Name: high-throughput and comprehensive drug surveillance using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry
Uploaded: 2019-04-23T12:30:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry at JoVE.com

P.B.M. vill erkänna finansieringsstöd från naturvetenskap och Engineering Research Council of Canada, Kanada Stiftelsen för Innovation, Genome Canada och McMaster University. Författarna tackar Howard Lee på Seroclinix Corporation och Dr. Marcus Kim från Agilent Technologies för deras insiktsfulla diskussioner. Dessutom bekräftar författarna Dr Zainab Samaan från psykiatri och beteendevetenskap vid McMaster University och humör sjukdom kliniken vid St Joseph's Hospital för åtkomst till deidentified patientens urinprover som används i denna studie .

Blindad urinprov var vänligen tillhandahållen av Dr Zainab Samaan från humör sjukdom kliniken vid St Joseph's Hospital (Hamilton, ON, Kanada), vars studie godkändes av Hamilton integrerad forskning etikprövningsnämnd.
1. reagenser och lösningar provberedning
<ol><li>
Bakgrunden elektrolyt förberedelse
	<ol>
<li>Förbereda 50 mL bakgrund elektrolyt (BGE) varannan vecka, 1 M myrsyra, pH 1.8, med 15% v/v acetonitril som en organisk modifierare.</li>
		<li>Alikvotens 1,9 mL koncentrerad myrsyra lager (26,5 M) i en 50 mL mätkolv och tillsätt 7,5 mL acetonitril och 40,6 mL avjoniserat vatten för att få den totala volymen till 50 mL. Sedan Sonikera lösningen för 15 min och överföra den till en steriliserad flaska med tät försegling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Skidan flytande beredning
	<ol>
<li>Förbereda 200 mL slida flytande lösning varje vecka, bestående av 0,1% myrsyra i 60: 40 (MeOH:H2O).</li>
		<li>Alikvotens 200 µL av myrsyra (26,5 M lager) i en flaska som innehåller 120 mL MeOH och 80 mL H2O göra slida vätska och lufta det för 15 min.</li>
		<li>Lägg sedan till 10 µL av varje av följande referens joner, purin och hexakis (2,2,3,3-tetrafluoropropoxy) phosphazine (HP-921), i slida vätskan att ge konstant massa signaler på m/z 121.05087 och m/z 922.00979, respektive. Obs: Dessa referens-joner medge realtid massa korrigering och också att övervaka potentiella matrix-inducerad ion dämpning eller enhancement effekter under separation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Standardpreparatet
	<ol>
<li>Förbereda en standardlösning innehållande en 84-drogen panel blandning på 3 x klinisk screening cut-off nivå (L6)14 i 1 mL metanol, med hjälp av drogen standarder inköpta från en kemisk leverantör. Förbereda separat en blandning av 48 matchande deutererade inre drog standard (d-ISs) på en 10-faldig högre koncentration än 84-drogen blandningen i 1 mL metanol. Dessutom förbereder en stamlösning som innehåller 200 µM 4-fluoro -L-fenylalanin (F-Phe) och 3-kloro -L-tyrosin (Cl-Tyr) i 1 mL avjoniserat H2O.</li>
		<li>Utföra en femfaldig utspädning av ovannämnda 84-drogen blandningen (20 µL) och 48 d-ISs (20 µL), samt en tiofaldig utspädning av 4-fluorophenylalanine (F-Phe, 10 µL) och 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 µL) i ett certifierat syntetiska urin matrix (40 µL) att göra totalt volym 100 µL i ett 250 µL centrifugrör.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extern kalibrering kurva förberedelse
	<ol>
<li>Förbereda femgradig externa kalibreringskurvorna (som beskrivs nedan) i fyra exemplar (n = 4) över en 20-fold dynamiskt omfång med 84-drogen standard blandningen och 48 i deras motsvarande d-ISs i steg 1.3.1. Exempelvis för att göra en femgradig externa kalibreringskurva, säkerställa att späda 84-drogen blandningen (L6, steg 1.3.1) till 2-, 4-, 10-, 20-, och 40-fold, är det nödvändigt att förbereda en femfaldig utspädning av matchande d-ISs (20 µL) och en tiofaldig utspädning av 4-F-Phe ( 10 µL) och Cl-Tyr (10 µL) som en ytterligare i en syntetisk urin matrix att göra en total volym av 100 µL. I fall när en matchande d-IS inte är tillgänglig för en specifik drog, är användning 4-F-Phe som ett surrogat för datanormalisering. Obs: Undvik att införandet av ytterligare d-ISs som cross-störa (isobariska) med andra DoA inom panelen om de inte helt löses genom CE separation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Urinen provberedning
	<ol>
<li>Tina deidentified morgon urinprover från en representativ kohort av tio kliniskt deprimerade patienter med en känd receptbelagda läkemedel historia. Lagra urin proverna vid-80 ° C efter samlingen tills de behöver tinas upp för analys. Obs: Undvik flera frysning-tining cykler av urin eller en försenad lagring vid rumstemperatur efter insamlingen på grund av deras effekt på kemisk stabilitet av vissa DoA metaboliter och deras konjugat.</li>
		<li>Vortex deidentified morgonurin prover för 30 s och, sedan, Centrifugera dem i 1 min på 14 000 x g för sedimentering. Efter det bearbetas alikvotens 10 µL av ovan nämnda urin, 10 µL av d-är, och 5 µL av F-Phe/Cl-Tyr och 25 µL avjoniserat H2O och virvel för 1 min (upprepa stegen i tre exemplar att bedöma tekniska precision). Överföra en 20 µL alikvot av ovan beskrivna blandningen till en polypropylen injektionsflaska för analys.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. inställning av CE-TOF-MS systemet
<ol><li>Obestruket smält-kisel kapillär luftkonditionering parametrar
	<ol>
<li>Kontrollera att alla standarder, externa kalibreringskurvor och urinprov som förberett i avsnitt 1.3-1.5 separeras med ett obestruket öppen-tubulär smält kiseldioxid polyimid-belagd kapillär med en inre diameter från 50 μm, en yttre diameter på 360 µm, och en totala kapillär längd 135 cm. Obs: En diamant cutter verktyg används för att säkerställa konsekvent kapillärerna som kontrolleras ytterligare för att säkerställa en flush och släta snitt.</li>
		<li>Ta bort ca 7 mm av polyimid beläggningen från både distala kapillär ändar, med hjälp av en kapillär Fönster maker att minska prov överföring och för att förhindra potentiella polyimid svullnad vid kontakt med organiska lösningsmedel.</li>
		<li>Se till att sticka ut ca 2 mm av kapillär utlopp ur CE spruta nålen och installera kapillär inloppet i CE patronen av looping två 360 ° svängar. Sedan försiktigt installera CE patronen i CE och placera CE sprutan ur ion källan när luftkonditionering kapillären. Obs: Skär kapillär utlopp konsekvent som det är avgörande för att säkerställa en stabil elektrospray nuvarande då den kopplas till MS. Två olika sprutor användes i detta arbete: en CE spruta användes för provanalys, och en LC spruta användes för massa kalibrering.</li>
		<li>Se till att utföra kapillären luftkonditionering med CE sprutan inte placeras i ion källan. Lägg LC sprutan i ion källan. Obs: Detta ger massa kalibrering samtidigt som man undviker all förorening av koaxial slida flytande gränssnittet som kopplas därefter till TOF-MS.</li>
		<li>Villkor nya kapillärer genom att välja spola funktion (940 mbar) på leverantörens programvara används för att styra instrumentet och ange varaktigheten för färg på 30 min varje för fyra olika lösningsmedel i följande ordning: metanol, 1 M NaOH, avjoniserat vatten och BGE. Se till att sätta Isokratisk pumpen på standby under perioden kapillär luftkonditionering.</li>
		<li>Torka CE-MS spruta med en vävnad torka indränkt i MeOH/H2O ta bort eventuella kvarvarande saltavlagringar.</li>
		<li>Utföra det dagliga förebyggande underhållet av CE-MS systemet innan analysera proverna. Använda metanol för att torka av CE elektrod (vid inlopp) men använder en isopropanol och vatten (50: 50) blandningen för att rengöra gränssnittet CE-MS, vilket är viktigt att undvika salt uppbyggnad och begränsa eventuella prov överföring.</li>
		<li>Ta bort LC spruta ur ion källan och placera den rengjorda sprutan med en nyligen luftkonditionerade kapillär i gränssnittet koaxial slida flytande för CE-MS.</li>
		<li>Aktivera Isokratisk pumpen och tillämpa en spänning på 30 kV för 15 min att se till att en stabil CE nuvarande profil uppnås före urinanalys.</li>
	</ol></li>
	<li>Injektion och separation förhållanden med hjälp av CE
	<ol>
<li>Öppna programvaran leverantör används för att kontrollera instrumentet att ange parametrarna CE och välj prekonditionering steg. Ställa in spola funktion till 600 s och anger en BGE injektionsflaska position. Obs: En yttre vatten Kylmaskin kan behöva anslutas till CE-system som saknar prov fack kylning funktioner, eftersom detta krävs för att förhindra provavdunstning när analysera stora partier av volym-begränsad prover.</li>
		<li>Ställa in injektion funktion att hydrodynamiskt injicera proverna vid 100 mbar för 5 s och electrokinetically injicera BGE distanser 30 kV för 75 s. Obs: Denna process upprepas för varje prov injektion (från en annan injektionsflaska position) följt av en BGE spacer (från samma injektionsflaska position) som utförs automatiskt inom ett metod program på programvaran för sammanlagt 11 diskret prover analyseras i den samma kör när du använder en MSI-format. Analysera 10 urinprov i slumpmässig ordning efter en 84-panel drug blandning på screening cut-off nivå injiceras som första provposition för varje MSI-CE-MS körning.</li>
		<li>Ange den tillämpad spänning att vara 30 kV, patron temperatur 25 ° C, och den totala körningstiden vara 40 min. med tidsplanen, Använd en tryckgradient 2 mbar/min från 0 min 40 min under separationen. Obs: En gradient tryck appliceras under separationen att tillåta för elueringen av långsam-migrering, vilket inkluderar vissa svagt, grundläggande bensodiazepiner och neutral/sura droger (e.g., paracetamol, barbiturater). Dock migrera mest grundläggande DoA och deras metaboliter som kationer inom 25 min, inklusive amfetaminer, opioider och andra klasser av alkaloider.</li>
		<li>Efter provet förvärvet är klar, se till att skölja kapillären vid ett lågt tryck (50 mbar) med BGE förrän nästa dag. Annars skölj kapillären för 600 s vid högt tryck (900 mbar) med vatten och sedan för 600 s med luft, och lagra den i en spruta hållare tills nästa användning.</li>
	</ol></li>
	<li>Isokratisk pump och slida vätska
	<ol>
<li>Använda en Infinity Isokratisk Pump och en Infinity Degasser för att leverera slida vätskan (60: 40 MeOH:H2O med myrsyra 0,1% v/v) med en hastighet av 10 µL/min till CE-MS sprutan.</li>
	</ol></li>
	<li>TOF-MS inställningar
	<ol>
<li>Se till att en TOF-MS, med en koaxial slida-flytande elektrospray ion källa och uppvärmd kvävgas, är utrustad med en CE-enhet.</li>
		<li>Driva TOF-MS under positiv jon upptäckt som sträckte sig över en massa m/z 50-1.700, med en datahastighet för förvärv av 500 ms/spektrum. Se till att både profilen och den centroiden data lagras i ett filformat som ”.d”.</li>
		<li>Ange de elektrospray jonisering villkor vara: Vcap och munstycke spänningen vid 2 000 V, nebulisatorn gasen på 10 psi och snabbtorkande gasen levereras på 8 L/min vid 300 ° C, med en slida gasflödet 3,5 L/min vid 195 ° C. Dessutom ställa in MS spänning av fragmentor, skimmer och Oct1 RF till 120, 65 och 750 V, respektive. Obs: Vcap och munstycke spänning, liksom nebulisatorn gas var avstängd under seriell prov injektion sekvensen används i MSI-CE-MS, men elektrospray programmerades att vridas tillbaka på 1 min efter påbörjande av elektroforetiska separationen att förhindra ström fel på grund av sugning effekter.</li>
		<li>Utföra instrument kontroll- och förvärvet med leverantörens programvara (Tabell för material).</li>
	</ol></li>
	<li>Analys av data
	<ol>
<li>Analysera MSI-CE-MS data med hjälp av leverantörens programvara, inklusive bearbetning, data utjämning, och integration av extraherade ion elektroferogrammen (EIEs) för representant DoA och deras metaboliter.</li>
		<li>Öppna programvaran och ange följande parametrar.<ol>
<li>Välj utvinning dataformatoch kromatogrammet och massa spektraldata formatera till profilläget under kromatogram.</li>
			<li>Välj Kvadratisk/Cubic Savitzky Golay under den utjämnande funktionen och funktionen bredd till 15 poäng.</li>
			<li>Klicka sedan Integrera (MS), ange Integratorn vara Agileoch välj det maximala antalet toppar gräns till den största 11 under peak filter.</li>
			<li>Klicka på Visaoch klicka på Integration topp listanVälj peak nummer, retentionstid (RT), topparea, topphöjdoch signal-brus-förhållande (SNR).</li>
			<li>Spara dessa parametrar under en unik metodnamn. Tillämpa denna metod på processen och tolka varje datauppsättning. Obs: En sammanfattande tabell med peak nummer, RT, toppens och höjd och SNR visas på höger sida. Utföra datanormalisering för uppmätta RT och integrerad topparean för varje DoA till antingen en matchning d-är eller (om inte tillgänglig) F-Phe att förbättra analytiska precision.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. analys av urinprov och externa kalibreringskurvorna
<ol><li>
Olika seriella injektion konfigurationer som används i MSI-CE-MS
	<ol>
<li>För den första seriella prov injektion konfiguration, används för att demonstrera drog isomer/isobar upplösning (figur 1A), se till att fem upprepade injektioner utförs på en blandning av 84 drog standarder med d-är 4-F-Phe/Cl-Tyr, följt av en sjätte injektion, vilket är ett blindprov i syntetiskt urin, och fem ytterligare injektioner av standard drog blandningen.</li>
		<li>Andra seriella prov injektion konfiguration, används för att demonstrera detektion av DoA i enskilda urinprover från patienter med kända recept (figur 2A), se till att den första prov pluggen är en blandning av 84-drogen standard blandningen på en 1 x cut-off screeningnivån (positiv kontroll) följt av en randomiserad injektion av 10 utspädda urinprov från patienter: #293, #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, #183 och #50.</li>
		<li>Tredje seriell prov injektion konfiguration, används för att illustrera förvärvet av extern kalibreringskurvor i en enda körning, se till att standard lösningar för DoA upprättas över ett 20-fold linjär dynamiskt omfång motsvarande 0,25 x, 0,5 x, 1 x, 2.5 x, och 5 x cut-off halter, tillsammans med matchande d-IS och F-Phe/Cl-Tyr som ytterligare IS i en syntetisk urin matris (n = 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Products - Vital Statistics Rapid Release - Provisional Drug Overdose Data Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/drug-overdose-data.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/drug-overdose-data.htm</a> (2018)</li><li>Olfson, M., King, M., Schoenbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Young+People+With+Antipsychotic+Medications+in+the+United+States.">Treatment of Young People With Antipsychotic Medications in the United States.</a> JAMA Psychiatry. 72, 867-874 (2015).</li><li>Moeller, K. E., Kissack, J. C., Atayee, R. S., Lee, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Interpretation+of+Urine+Drug+Tests:+What+Clinicians+Need+to+Know+About+Urine+Drug+Screens.">Clinical Interpretation of Urine Drug Tests: What Clinicians Need to Know About Urine Drug Screens.</a> Mayo Clinic Proceedings. 92, 774-796 (2017).</li><li>Levy, S., Siqueira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committee+on+Substance+Abuse.+Testing+for+Drugs+of+Abuse+in+Children+and+Adolescents.">Committee on Substance Abuse. Testing for Drugs of Abuse in Children and Adolescents.</a> American Academy of Pediatrics. 133, e1798 (2015).</li><li>Pesce, M., Mikel, C., West, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+two+drug+testing+technologies:+GC-MS+and+LC-MS/MS.">A tale of two drug testing technologies: GC-MS and LC-MS/MS.</a> American Society of Interventional Pain Physicians. 13, 91-92 (2010).</li><li>Saitman, A., Park, H. -. D., Fitzgerald, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False-Positive+Interferences+of+Common+Urine+Drug+Screen+Immunoassays:+A+Review.">False-Positive Interferences of Common Urine Drug Screen Immunoassays: A Review.</a> Journal of Analytical Toxicology. 38, 387-396 (2014).</li><li>In Pursuit of Liquid Gold. The New York Times Available from: <a target="_blank" href="https://www.nytimes.com/interactive/2017/12/27/business/urine-test-cost.html">https://www.nytimes.com/interactive/2017/12/27/business/urine-test-cost.html</a> (2017)</li><li>Wu, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+liquid+chromatography-high+resolution+mass+spectrometry+(LC-HR/MS)+in+clinical+toxicology.">Role of liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HR/MS) in clinical toxicology.</a> Clinical Toxicology. 50, 733-742 (2012).</li><li>Guale, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+LC-TOF-MS+Screening+for+Drugs,+Metabolites,+and+Collateral+Compounds+in+Forensic+Toxicology+Specimens.">Validation of LC-TOF-MS Screening for Drugs, Metabolites, and Collateral Compounds in Forensic Toxicology Specimens.</a> Journal of Analytical Toxicology. 37, 17-24 (2013).</li><li>Kaupilla, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+metabolites+and+drugs+of+abuse+from+urine+samples+by+desorption+electrospray+ionization-mass+spectrometry.">Rapid analysis of metabolites and drugs of abuse from urine samples by desorption electrospray ionization-mass spectrometry.</a> The Analyst. 132, 868-875 (2007).</li><li>Bynum, N. D., Moore, K. N., Grabenauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Laser+Diode+Thermal+Desorption-Tandem+Mass+Spectrometry+(LDTD-MS-MS)+in+Forensic+Toxicology.">Evaluation of Laser Diode Thermal Desorption-Tandem Mass Spectrometry (LDTD-MS-MS) in Forensic Toxicology.</a> Journal of Analytical Toxicology. 38, 528-535 (2014).</li><li>Kuehnbaum, N. L., Kormendi, A., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisegment+Injection-Capillary+Electrophoresis-Mass+Spectrometry:+A+High-Throughput+Platform+for+Metabolomics+with+High+Data+Fidelity.">Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry: A High-Throughput Platform for Metabolomics with High Data Fidelity.</a> Analytical Chemistry. 85, 10664-10669 (2013).</li><li>Nori de Macedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sweat+Metabolome+of+Screen-Positive+Cystic+Fibrosis+Infants:+Revealing+Mechanisms+Beyond+Impaired+Chloride+Transport.">The Sweat Metabolome of Screen-Positive Cystic Fibrosis Infants: Revealing Mechanisms Beyond Impaired Chloride Transport.</a> ACS Central Science. 3, 904-913 (2017).</li><li>DiBattista, A., Rampersaud, D., Lee, H., Kim, M., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Throughput+Screening+Method+for+Systematic+Surveillance+of+Drugs+of+Abuse+by+Multisegment+Injection-Capillary+Electrophoresis-Mass+Spectrometry.">High Throughput Screening Method for Systematic Surveillance of Drugs of Abuse by Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 89, 11853-11861 (2017).</li><li>Cao, Z., Kaleta, E., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantitation+of+78+Drugs+and+Metabolites+in+Urine+with+a+Dilute-And-Shoot+LC-MS-MS+Assay.">Simultaneous Quantitation of 78 Drugs and Metabolites in Urine with a Dilute-And-Shoot LC-MS-MS Assay.</a> Journal of Analytical Toxicology. 29, 335-346 (2015).</li><li>Drouin, N., Rudaz, S., Schappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Supported+Liquid+Membrane+for+Electromembrane+Extraction+of+Polar+Basic+Endogenous+Metabolites.">New Supported Liquid Membrane for Electromembrane Extraction of Polar Basic Endogenous Metabolites.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 159, 53-59 (2018).</li></ol>

Författarna avslöja ett Amerikanskt patent (PCT/CA2014/050454) på MSI-CE-MS som multiplexade screeningtest plattform och data arbetsflödet för kemisk analys.

Konventionella kromatografiska separationer normalt förlitar sig på en enda prov injektion per körning, som sedan följs av en gradient eluering för att lösa komplexa drog blandningar och kolumn rekonditionering. Dessa krav fundamentalt begränsa provkapacitet och plikt cykel även när du använder optimal kolumn-växla program. I detta sammanhang hög volym urin drug analys för arbetsplatsen, toxikologi eller terapeutiska övervakning tillämpningar av GC-MS/MS och, alltmer, LC-MS/MS är således utförs parallellt utan används företrädesvis som en andra rangens eller bekräftande test när nödvändigt (dvs, juridiska eller medicinska sammanhang). Detta beror på den mycket högre kapitalinvesteringar och operativa kostnader, samt komplikationer med dataanalys när jämförande prover analyseras på flera olika instrumentala plattformar inom ett ackrediterat laboratorium. Som ett resultat, fortfarande immunanalyser den primära metoden för rutinmässig drogkontroll trots att de är benägna att falskt positiva och falskt-negativ bland många läkemedel klasser, med begränsad tillgång till antikropp reagenser för framväxande designer droger. Tidigare studier har visat att multiplexade separationer baserat på MSI-CE-MS erbjuder en enkel lösning för att öka provkapaciteten upp till en storleksordning. Dessutom tillåter denna strategi för utformningen av nya data arbetsflöden för biomarkör identifiering med kickdata trohet baserat på genomförandet av effektiva batch korrigering och kvalitetskontroll12,13,14. Men förkortar införandet av 10 eller fler seriella hydrodynamiska injektioner i MSI-CE-MS den effektiva kapillära längden som krävs för att upprätthålla hög verkningsgrad separationer, vilket kan äventyra selektivitet när analysera DoA och deras metaboliter i mänsklig urin.
Häri, introducerade vi våra injektion av den BGE efter varje hydrodynamiska prov injektion, sådan att avskiljandet tar fördel av full kapillär längd (120 cm), vilket förbättrar upplösningen av viktiga läkemedel isobars/isomerer när du använder full-scan datainsamling av TOF-MS (bild 1A). I jämförelse med en senaste rapport14uppnås bättre upplösning för flera viktiga isobariska/isomera DoA och deras metaboliter, vilket är kritiskt när screening för stora drogen paneler. Till exempel realiserades resolutionen av flera viktiga strukturella/funktionell grupp isomerer, inklusive tre analoga opioida läkemedel/metaboliter (figur 1B), två orelaterade opioid isobars (bild 1 c) och två metamfetamin positionella isomerer (figur 1 d). I alla fall är prov överföringar från seriell injektion av olika standard lösningar inom samma körning inte betydande som bekräftas av en negativ urin kontroll/tom. Dessutom förbättrad upplösning realiseras också för flera cross-störningar som berör vissa d-ISs med isobariska droger inom panelen som kotinin-d3 och 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA), EDDP-d3 och imipramin, norfentanyl-d5 och Ketamin, kodein-d6 och sertralin, och kokain-d3 och zolpidem. Detta resultat är utvidgas till andra isobariska störningar inom panelen drog som löstes bättre i denna studie (t.ex., noroxycodone/oximorfon, normeperidine/metylfenidat), samt stora bakgrunden urin störningar (t.ex. , i källkod fragment joner av serumkreatinin med amfetamin)14. Tillgång till två ortogonala parametrar att tillfredsställa förmodad identifiering av en specifik DoA är faktiskt avgörande för att minska falsk-positiv på grund av isobariska störningar, nämligen korrekt massa kombinerat med comigration med d-ISs. Också, upptäckt av en eller flera biotransformed metaboliter av modersubstansen inom samma prov, såsom hydroxylerade, demetylerad eller intakt glukuronid drog conjugate(s), lägger till ytterligare förtroende mot drogen identifiering medan expandera fönstret för upptäckt.
De rekommendera cut-off nivåerna för urin drug screening varierar för olika klasser av DoA (allt från 50 till 1000 ng/mL) beroende på deras farmakokinetik, toxicitet och bakgrunden störningar, för att minska metod bias baserat på riktlinjer från den Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA)14. Potentialen för MSI-CE-MS kan identifiera olika klasser av DoA direkt i urinen med minimal prov förbehandling tillämpades på en grupp av kliniskt deprimerade patienter med kända recept rekord. Slutgiltiga identifieringen av metadon (föreskrivna), amfetamin (nonprescribed/olaglig), Venlafaxin (föreskrivs) och pregabalin (föreskrivna) i utspädda, ändå nonhydrolyzed, urinprov visades när du använder MSI-CE-MS. Detta var baserat på en direkt jämförelse av en drog som upptäcks i en specifik injektion position i förhållande till 84-drogen blandningen infördes i den första prov positionen vid rekommenderad screening cut-off nivå som fungerar som en intern referens/QC och positiv kontroll (Figur 2). Även absolut drog kvantifiering är genomförbart mätt med hjälp av extern kalibreringskurvor (figur 3) baserat på ion svar kvoten för ett läkemedel i förhållande till sin d-är. Till skillnad från de flesta kromatografiska separationer, det finns ingen deuterium effekt påverkar migration tidsskillnader mellan en d-är och dess nondeuterated drog sedan de äger liknande elektroforetiska mobiliteter i gratis lösning i CE. Faktiskt, migration beteende DoA är noggrant modellerad i CE, baserat på deras grundläggande fysikalisk-kemiska egenskaper och kemiska struktur, nämligen molekylär volym och laddar effektivt (pKen)14. Eftersom många läkemedel även genomgå betydande sekundär metabolism före utsöndring i urinen (t.ex., morfin glukuronid), screening cut-off nivåer kräver justering eftersom deras uppmätta koncentrationer är lägre än väntat jämfört metoder som använder enzymet hydrolys för total drug upptäckt. En stor fördel med ”späd-och-skjuta” urin drogtest, förutom att minska kostnader och tid, provhantering, och en potentiella bias eller batch variationer på grund av ofullständig enzym hydrolys, är att presumtiva screen-positiva fall bekräftas ytterligare av de Påvisande av en eller flera relaterade läkemedelsmetaboliter inom samma prov. Detta ger även djupare insikter i läkemedel farmakokinetik och optimal dosering krav för enskilda patienter samtidigt förbättra upptäckten för ”snabb” metaboliserare eller föreskrivna/olagliga droger med kort halveringstid. Dessutom comigration med en matchande av d-spelar två viktiga funktioner för tillförlitlig drug screening när du använder MSI-CE-MS — nämligen den identifierar den exakta prov injektion positionen (dvs, patientens #) samtidigt också korrigerat för skillnader i ion svar/injektionsvolymer för förbättrad precision och noggrannhet.
Framtida arbetet syftar till att utveckla anpassade programvaruverktyg för att underlätta automatisk databehandling av multiplexade separationer kopplat till HRMS som krävs för hög volym urin drogtest med QC/QA. Strikt validering av MSI-CE-MS för brett spektrum screening av DoA kommer också att undersökas bland en större kohort av patienter med hög risk för att objektivt utvärdera förskrivna läkemedlet följsamhet och potential missbruk/ersättning som kan äventyra behandlingseffekt, patientsäkerhet och/eller psykiatrisk bedömning/diagnos. En kompletterande analys av sura/anjon klasser av DoA och deras metaboliter kommer också utföras av MSI-CE-MS under alkaliska förhållanden med negativ jon läge upptäckt som krävs för omfattande screening av naturlig/syntetiska cannabinoider. Detta är viktigt tanke hotande folkhälsa konsekvenserna av legalisering av fritids marijuana i Kanada och flera amerikanska delstater. En stor fördel med full-scan datainsamling av TOF-MS är att retrospektiv analys av prover kan utföras även när urinprov är inte längre tillgängliga för uppföljande testning, medan andra livsstil eller kosten exponeringar kan bedömas bättre förstå differentiell Svaren till läkemedelsbehandling. Sammanfattningsvis erbjuder en snabb men korrekt drog övervakning metod av MSI-CE-MS betydande fördelar till konventionella riktade immunanalyser, liksom direkt infusion/omgivande jonisering-MS/MS-metoder som är benägna att störningar/bias när matchas utökad paneler av DoA och deras metaboliter i komplexa biologiska prover på marginalkostnader.

En oroväckande ökning av missbruk av och beroendet av opioider för hantering av kronisk smärta utgör ett växande hot mot folkhälsan, med över 70.000 överdosering narkotikadödsfall i USA uppskattas i 20171. Likaså ordineras andra psykotropa mediciner också allmänt att barn och unga vuxna för behandling av ångest, depression och psykiska problem2. Som ett resultat, är urin drogtester metoder, allmänt utvecklat för arbetsplats och rättskemi, av avgörande betydelse för terapeutisk övervakning av föreskrivna mediciner som är benägna att tolerans och beroende3,4. Detta behövs för att garantera följsamhet, optimal terapeutisk effekt och patientsäkerhet, medan avslöjar potentiella substitution, inklusive olaglig eller nonprescribed drog missbruk. För närvarande urin drogtest för DoA förlita sig på en tvådelad strategi, bestående av en initial konkurrenskraftiga immunoassay skärmen via point-of-care enheter eller laboratorium analysatorer, följt av en bekräftande test med större specificitet baserat på GC-MS/MS och alltmer, LC-MS/MS5. Dock är immunanalyser benägna att bias, som antikropp reagenser binda nonspecifically till olika läkemedel klasser att generera ett presumtiva screen-positiva resultat, som förhindrar en tillförlitlig identifiering och kvantifiering av specifika läkemedel eller komplexa drog blandningar6. I detta sammanhang mer korrekt urinprov narkotika behövs omgående ges de orimliga kostnaderna för omfattande blandmissbruk skärmar,7 inklusive designer narkotika och syntetiska urin produkter som gäcka konventionella riktade analyser.
Högeffektiv separationer i samband med högupplösta MS (HRMS) använder TOF eller orbitrap massa analysatorer har föreslagits som en nontargeted strategi för övervakning av läkemedel i en era av Polyfarmaci och expanderande paneler av DoA8,9 . Konventionella LC separationer är dock långsam (> 15 min) på grund av de långa eluering tiderna för upplösning av kemiskt olika klasser av DoA och deras metaboliter som använder gradient eluering program, vilket begränsar provmängder för rutinmässig drogkontroll. Alternativt direkt analysmetoder baserat på desorption jonisering (DESI)10 och laser diode termisk desorption (LDTD) möjliggör snabbare drug screening utan separation11. Men är metoderna omgivande jonisering benägna att isobariska/isomera störningar när analysera komplexa urinprover, vilket kräver oberoende bekräftande tester.
Vårt laboratorium har nyligen utvecklat en multiplexade separation plattform för att öka provkapaciteten samtidigt behålla en hög verkningsgrad separation baserat på MSI-CE-MS12upplösning och data trohet. Nya data arbetsflöden kan utformas i MSI-CE-MS för den nontargeted metaboliten profilering (dvsmetabolomik) av volym-begränsad biospecimens, kvalitetskontroller (QC) göra det möjligt för batch korrigering som krävs för storskaliga befolkningen studier13. I det här fallet utförs separationer med en Isokratisk buffert med lösningens jonisering uppstår under steady state lösningsmedel när du använder en konventionell slida flytande gränssnitt, vilket möjliggör seriell injektioner av 10 eller fler prover inom en enda kör för snabba men selektiv screening av olika klasser av DoA och deras metaboliter14. Fokus för denna studie är att ytterligare validera MSI-CE-MS för direkt analys av autentiska urinprov från en representativ kohort av kliniskt deprimerade patienter med en ”späd-och-skjuta” metod som undviker behovet av enzymet hydrolys15. Dessutom, genomförandet av en våra spacer mellan seriell prov pluggar i MSI-CE-MS16 framfördes att ytterligare förbättra olika drog isomerer/isobars upplösning, bakgrunden urin störningar, eller Cross-störningar när screening stora paneler av DoA. Absolut kvantifiering av DoA i urinprov när med matchande deutererat interna standarder (d-är) visas när du använder MSI-CE-MS. Detta tillvägagångssätt underlättar också drog identifiering samt härleda den rätta provposition screen-positiva fall jämfört med en drog panel blandning vid rekommenderad screening cut-off nivå som också fungerar som en intern referens/QC inom samma körning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7100 Capillary Electrophoresis System</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G7100A</td>
			<td>CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G6230B</td>
			<td>HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE-ESI-MS Sprayer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G1603A</td>
			<td>CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>G1310B</td>
			<td>Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>--</td>
			<td>Software used for control of CE-MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>--</td>
			<td>Software used for processing of CE-MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortix Capillary Cutter</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td>5813-4620</td>
			<td>Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Window Maker</td>
			<td>Microsolv Inc.</td>
			<td>07200-S</td>
			<td>Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Fused-silica Capillary Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies Inc.</td>
			<td>TSP05375</td>
			<td>Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)</td>
			<td>Cerilliant Inc.</td>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td>Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput and comprehensive drug surveillance using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry

Nya analysmetoder är angeläget att aktivera hög genomströmning, ändå omfattande drogkontroll, ges en alarmerande opioid och receptbelagda läkemedel kris i folkhälsa. Konventionella urin drogtest utifrån en tudelad immunoassay skärmen följt av en gaskromatografi-tandem masspektrometri (GC-MS/MS) eller flytande kromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) metod är dyra och benägna att bias samtidigt som begränsat till riktade paneler av kända läkemedel för missbruk (DoA). Häri, beskriver vi en förbättrad metod för drogen övervakning som möjliggör att upplösning och upptäcka en expanderad panel av DoA och deras metaboliter när du använder multisegment injektion-kapillär elektrofores-masspektrometri (MSI-CE-MS). Multiplexed separationer av tio urinprov med en kvalitetskontroll av CE (< 3 min/prov) i samband med full-scan datainsamling med hjälp av en time-of-flight masspektrometer (TOF-MS) under positiv jon mode detektion möjliggör identifiering och kvantifiering av DoA ovan rekommenderade cut-off nivåerna. En utmärkt upplösning av läkemedlet isomerer och isobars, inklusive bakgrunden störningar, uppnås när du använder MSI-CE-MS med en våra spacer mellan prov segment, där korrekt massa/molekylära formel tillsammans med comigration av en matchande deutererat intern standard och upptäckt av en eller fler bio-omvandlad metaboliter underlätta DoA identifiering över en bredare fönstret Pausdetektion. Urinprov kan dessutom analyseras direkt utan enzym dekonjugering för snabb screening utan komplicerade prov workup. MSI-CE-MS möjliggör övervakning av ett brett spektrum av DoA som krävs för behandling av högriskpatienter, inklusive bekräftar förskrivna läkemedlet följsamhet, avslöjar olaglig användning/drogsubstitut och utvärdera optimal dosering regimer som krävs för nya framsteg i precision medicine.

MSI-CE-MS gör seriell injektion av tio eller fler diskreta prover inom en enda körning, som kraftigt förbättrar genomströmning (< 3 min/prov) utan komplicerade instrumental modifieringar, kolumnen-byta program eller kostsam infrastruktur investeringar (figur 1A). En alternerande serie hydrodynamiska injektioner av provet och våra spacer av BGE utförs inom en omodifierad smält-kisel kapillär, där zonal elektroforetisk separation av joner uppstå under starkt sur elektrolyt (pH 1.8). solute jonisering uppstår även understeady-State. I detta fall används en koaxial slida vätska, med en massa standard, som ett gränssnitt för CE-MS under positiv jon mode detektion med minimal ion dämpning eller enhancement effekter som övervakas av massa standard joner signalen. TOF representerar en robust men ändå kostnadseffektiva HRMS med en snabb datainsamling som passar perfekt för de nontargeted screening/läkemedelsansökningar övervakning när du använder MSI-CE-MS. Till exempel uppnås imponerande upplösning för olika isobariska/isomera DoA och deras metaboliter, inklusive strukturella isomerer av tre opioid strukturella isomerer, nämligen norhydrocodone, hydromorfon och morfin (figur 1B). I det här fallet löst 30 toppar från 10 oberoende prover av en drog blandning upptäcks utan provet överföring. Ett syntetiskt urin blank/negativ urin kontrollen ingår även inom seriell injektion serien (prova position #6). Även är två andra isobariska opioider, nämligen 6-acetylmorphine (en inaktiv heroin metabolit) och Naloxon (en opioid receptorantagonist används för akut behandling av opioidöverdosering) helt löst som 20 distinkta toppar med full-scan data förvärv ( Figur 1 c). Likaså är två amfetamin positionella isomerer helt löst i MSI-CE-MS att skilja olaglig metamfetamin missbruk från potentiella missbruk av fentermin, en föreskriven stimulerande som används som en aptit suppressant för viktminskning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig1.jpg"> Figur 1: en serie av extraherade ion elektroferogrammen (EIE) för representativa DoA isomerer/isobars som löses med MSI-CE-MS genom att analysera tio prover och en tom inom en enda körning. (A) Schematisk av MSI-CE-MS som skildrar den seriella injektion-konfiguration som använts för en 84-DoA panel i syntetiskt urin. Detta multiplexade separationsmetod används en alternerande serie hydrodynamiska injektioner av 11 blank och diskret prover med en våra injektion av en buffert för att initiera zonal elektroforetisk separation av joner, följt av en full-scan data förvärv av TOF-MS med positiv jon mode detektion. (B) tre isobariska funktionella gruppen opioider isomerer (m/z 286.1438), separerade av CE, bestående av 30 löst toppar från 10 diskret prov injektioner, inklusive norhydrocodone, hydromorfon och morfin. (C), två isobariska opioida läkemedel och deras metaboliter (m/z 328.1543), separerade av CE, bestående av 20 löst toppar från 10 diskret prov injektioner, inklusive 6-acetylmorphine (heroin metabolit) och Naloxon. (D) två isobariska funktionell grupp amfetamin isomerer, åtskilda av CE, bestående av 20 löst toppar från 10 diskret prov injektioner, inklusive metamfetamin och fentermin. I alla fall hade negativa urin kontroller/blanks infördes i sjätte prov ställning i MSI-CE-MS försumbar bevis av provet förädlingsstöd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Skärm DoA, en seriell injektion konfiguration i MSI-CE-MS används en 84-drogen panel blandning vid rekommenderad screening cut-off halter (som den första injektion positionen för alla körningar) följt av en randomiserad analys av 10 representativa urin prover från kliniskt deprimerade patienter med kända recept tidigare. Exempelvis en positiv screening testresultat för metadon (m/z 310.2165) från patient #208 (figur 2A) är slutsatsen av en upptäckt av en stor signal topp (ursprung från injektion #9) som comigrates med metadon-d3 med en låg massa fel (< 5 ppm). Inga andra signaler upptäcks i några andra urinprov inom samma körning. Metadon koncentration överstiger 13 x rekommenderade cut-off gränsen när man jämför dess uppmätta ion svar baserat i provet (injektion #9) med referens drog blandning/QC (#1 injektion) och korrigeras genom en fyrfaldig urin utspädningsfaktor. Detta resultat bekräftar därmed, patientens följsamhet till underhållsbehandling med metadon. Bevis på nonprescribed amfetamin intag (figur 2B) framgår av förhöjda amfetamin nivåer (m/z 136.1121) som upptäcktes endast hos en patient (patient #50, i injektion #11) inom MSI-CE-MS kör. Den uppmätta koncentrationen något överskred de rekommendera cut-off nivåerna (1,3 x). Detta comigrates med amfetamin-d5 och hade en låg massa fel med en topprankad molekylformel match. Ett positivt testresultat för de antidepressiva-Venlafaxin (m/z 278.2115), en selektiv serotonin-noradrenalin reuptake inhibitor, demonstreras också i patienten #281 (injektion #6). I detta fall koncentrationen överstiger rekommenderade cut-off nivå (15 x), här identifieras av dess korrekta mass - eller molekylformel-match, tillsammans med comigrating Venlafaxin-d6 (figur 2 c). Det sistnämnda kriteriet är inte uppfyllt för en okänd isobar som upptäcks också inom EIE tracen, som belyser behovet av försiktighet när förlitar sig enbart på dess korrekt massa. Dessutom en definitiva upptäckten av föreskrivna pregabalin, som ordineras för behandling av neuropatisk smärta samt generaliserad ångest, visade också för patienten #309, baserat på dess grovt förhöjd koncentration (64 x) över den rekommenderade cut-off nivåerna (figur 2D). Det, dock inte upptäcks i de nio andra patientens urinprover analyseras inom samma kör. Liknar de andra skärmen-positiva fall, injektion #4, comigrates med pregabalin-d6, som ingår i alla urinprov som analyseras av MSI-CE-MS.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig2.jpg"> Figur 2: en serie av extraherade ion elektroferogrammen (EIE) för representativa skärmen-positiv urin drug testresultat från en kohort av 10 kliniskt deprimerade patienter som bekräftade när du bör använda MSI-CE-MS, vilket inkluderar en 84-drogen panel på cut-off nivå, injiceras som första prov injektion position som intern referens/QC. (A), EIE overlay motsvarar metadon-d3, som comigrates med metadon, belysa det bara ett urinprovet (injektion position #9) förhöjd metadon koncentrationer långt överskrider cut-off nivån. (B), EIE overlay motsvarar amfetamin-d3, som comigrates med amfetamin, belysa det bara ett urinprovet (injektion position #11) har förhöjda koncentrationer över cut-off nivåerna. (C), EIE overlay motsvarar Venlafaxin-d6, som comigrates med Venlafaxin, belysa det bara ett urinprovet (injektion position #6) har förhöjda koncentrationer över cut-off nivåerna. (D), EIE overlay motsvarar pregabalin-d6, som comigrates med pregabalin, belysa det bara ett urinprovet (injektion position #4) har grovt förhöjda koncentrationer överskrider cut-off halter. Alla urinprover analyserades direkt efter en femfaldig utspädning i avjoniserat vatten tillsammans med tillägg av en matchande d-är (om tillgängligt). Ett screen-positiva resultat i MSI-CE-MS motsvarar ett läkemedel som comigrates med d-ISs med en låg massa fel (< 5 ppm) och rätt molekylformel, vars koncentration överstiger cut-off som analyseras inom samma kör som intern referens/QC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Absolut kvantifiering av DoA och deras metaboliter uppnås också genom MSI-CE-MS baserat på extern kalibreringskurvor, med standard referensstandarder för DoA som förvärvas snabbt inom en enda körning. Exempelvis den seriella utspädningen av 84-drogen standard blandningen tillsammans med en matchande d-är på en fast koncentration ger en pålitlig kvantitativ analys i komplexa urinprov. Detta kompenserar för potentiella matrix-inducerad ion dämpning eller förstärkning men också för variationer i injektionsvolymen i kapillären mellan proverna. I fall när en matchande d-IS är kommersiellt tillgänglig eller kostnad oöverkomliga för vissa DoA, ett surrogat är används för datanormalisering, såsom en d-IS från inom samma drog klass eller en syntetisk förening inte återfinns i urinen (F-Phe), som visat tidigare 14. representant EIEs och externa kalibreringskurvor för oxikodon visas i figur 3A, B. och för citalopram i figur 3 c, D. Dessa är allmänt föreskrivna analgetika och antidepressiva, respektive med missbrukspotential. Relativa ion svar nyckeltal till deras matchande d-är mäts. I detta fall en seriell injektion konfiguration i MSI-CE-MS, bestående av fem olika drog calibrants, analyseras i två exemplar inom en enda kör tillsammans med en syntetisk urin tomt. Övergripande, bra linjäritet (R2 > 0.990) över en 20-fold koncentration utbud uppnåddes med tillräcklig känslighet för detektion av majoriteten av DoA och deras metaboliter (dvs., katjoniska alkaloider) inom panelen 84-drog 14. i samtliga fall läkemedelsmetaboliter upptäcks eftersom deras protonerade molekylära jonen [MH+] ovanför deras screening cut-off begränsar (> 50 ng/mL), med undantag för vissa sura/neutral läkemedel som har en dålig jonisering effektivitet under de positiv jon läge, till exempel cannabinoider (t.ex., THC-COOH), barbiturater (t.ex., secobarbital) och karbamater (t.ex., carisoprodol).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58986/58986fig3.jpg"> Figur 3: en serie av extraherade ion elektroferogrammen (EIE) för kvantifiering av representant DoA. Detta görs genom att generera externa kalibreringskurvorna baserat på deras relativa ion svar baserat med en en matchande d-är över en 20-fold linjär dynamiskt omfång. (A) duplicera injektion av en fem-punkt kalibreringskurva för oxikodon calibrants tillsammans med oxikodon-d3 och en tom. (B) externa kalibreringskurvan för oxykodon, efter linjär regression för att härleda känslighet (lutning) och linjäritet (R2), med felstaplar som representerar ±1σ (n = 4). (C) duplicera injektion av en fem-punkt kalibreringskurva för citalopram calibrants, tillsammans med en blank och citalopram-d6. (D) externa kalibreringskurvan för citalopram, efter linjär regression för att härleda känslighet (lutning) och linjäritet (R2), med fel barer som representerar ±1 SD (n = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58986/58986fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry at JoVE.com

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Här beskriver vi en hög genomströmning metod för omfattande drogen övervakning som möjliggör förbättrad upplösning och identifiering av stora paneler av narkotika missbruk och deras metaboliter, med kvalitetskontroll utifrån multisegment injektion-kapillär elektrofores-masspektrometri.

Hög genomströmning och omfattande drog övervakning med Multisegment injektion-kapillär elektrofores masspektrometri

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Nuvarande strategier för en urin drog screening är dyra att utföra för rutinmässig analys av allt större paneler av droger av missbruk som krävs för arbetsplatsen testning, samt terapeutiska tillämpningar läkemedelsövervakning. Dessutom, metoder baserade på aminoanalyser är benägna att partiskhet och är ytterst begränsad till målanalys av kända läkemedelspaneler. Den största fördelen med vår metod, som benämns SOM MSI-CE-MS, är att det möjliggör snabb screening av en obegränsad drog panel och deras metaboliter med hög noggrannhet och minimal prov workup.Det finns ett akut behov av en hög genomströmning och prisvärd screeningmetod för att förbättra patientens resultat genom att bekräfta följsamhet och optimera läkemedelsdoseringssystem, samtidigt som de avslöjar olaglig droganvändning. Denna multiplexerade separationsplattform kan tillämpas på en mängd andra forskningsområden som rör riktad eller icke-riktad metabolitprofilering i komplexa biologiska prover. Börja med upptining avidentifierade morgon urinprov som samlats in från patienter med en känd receptbelagda läkemedel historia för minus 80 grader Celsius lagring på is och virvlande de tinade proverna i 30 sekunder.Därefter sedimentproverna genom centrifugeringen och kombinera tre 10 microliter alikvoter av varje prov med 10 mikroliter av deuterated inre standarder, fem mikroliter av en 4-fluoro-L-fenylalanin och 3-klor-L-tyrosinlösning och 25 mikroliter av avjoniserat vatten. Sedan centrifugera blandningarna i en minut och överför 20 mikroliter av varje prov i enskilda polypropylen injektionsflaska. För att ställa in obestrukna smält kiseldioxid kapillär konditionering parametrar, skär en 135 centimeter lång, 50 mikrometer innerdiameter, och 360 mikrometer ytterdiameter kapillär från en spolning.Använd en kapillär fönster maker för att ta bort ca 7 millimeter polyamid beläggning från båda ändarna av varje kapillär. Därefter installerar kapillärinloppen i kapillärelektroforesen, eller CE-patronen, genom att loopa varje kapillär för två 360 graders varv, var noga med att sticka ut cirka två millimeter av kapilläruttagen ut ur CE-sprutar nålen. När alla kapillärerna har installerats, lasta försiktigt in CE-patronen i CE-systemet och förvara CE-sprutan ur jonkällan.Placera vätskekromatografin, eller LC-sprutan, i jonkällan och välj spolning i systemets programvara för att ställa in kapillärkonditioneringen. Ställ in varaktigheten av metanol, en molar natriumhydroxid, avjoniserat vatten, och bakgrundselektrolyt spola till 30 minuter per spolning och placera isokratiska pumpen i beredskap under kapillär konditionering period. Rengör efter den sista spolningen kapillärelektroforesmasspektrometern, eller CE-MS-sprutan, och CE-elektroden med metanolindränkta våtservetter.Rengör CE-MS-gränssnittet med en en till en isopropanol vattenlösning för att avlägsna eventuella restsaltavlagringar. Byt ut LC-sprutan mot den rengjorda CE- MS-sprutan och en nyligen betingad kapillär i koaxialsyttelvätskan. Sätt sedan på den isokratiska pumpen och applicera en spänning på 30 kilovolt under 15 minuter för att säkerställa att en stabil CE-strömprofil uppnås före urinanalysen.I systemprogramvaran väljer du förkonditionering, ställer in spolningen på 600 sekunder och anger en elektrolytfilsposition i bakgrunden. Ställ in injektionen så att den hydrodynamiskt injicerar proverna vid 100 millibar i fem sekunder och elektrokinetiskt injicerar bakgrundselektrolytsmeverkarna vid 30 kilovolt i 75 sekunder. Ställ in den applicerade spänningen på 30 kilovolt, patrontemperaturen till 25 grader Celsius och den totala körtiden till 40 minuter.Sedan, med hjälp av tidtabellen, tillämpa en tryckgradient på två millibar per minut från noll till 40 minuter under separationen. När provanskaffningen är klar sköljer kapillären vid 50 millibars tryck med bakgrundselektrolyterna över natten medan kapillären är i CE-sprutan i jonkällan. Ställ in den positiva jonidentifieringen tof-ms som sträcker sig över ett mass-till-charge-förhållande på 50 till 1, 700, med en dataanskaffningsgrad på 500 millisekunder per spektrum, och bekräfta att både profilen och centroiddata lagras i D-filformat.Ställ in elektrospray jonisering villkor kapillär och att munstycke spänningar på 2000 volt vardera, nebulisatorn gas till 10 pounds per kvadrattum, och torkning gas leverans till åtta liter per minut vid 300 grader Celsius med en ätte gas flöde av 3,5 liter per minut vid 195 grader Celsius under förvärvet. Ställ sedan in MS-spänningsinställningarna för fragmenter, skimmer och octapole en radiofrekvens till 120, 65 respektive 750 volt och ställ in parametrarna för instrumentkontroll och datainhämtning enligt experimentets utformning. För dataanalys, öppna ce-MS-datan för flera segment i systemprogramvaran.Ställ in utvinningsdata och kromatogram- och massspektraldataformaten under kromatogram till profilläge. Under utjämning väljer du kvadratisk kubisk Savitzky-Golay och ställer in funktionsbredden på 15 punkter. Klicka sedan på Integrera MS och ställ in integratorn på agile.Ställ in maximalt antal toppar till 11 under toppfilter. Under vyn klickar du på Topplista för integration och väljer toppnummer, kvarhållningstid, toppområde, topphöjd och signal-brusförhållande. Spara sedan parametrarna under ett unikt metodnamn och tillämpa metoden på processen för tolkningen av varje datamängd.I denna representativa analys av olika isobaric isomeric droger av missbruk och deras metaboliter, 30 löst toppar från 10 oberoende prover av en drog blandning upptäcktes utan prov carryover. Två andra isobaric opioids kunde vara fullständigt löst som 20 distinkta toppar med den fulla skanningen dataanskaffning. På samma sätt var två amfetamin positionella isomerer helt löst i denna multi-segment CE-MS analys, att skilja olaglig metamfetamin missbruk från den potentiella missbruk av fentermin, en föreskriven stimulerande som används som en aptit suppressant för viktminskning.I denna representativa drog screening analys, en positiv screening testresultat för metadon utläsas genom detektion av en stor signal topp co-migrera med metadon-d3 topp med en låg massa fel. Inga andra signaler upptäcktes i några andra urinprover inom samma körning och den upptäckta metadonkoncentrationen överskred 13 gånger den rekommenderade cutoffgränsen jämfört med det uppmätta jonresponsförhållandet i provet och korrigerades med en fyrafaldig urinutspädningsfaktor, vilket bekräftar patienternas följsamhet till metadonunderhållsbehandling. Här analyserades en seriell injektion konfiguration i flera segment CE-MS, bestående av fem olika läkemedel calibrants, i duplikat inom en enda körning tillsammans med syntetiska urinen blank.Drogen metaboliter upptäcktes som deras potenated molekylära joner över deras screening cutoff gränser. Efter detta förfarande kan ett stort antal polära och joniska metaboliter i urin också analyseras av MSI CMS till stöd för upptäcktsbaserad metabolisk forskning. Dessutom, omfattande övervakning av ett brett spektrum av exogena läkemedel och deras metaboliter kan uppnås, inklusive icke-föreskrivna läkemedel och olagliga droger benägna att missbruka.Denna optimerade metod kan också användas för att rutinmässigt skärm andra droger av missbruk. Dessa kan vara cannabis eller alkohol metaboliter och vår metod kan också skilja mellan en syntetisk eller en falsk urin matris och en naturlig, verklig, autentiskt donerade urinprov också. Kom ihåg att alltid vara försiktig när du arbetar med biologiska vätskor.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Rapid hög genomströmning Amylos Bestämning i frystorkad potatisknöl Prover

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analysera Protein Dynamics Använda Hydrogen Exchange masspektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Förbättrade I-gel Reduktiva β-Eliminering för omfattande O-kopplade och sulfo-glycomics med masspektrometri

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

Analys av flyktiga och Oxidation Känsliga Föreningar med kall Inlet System och Electron Impact masspektrometri

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Deacetylering Analyser att riva upp samspelet mellan Sirtuins (SIRT2) och specifikt protein-substrat

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Rapid med hög kapacitet Art Identifiering av Botanical Material med direkt analys i realtid högupplöst masspektrometri

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...