td>
			<td>HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE-ESI-MS Sprayer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G1603A</td>
			<td>CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G1310B</td>
			<td>Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>--</td>
			<td>Software used for control of CE-MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>--</td>
			<td>Software used for processing of CE-MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortix Capillary Cutter</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>5813-4620</td>
			<td>Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Window Maker</td>
			<td>Microsolv Inc.</td>
			<td>07200-S</td>
			<td>Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused-silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies Inc.</td>
			<td>TSP05375</td>
			<td>Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)</td>
			<td>Cerilliant Inc.</td>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput and comprehensive drug surveillance using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry

Nye analytiske metoder er sterkt behov for å aktivere høy gjennomstrømming, men likevel omfattende narkotikarelaterte screening, gitt en alarmerende opioid- og reseptbelagte stoffet krise i offentlig helse. Konvensjonelle urin narkotikatesting basert på en to-lags immunanalyse skjermen etterfulgt av en gass kromatografi-tandem massespektrometri (GC-MS/MS) eller flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) metoden er dyre og utsatt for skjevhet samtidig begrenset til målrettet paneler av kjente narkotiske stoffer (DoA). Her, skissere vi en bedre metode for narkotikaovervåking som tillater for oppløsning og oppdagelsen av en utvidet panel av DoA og deres metabolitter ved multisegment injeksjon-kapillære geleelektroforese-massespektrometri (MSI-CE-MS). Multiplekset separasjoner av ti urinprøver med en kvalitetskontroll av CE (< 3 min/sampling) sammen med full skanning datainnsamling bruker time of flight-masse spectrometer (TOF-MS) under positivt ion mode Gjenkjenningsmerknad tillater identifikasjon og kvantifisering av DoA ovenfor anbefalte cut-off nivåer. En utmerket løsning stoffet isomerene og Isobarene, inkludert bakgrunn forstyrrelser, oppnås når du bruker MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis med en electrokinetic mellomrom mellom eksempel segmenter, hvor nøyaktig masse/molekylære formel med comigration av en matchende deuterated interne standard og gjenkjenning av ett eller flere bio-forvandlet metabolitter lette DoA identifikasjon over et bredere oppdagelsen vinduet. I tillegg kan urinprøver analyseres direkte uten enzymet deconjugation for rask screening uten komplisert eksempel workup. MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis aktiverer overvåking av et bredt spekter av DoA som kreves for behandling overvåking av høy-risiko pasienter, inkludert bekrefter foreskrevet narkotika etterlevelse, avslørende illegale bruk/substitusjon og vurdere optimal dosering regimer nødvendig for nye fremskritt i presisjon medisin.

MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis gjør føljetong injeksjon av ti eller flere separate prøver i et enkelt løp, som forbedrer gjennomstrømning (< 3 min/sampling) uten kompliserte instrumental modifikasjoner, kolonnen-svitsjing programmer eller kostbare infrastruktur investeringer (figur 1A). En vekslende rekke etter injeksjoner av prøven og electrokinetic distansestykke BGE utføres innenfor en uendret smeltet silica kapillær, der sonal electrophoretic separasjoner ioner oppstå under sterkt surt elektrolytt forhold (pH 1.8). stoff ionisering oppstår også under steady-state-betingelser. I dette tilfellet brukes en koaksial skjede væske, med en masse calibrant, som et grensesnitt for CE-MS under positivt ion modus gjenkjenning med minimal ion undertrykkelse eller forbedring effekter som overvåkes av masse calibrant ioner signalet. TOF representerer en robust men kostnadseffektive HRMS med en rask datainnsamling ideell for nontargeted screening/stoffet overvåking programmer når du bruker MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis. Imponerende oppløsning oppnås for eksempel for ulike isobar/isomere DoA og deres metabolitter, inkludert strukturelle en tre opioider strukturelle isomerene, nemlig norhydrocodone, hydromorphone og morfin (figur 1B). I dette tilfellet løst 30 peaks 10 uavhengig prøver av en narkotika-blanding oppdages uten eksempel bære-over. En syntetisk urin tom/negative urin kontroll er også inkludert i seriell injeksjon serien (prøve posisjon #6). Også er to andre isobar opioider, nemlig 6-acetylmorphine (en inaktiv heroin metabolitten) og naloxon (en opioid reseptor antagonist brukes for akutt behandling av opioidoverdoser) fullt løst som 20 forskjellige topper med full skanning data oppkjøp ( Figur 1 c). Tilsvarende løses to amfetamin posisjonelle isomerene fullt i MSI-CE-MS for å skille illegale metamfetamin misbruk fra potensielle misbruk av phentermine, en foreskrevet stimulerende som brukes som en appetitt suppressant for vekttap.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig1.jpg"> Figur 1: en rekke utdraget ion electropherograms (EIE) for representant DoA isomerene/Isobarene som løses av MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis ved å analysere ti eksempler og en tom i et enkelt løp. (A) skjematisk av MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis som viser føljetong injeksjon konfigurasjonen brukes for en 84-DoA panel i syntetisk urin. Denne multiplex separasjon metoden bruker en vekslende rekke etter injeksjoner av 11 diskret prøver og tom med en electrokinetic injeksjon av en buffer til å starte sonal electrophoretic separasjon av ioner, etterfulgt av en full skanning data oppkjøpet av TOF-MS med positivt ion modus gjenkjenning. (B) tre isobar funksjonsgruppe opioider isomerene (m/z 286.1438), adskilt av CE, bestående av 30 løst peaks 10 diskret eksempel injeksjoner, inkludert norhydrocodone, hydromorphone og morfin. (C) to isobar opioider og deres metabolitter (m/z 328.1543), adskilt av CE, bestående av 20 løst peaks 10 diskret eksempel injeksjoner, inkludert 6-acetylmorphine (heroin metabolitten) og naloxon. (D) to isobar funksjonsgruppe amfetamin isomerene, atskilt av CE, bestående av 20 løst peaks 10 diskret eksempel injeksjoner, inkludert metamfetamin og phentermine. I alle tilfeller hadde negative urin kontroller/mellomrom introdusert på den sjette prøveposisjon i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis ubetydelig bevis for eksempel bære-over. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Til skjermen DoA, en seriell injeksjon konfigurasjon i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis brukte en 84-stoff panelet blanding på de anbefalte screening cut-off konsentrasjon nivåer (som første injeksjon plasseringen for alle tekster) etterfulgt av en randomisert analyse av 10 representant urin prøver fra klinisk deprimerte pasienter med en kjent resept historie. For eksempel, en positiv screening testresultatet for metadon (m/z 310.2165) fra pasient #208 (figur 2A) er utledet av gjenkjenning av en stor signal topp (som stammer fra injeksjon #9) som comigrates med metadon-d3 med lav masse feil (< 5 ppm). Ingen andre signaler oppdages i noen andre urinprøver innen samme kjøre. Metadon konsentrasjon overskrider 13 x anbefalte cut-off grensen når sammenlignende målt ion svar forholdet i prøven (injeksjon #9) med referanse stoff blanding/QC (injeksjon #1) og rettes opp ved en firedobbelt fortynningsfaktoren for urin. Dermed bekrefter dette resultatet pasientens tilslutning til metadon vedlikehold terapi. Bevis av nonprescribed amfetamin (figur 2B) vises etter forhøyet amfetamin (m/z 136.1121) som ble bare oppdaget i en pasient (pasient #50, i injeksjon #11) innen MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis kjøre. Målt konsentrasjonen litt overskredet anbefalte cut-off nivåer (1,3 x). Dette comigrates med amfetamin-d5 hadde en lav masse feil med en topprangerte molekylære formel kamp. Et positivt testresultat for antidepressant venlafaxine (m/z 278.2115), en selektive serotonin-noradrenalin reopptakshemmere, er også vist i pasient #281 (injeksjon #6). I dette tilfellet konsentrasjonen overskrider anbefalte cut-off nivåer (15 x), dette er identifisert av sin nøyaktig masse - eller molekylære formel-match, sammen med comigrating venlafaxine-d6 (figur 2C). Sistnevnte vilkåret ikke er oppfylt for en ukjent isobar som også oppdaget i EIE spor, som fremhever behovet for forsiktig når stole utelukkende på sin nøyaktig masse. Også definitive gjenkjenning av foreskrevet pregabalin, som er foreskrevet for behandling av nevropatisk smerte, samt generalisert angst, er også demonstrert for pasienten #309, basert på grovt opphøyet konsentrasjonen (64 x) over de anbefalte Cut-off nivåer (figur 2D). Det er imidlertid ikke oppdaget i de ni andre pasienten urinprøver analysert i samme kjøre. I likhet med andre skjermen-positive tilfeller, injeksjon #4, comigrates med pregabalin-d6, som er inkludert i alle urinprøver analysert av MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig2.jpg"> Figur 2: en rekke utdraget ion electropherograms (EIE) for representant skjermen-positive urin dopingtest resultater fra en kohort av 10 klinisk deprimerte pasienter som bekreftet når bruker MSI-CE-MS, som inkluderer en 84-stoff panel på anbefalt Cut-off nivå, injisert som første eksempel injeksjon posisjon som intern referanse/QC. (A) EIE overlegg tilsvarer metadon-d3, som comigrates med metadon, utheving at bare en urinprøve (injeksjon posisjon #9) forhøyede metadon konsentrasjoner langt overskrider cut-off nivået. (B) EIE overlegg tilsvarer amfetamin-d3, som comigrates med amfetamin, utheving at bare en urinprøve (injeksjon posisjon #11) forhøyede konsentrasjoner over cut-off nivåer. (C) EIE overlegg tilsvarer venlafaxine-d6, som comigrates med venlafaxine, utheving at bare en urinprøve (injeksjon posisjon #6) forhøyede konsentrasjoner over cut-off nivåer. (D) EIE overlegg tilsvarer pregabalin-d6, som comigrates med pregabalin, utheving at bare en urinprøve (injeksjon posisjon #4) forhøyede grovt konsentrasjoner overstiger cut-off nivåer. Alle urinprøver ble analysert rett etter en femdoblet fortynning i deionisert vann sammen med tillegg av en tilsvarende d-(når tilgjengelig). En skjerm-positive resultatet i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis tilsvarer et stoff som comigrates med d-ISs med en lav masse feil (< 5 ppm) og den riktige molekylære formelen, som konsentrasjon overskrider cut-off som analysert i samme løp som intern referanse/QC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Absolutt kvantifiseringen DoA og deres metabolitter oppnås også ved MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis basert på eksterne kalibrering kurver, bruker referanse calibrant standarder for DoA som følger raskt i et enkelt løp. For eksempel den serielle fortynning av en 84-stoff calibrant blanding med en matchende d-er på en fast konsentrasjon gir en pålitelig kvantitativ analyse i komplekse urinprøver. Dette kompenserer for potensielle matrix-indusert ion undertrykkelse eller ekstrautstyr, men også for variasjoner i injeksjon volumet i kapillær mellom utvalgene. I tilfeller når en samsvarende d-er er kommersielt tilgjengelig eller kostnadseffektive uoverkommelige for visse DoA, et surrogat er brukes for data normalisering, som en d-er fra samme stoffet klasse eller en syntetisk sammensatte ikke funnet i urin (F-Phe), som vist tidligere 14. representant EIEs og eksterne kalibrering kurver for Oksykodon vises i figur 3A, B. og for citalopram i Figur 3 c, D. Dette er vidt foreskrevet smertestillende og Antidepressiva, henholdsvis med mulig. Relativ ion svar forhold til deres matchende d-er måles. I dette tilfellet en seriell injeksjon konfigurasjon i MSI-CE-MS, som består av fem ulike calibrants, analyseres i duplikat i et enkelt løp sammen med en syntetisk urin tomt. Samlet, god linearitet (R2 > 0.990) over en 20-fold konsentrasjon området ble oppnådd med tilstrekkelig sensitivitet for påvisning av DoA og deres metabolitter (dvs., kationisk alkaloider) 84-stoff panelet 14. i alle tilfeller narkotika metabolitter oppdages som deres protonerte molekylær ion [MH+] over deres screening cut-off begrenser (> 50 ng/mL), med unntak av visse Sure/nøytral legemidler som har en dårlig ionisering effektivitet under den positivt ion-modus, som cannabinoider (f.eksTHC-COOH), barbiturater (f.ekssecobarbital) og carbamates (f.ekscarisoprodol).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig3.jpg"> Figur 3: en rekke utdraget ion electropherograms (EIE) for kvantifisering av representant DoA. Dette gjøres ved å generere eksterne kalibrering kurver basert på deres relative ion svar forhold med en matchende d-er over en 20-fold lineær dynamiske område. (A) kopiere injeksjon av en fem-punkts kalibrering kurve for Oksykodon calibrants Oksykodon-d3 og en tom. (B) eksterne kalibreringskurven for Oksykodon, følge lineær regresjon å utlede følsomhet (stigningstallet) og linearitet (R2), med feilfelt som representerer ±1σ (n = 4). (C) kopiere injeksjon av en fem-punkts kalibrering kurve for citalopram calibrants, citalopram-d6 og en tom. (D) eksterne kalibreringskurven for citalopram, følge lineær regresjon å utlede følsomhet (stigningstallet) og linearitet (R2), feil barer representerer ±1 SD (n = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry at JoVE.com

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Her beskriver vi en høy gjennomstrømming metode for omfattende narkotikaovervåking som tillater for bedre oppløsning og påvisning av store paneler av misbruk og deres metabolitter, med kvalitetskontroll basert på multisegment injeksjon-kapillære geleelektroforese-massespektrometri.

Høy gjennomstrømming og omfattende narkotika overvåkning bruker Multisegment injeksjon-kapillære geleelektroforese massespektrometri

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Nåværende strategier for en urin narkotika screening er dyrt å utføre for rutinemessig analyse av stadig større paneler av narkotika misbruk som kreves for arbeid sted testing, samt terapeutiske narkotika overvåking applikasjoner. I tillegg er metoder basert på aminoanalyser utsatt for bias og er til slutt begrenset til målanalyse av kjente legemiddelpaneler. Den største fordelen med vår metode, som kalles MSI-CE-MS, er at det gjør det mulig for rask screening av et ubegrenset legemiddelpanel og deres metabolitter med høy nøyaktighet og minimal prøvearbeid.Det er et presserende behov for en høy gjennomstrømning og rimelig screeningmetode for å forbedre pasientutfallet ved å bekrefte overholdelse og optimalisere narkotikadoseringsregimer, samtidig som det avslører ulovlig narkotikabruk. Denne multipleksede separasjonsplattformen kan brukes på en rekke andre forskningsområder knyttet til målrettet eller ikke-målrettet metabolittprofilering i komplekse biologiske prøver. Begynn med tining avidentifisert morgen urinprøver samlet inn fra pasienter med en kjent reseptbelagte stoffet historie for minus 80 grader Celsius lagring på is og vortexing de tinte prøvene i 30 sekunder.Deretter sediment prøvene ved sentrifugering og kombinere tre 10 mikroliter aliquots av hver prøve med 10 mikroliter av deuterated interne standarder, fem mikroliter av en 4-fluor-L-fenylalanine og 3-klor-L-tyrosin løsning og 25 mikroliter av deionisert vann. Sentrifuger deretter blandingene i ett minutt og overfør 20 mikroliter av hver prøve til individuelle polypropylen hetteglass. For å stille inn de ubestrøkede, smeltede silikakapillærkondisjoneringsparametrene, kutt en 135 centimeter lang, 50 mikrometer indre diameter og 360 mikrometer ytre diameter kapillær fra en spole.Bruk en kapillær vindusmaker til å fjerne ca 7 millimeter polyamidbelegg fra begge ender av hver kapillær. Deretter installerer kapillærinntakene i kapillærelektroforesen, eller CE-patronen, ved å loope hver kapillær i to 360 graders svinger, og vær forsiktig med å stikke ut omtrent to millimeter av kapillæruttakene ut av CE-sprøytenål. Når alle kapillærene er installert, må du forsiktig laste CE-kassetten inn i CE-systemet og oppbevar CE-sprøyten ut av i ionkilden.Plasser flytende kromatografi, eller LC-sprøyter, i iionkilden og velg flush i systemets programvare for å sette opp kapillærkondisjoneringen. Still inn varigheten av metanol, en molarnatriumhydroksid, deionisert vann og bakgrunnselektrolytt i flukt til 30 minutter per flush og plasser isokratisk pumpe i standby i kapillærkondisjoneringsperioden. Etter siste flush, rengjør kapillær elektroforese massespektrometer, eller CE-MS sprøyter, og CE elektrode med metanol gjennomvåt kluter.Rengjør CE-MS-grensesnittet med en en til en isopropanolvannsløsning for å fjerne eventuelle gjenværende saltavleiringer. Bytt ut LC-sprøyten med den rengjorte CE-MS-sprøyten og et nylig balsamert kapillær i det koaksiale hylsevæskegrensesnittet. Slå deretter på isokratisk pumpe og bruk en spenning på 30 kilovolt i 15 minutter for å sikre at en stabil CE-strømprofil oppnås før urinanalysen.I systemprogramvaren velger du forutsetninger, angir flushen til 600 sekunder og angir en bakgrunnselektrolyttfilposisjon. Sett injeksjonen til hydrodynamisk injisere prøvene på 100 millibar i fem sekunder og å elektrokinetisk injisere bakgrunnen elektrolytt avstandsstang på 30 kilovolts i 75 sekunder. Still inn den påførte spenningen til 30 kilovolt, patrontemperaturen til 25 grader Celsius, og den totale kjøretiden til 40 minutter.Deretter, ved hjelp av timeplanen, bruke en trykkgradient på to millibar per minutt fra null til 40 minutter under separasjonen. Når prøveoppkjøpet er fullført, skyll kapillæren ved 50 millibar trykk med bakgrunnselektrolytter over natten mens kapillæren er i CE-sprøyten i iionkilden. Angi at TOF-MS-positiviondeteksjon skal dekke et masse-til-lade-forhold på 50 til 1 700, med en datainnhentingshastighet på 500 millisekunder per spektrum, og bekreft at både profilen og centroid-dataene er lagret i D-filformat.Sett elektrosprayioniseringsforholdene til kapillær og til dysespenninger på 2000 volt hver, forstøvergassen til 10 pounds per kvadrattomme, og tørking gassleveringen til åtte liter per minutt ved 300 grader Celsius med en kappegassstrøm på 3,5 liter per minutt ved 195 grader Celsius under oppkjøpet. Sett deretter MS-spenningsinnstillingene til fragmenteren, skimmeren og oktastangen én radiofrekvens til henholdsvis 120, 65 og 750 volt, og sett instrumentkontroll- og datainnsamlingsparametrene i henhold til utformingen av eksperimentet. Åpne CE-MS-dataene med flere segmenter i systemprogramvaren for dataanalyse.Under kromatogrammer angir du ekstraksjonsdataene og kromatrammet og massespektraldataformatene til profilmodus. Under utjevning velger du kvadratisk kubikk Savitzky-Golay og setter funksjonsbredden til 15 poeng. Klikk deretter Integrer MS og sett integratoren til smidig.Under toppfiltre setter du maksimalt antall topper til 11. Klikk på topplisten for integrering under visning, og velg toppnummer, oppbevaringstid, toppområde, topphøyde og signal-til-støy-forhold. Lagre deretter parameterne under et unikt metodenavn og bruk metoden på prosessen for tolkning av hvert datasett.I denne representative analysen av ulike isobariske inoeiske legemidler av misbruk og deres metabolitter, ble 30 løste topper fra 10 uavhengige prøver av en legemiddelblanding oppdaget uten prøveoverføring. To andre isobariske opioider kan løses fullt ut som 20 forskjellige topper med full skanning datainnsamling. Tilsvarende ble to amfetaminposisjonelle isomer fullstendig løst i denne multi-segment CE-MS-analysen, for å skille ulovlig metamfetaminmisbruk fra potensiell misbruk av phentermine, et foreskrevet sentralstimulerende middel som brukes som en appetitt suppressant for vekttap.I denne representative analysen av legemiddelscreening ble et positivt screeningtestresultat for metadon utledet ved påvisning av en stor signaltopp som gikk sammen med metadon-d3-toppen med lav massefeil. Ingen andre signaler ble påvist i andre urinprøver i samme løp, og den påviste metadonkonsentrasjonen oversteg 13 ganger den anbefalte cutoff-grensen sammenlignet med det målte ionresponsforholdet i prøven og korrigert av en fire ganger urinfortynningsfaktor, som bekrefter at pasientene overholder metadonvedlikeholdsbehandling. Her ble en seriell injeksjonskonfigurasjon i multisegment CE-MS, bestående av fem forskjellige legemiddelkalibranter, analysert i duplikat i løpet av ett enkelt løp sammen med den syntetiske urinen tom.Stoffet metabolitter ble oppdaget som deres potenated molekylære ioner over deres screening cutoff grenser. Etter denne prosedyren kan et stort antall polare og ioniske metabolitter i urin også analyseres av MSI CMS til støtte for oppdagelsesbasert metabolsk forskning. I tillegg kan omfattende overvåking av et bredt spekter av eksogene stoffer og deres metabolitter oppnås, inkludert ikke-foreskrevne medisiner og ulovlige stoffer utsatt for misbruk.Denne optimaliserte metoden kan også brukes til rutinemessig å screene andre stoffer av misbruk. Dette kan være cannabis eller alkohol metabolitter og vår metode kan også skille mellom en syntetisk eller en falsk urin matrise og en naturlig, ekte, autentisk donert urinprøve også. Husk å alltid være forsiktig når du arbeider med biologiske væsker.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Rapid høy gjennomstrømning Amylose Bestemmelse i Freeze Tørket potet Tuber Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analysere Protein Dynamics Bruke Hydrogen Exchange-massespektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Forbedret i-gel reduktiv β-eliminering for Comprehensive O-forbundet og sulfo-glycomics ved massespektrometri

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

Analyse av flyktige og oksidasjon Sensitive Forbindelser hjelp av en kald Inlet System og Electron Impact massespektrometri

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Deacetylering Analyser å greie samspillet mellom sirtuins (SIRT2) og spesifikt protein-substrater

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Rapid Høy throughput Arter Identifikasjon av Botanisk Material Bruke direkte analyse i Real Time High Resolution massespektrometri

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...