Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

تم توفير التمويل نيدك، عن طريق P01 DK41315.

وكانت جميع الحيوانات المستخدمة والبروتوكولات المضطلع بها في هذه الدراسة وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وافق جميع الإجراءات المؤسسية استخدام الحيوان ورعاية اللجنة في جامعة نيفادا، رينو.
1-جيل فئران KitGCaMP6f
<ol><li>عبر Ai95 (RCL-GCaMP6f)-د (الفئرا...

Ca2 + تصوير لأنواع محددة من الخلايا داخل أنسجة سليمة أو في شبكات الخلايا غالباً ما تكشف عن أنماط معقدة من Ca2 + العابرين. ويتطلب هذا النشاط تحليلات متأنية ومتعمقة، والتقدير الكمي لالتقاط قدر ممكن من المعلومات عن الأحداث الكامنة والحركية لهذه الأحداث. تحقيق الاستقرار والانتساب وتح...

Ca2 + هو رسول داخل الخلايا في كل مكان التي تسيطر على مجموعة واسعة من العمليات الخلوية، مثل العضلات انكماش1،2،3من الأيض، خلية انتشار3،4، 5، والحث على إطلاق سراح العصبي في الأعصاب الطرفية6،7، وتفعيل النسخ العوامل في النواة. 7 داخل الخلية Ca2 + إشارات غالباً ما تتخذ شكل ارتفاعات عابرة في كاليفورنيا سيتوسوليك2 +، وهذه يمكن أن تكون عفوية أو تنشأ من التحفيز مؤثر تبعاً لنوع الخلية8. المكانية، الزمانية وكثافة معلمات المضمنة إلى Ca2 + إشارات مثل التردد والمدة، ونشر، والسرعة والسعة ويمكن توفير المعلومات البيولوجية المطلوبة ل التنبيه داخل الخلايا5، 7 , 9-هيولى Ca2 + إشارات يمكن أن تنجم عن تدفق Ca2 + من الفضاء خارج الخلية أو عن طريق Ca2 + الإصدار من هيولى (ER) عبر قنوات Ca2 + الإصدار مثل مستقبلات ريانوديني (ريرس) ومستقبلات اينوزيتول-ثلاثي-الفوسفات (IP3Rs)10. ريرس والملكية الفكرية3روبية قد تسهم على حد سواء لتوليد إشارات Ca2 + ويمكن أن يؤدي فتح هذه القنوات، الذي جنبا إلى جنب مع مختلف Ca2 + تدفق آليات منسقة في عدد ضخم من Ca2 + يشير إلى أنماط أن تتشكل بالأرقام وفتح احتمال Ca2 + قنوات تدفق، التعبير الشخصية من Ca2 + الإفراج عن القنوات، القرب بين Ca2 + تدفق والإفراج عن القنوات، والتعبير والتوزيع من كاليفورنيا2 + البروتينات امتصاص والنتوء. Ca2 + إشارات قد تتخذ شكل موحد، طويلة الأمد، ذبذبات عالية الكثافة العالمية التي قد تستمر لعدة ثوان أو دقائق حتى، نشر داخل الخلايا وبين الخلايا Ca2 + الأمواج التي قد تعبر المسافات داخل الخلايا ما يزيد على 100 ميكرومتر10،11،،من1213،14،،من1516، أو المزيد من الأحداث موجزة، ومكانيا مترجمة مثل Ca2 + الشرر و Ca2 + نفث التي تحدث على عشرات الجداول الزمنية ميلي ثانية واحدة، وانتشار أقل من 5 ميكرومتر17،،،من1819،20.
مجهر فلوري قد استخدمت على نطاق واسع لرصد Ca2 + الإشارات في الخلايا المعزولة ومثقف وفي أنسجة سليمة. وتقليدياً، هذه التجارب انطوت على استخدام الفلورية Ca2 + المؤشرات، راتيوميتريك والأصباغ غير راتيوميتريك مثل Fura2 أو Fluo3/4 أو Rhod2، من بين آخرين 21،،من2223. هذه المؤشرات قد صممت لتكون نفاذية أغشية الخلايا وثم أصبحوا محاصرين في الخلايا بالانقسام من جماعة إستر عبر esterases الذاتية. ملزمة من Ca2 + لمؤشرات ترابط عالية تسبب التغييرات في الأسفار عندما كانت مضاءة الخلايا والأنسجة بالمناسبة الأطوال الموجية للضوء. استخدام الخلية نفاذية Ca2 + مؤشرات تتعزز فهمنا من Ca2 + إشارات في الخلايا الحية ويسمح القرار المكانية والتحديد الكمي لهذه الإشارات التي لم يكن من الممكن بالمعايرة Ca2 + إشارات من خلال وسائل أخرى، مثل الكهربية. ومع ذلك، قد Ca2 + المؤشرات التقليدية العديد من القيود، مثل فوتوبليتشينج التي تحدث على مدى فترات ممتدة من تسجيل24. في حين أحدث Ca2 + مؤشر الأصباغ مثل Cal520/590 قد تحسنت كثيرا إشارة إلى نسب الضوضاء والقدرة على اكتشاف المحلية Ca2 + إشارات25، قضايا مع فوتوبليتشينج يمكن لا تزال مصدر قلق لبعض المحققين 2627،،28. فوتوبليتشينج متسرعة كما يقيد التكبير، المعدل للحصول على الصور، والقرار التي يمكن استخدامها للتسجيلات، كما تتطلب زيادة قوة موضوعية ومعدلات أعلى للحصول على الصور زادت كثافة الضوء الإثارة التي يزيد من فوتوبليتشينج.
هذه القيود التقليدية Ca2 + مؤشر الأصباغ تتفاقم عند تسجيل Ca2 + إشارات في الموقع، على سبيل المثال عند تسجيل داخل الخلية Ca2 + إشارات من أنسجة سليمة. بسبب المشاكل المذكورة أعلاه، التصور Ca2 + إشارات في الموقع باستخدام الخلية نفاذية Ca2 + مؤشرات تم محدودة إلى تضخم منخفضة الطاقة وتخفيض المعدلات لالتقاط الصور، ويقيد قدرة المحققين لتسجيل و تحديد Ca2 + إشارات سوبسيلولار المقيدة زمنياً أو مكانياً. وبالتالي، كان من الصعب التقاط وتحليلها، ونقدر تعقيد المكانية والزمانية Ca2 + الإشارات، التي يمكن أن تكون هامة في توليد الاستجابات البيولوجية المطلوبة، كما هو مبين أعلاه. تحليل Ca2 + الإشارات من الخلايا في الموقع يعتمد عادة على قياسات كثافة بسيطة من مناطق مختارة للفائدة (ROI) ضمن مجال رؤية (FOV). يمكن تحيز الاختيار التعسفي لعدد وحجم وموضع رويس، تعتمد على أهواء الباحث، شدة النتائج المتحصل عليها. كذلك التحيز المتأصل بتحليل العائد على الاستثمار، هذا النهج يتجاهل الكثير من أهمية مما يشير إلى المعلومات التي تتضمنها فوف، كدينامية Ca2 + الأحداث داخل تعسفاً المختار يتم تحديد العائد على الاستثمار للتحليل. وعلاوة على ذلك، فشل تحليل رويس لتقديم معلومات عن الخصائص المكانية من Ca2 + إشارات لاحظ. على سبيل المثال، قد لا يكون ممكناً للتمييز بين ارتفاع Ca2 + الناتجة نشر Ca2 + موجه وكاليفورنيا مترجمة عالية2 + الإفراج عن الحدث من تبويبات Ca2 + إشارات داخل العائد على الاستثمار.
ظهور المرمزة وراثيا Ca2 + المؤشرات (جيسيس) قد تغيرت تغيرا جذريا في كيف يمكن أن يكون Ca2 + تصوير المؤداة في الموقع29،30،،من3132،33 . وهناك العديد من المزايا لاستخدام جيسيس أكثر الأصباغ. وربما الأكثر أهمية هو أن التعبير عن جيتشي يمكن أن يؤديها بطريقة محددة في خلية، مما يقلل من تلوث الخلفية غير المرغوب فيها من الخلايا لا فائدة. ميزة أخرى جيسيس فوق Ca2 + المؤشرات التقليدية أن فوتوبليتشينج انخفاض (كما الأسفار والتبعية فوتوبليتشينج فقط يحدث عندما الخلايا تكون نشطة)، بالمقارنة مع عينات محملة بصبغة، لا سيما في عالية التكبير، والمعدلات العالية للصورة التقاط34. وهكذا، التصوير مع جيسيس، مثل سلسلة جكامب من أجهزة استشعار أوبتوجينيتيك، يتيح للمحققين القدرة على تسجيل موجز، المترجمة دون الخلوية Ca2 + إشارات في الموقع والتحقيق Ca2 + الإشارات في الخلايا داخل بهم بيئات الأصلي الذي لم يكن ممكناً سابقا. لتحقيق أقصى قدر من استرداد المعلومات من هذه التسجيلات عالية الاستبانة، التحليل المكاني والزماني المناسب من Ca2 + الإشارات مطلوب. تجدر الإشارة إلى أنه بينما يمكن أن توفر جيسيس بعض مزايا واضحة، قد كشفت الدراسات الأخيرة أن Ca2 + تصوير يمكن أن يتم بنجاح من إعداد كبيرة من السكان من مختلف الطبقات الكيميائية العصبية من الخلايا العصبية في وقت واحد باستخدام التقليدية Ca2 + المؤشرات التي لا يتم ترميز وراثيا في الحيوان35. هذا النهج المستخدمة immunohistochemistry المخصصة بعد الكشف عن عدة فئات مختلفة من الخلايا العصبية يطلقون النار على الترددات العالية في رشقات نارية متزامنة، وتجنب احتمال أنه قد يكون تدخل التعديلات الوراثية للحيوان مع الفسيولوجية سلوك المحقق يسعى إلى فهم35،36.
تيسير البروتوكولات المبينة في هذه الورقة تحليل أكثر اكتمالا والتحديد الكمي ل Ca2 + إشارات مسجل من الخلايا في الموقع باستخدام مزيج من الخريطة الزمانية المكانية (STM)-استناداً إلى التحليل والتحليل القائم على الجسيمات. كما وصف البروتوكولات كيف مختلف أنماط Ca2 + الإشارات الملحوظة في خلية مختلفة يمكن تحليل السكان في الموقع المناسب. للتوضيح، الطريقة التي ستدرس Ca2 + الإشارات في عدد سكان متخصصة من الخلايا في الأمعاء الدقيقة، الخلايا فراغي من كيال (المحكمة الجنائية الدولية). المحكمة الجنائية الدولية هي خلايا متخصصة في الجهاز الهضمي (غي) أن المعرض الحيوية داخل الخلايا Ca2 + إشارات، كما تصور استخدام الفئران معربا عن جكامبس37،،من3839،40، ،من 4142. Ca2 + العابرين في المحكمة الجنائية الدولية المرتبطة بالتنشيط من Ca2 +-تنشيط قنوات (المشفرة بواسطة Ano1) التي تعتبر مهمة في تنظيم استثارة العضلات الملساء المعوية الخلايا (سمكس)43، Cl– ،من 4445. وهكذا، دراسة Ca2 + إشارات في المحكمة الجنائية الدولية أمر أساسي لفهم حركية الأمعاء. الأمعاء موريني يقدم مثالاً ممتازا لهذه التظاهرة، كما أن هناك فئتين من المحكمة الجنائية الدولية أن تكون مفصولة تشريحيا ويمكن تصور بشكل مستقل: أنا) المحكمة الجنائية الدولية الموجودة في المنطقة الواقعة بين العضلات الملساء الطولية والدائرية طبقات، المحيطة الضفيرة myenteric (المحكمة الجنائية الدولية-بي). هذه الخلايا تعمل كخلايا تنظيم ضربات القلب، وتوليد النشاط الكهربائي المعروف بموجات بطيئة46،47،،من4849؛ ثانيا) المحكمة الجنائية الدولية أيضا تقع بين ضفيرة غنية بالمحطات الطرفية للخلايا العصبية الحركية (الضفيرة العضلية العميقة، وبالتالي المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث). هذه الخلايا تعمل كوسطاء ردود على كبيرة الحركية المعوية37،39،،من4050. بي-المحكمة الجنائية الدولية والمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث تختلف شكلياً Ca2 + إشارات سلوكهم تختلف جذريا على إنجاز المهام المحددة. المحكمة الجنائية الدولية-بلدي النجمية في الشكل وتشكل شبكة خلايا المترابطة عن طريق الفجوة تقاطعات51،52. Ca2 + إشارات في بيان المحكمة الجنائية الدولية-بلدي مختصرة ومترجمة مكانياً Ca2 + الإفراج عن الأحداث التي تقع في مواقع متعددة بشكل متزامن من خلال شبكة بي-المحكمة الجنائية الدولية كتصور داخل فوف (تصويرها مع هدف X 60)38. ويتم تنظيم هذه الإشارات غير متزامن وقتيا في الثانية 1 التكتلات التي، عندما جدولت معا، تصل إلى ارتفاع خلوية s 1 صافي في Ca2 +. هذه الإشارات نشر خلية إلى خلية داخل الشبكة المحكمة الجنائية الدولية وذلك تنظيم Ca2 + إشارات، وتولد من المواقع الفرعية الخلوية، في أنسجة واسعة Ca2 + موجه. تجميع الزمانية والجمع من Ca2 + إشارات في سمي المحكمة الجنائية الدولية-بلدي Ca2 + مجموعات عابرة (ريادية)38. تحدث ريادية إيقاعي (مماثلة تماما مثل المدد الزمنية وفترات مماثلة بين ريادية) 30 مرة في الدقيقة في الماوس. على العكس من ذلك، المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث محور الدوران على شكل خلايا، بعض العمليات الثانوية، التي توزع بين سمكس والعمليات العصبية دوالي ولا بشكل مستقل شبكة،من5152. بيد أن المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث تشكل تقاطعات الفجوة مع سمكس، وتعمل داخل هذا سينسيتيوم أكبر، المعروف باسم سينسيتيوم المسبار53. Ca2 + إشارات تحدث في مواقع متعددة على امتداد أطوال الخلايا، ولكن لم يتم العالق هذه العابرين أو وقتيا متفاوت المسافات، كما لوحظ في المحكمة الجنائية الدولية-بلدي37. Ca2 + إشارات في المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث تحدث بطريقة عشوائية، مع كثافات متغيرة والمدد الزمنية والمكانية الخصائص. البروتوكولات أدناه، باستخدام مثال Ca2 + إشارات في بلدي-المحكمة الجنائية الدولية والمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث، وصف تقنيات تحليل إشارات معقدة في أنواع معينة من الخلايا في الموقع. نحن تستخدم النظام ف لوكس Cre إيندوسيبلي للتعبير عن GCaMP6f حصرا في المحكمة الجنائية الدولية، بعد حمل تفعيل Recombinase لجنة المساواة العرقية (Cre) مدفوعا مروج المحكمة الجنائية الدولية محددة (مجموعة أدوات).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

Ca2 + تصوير الخلايا المعزولة أو أنواع محددة من الخلايا داخل أنسجة سليمة وكثيراً ما تكشف عن أنماط معقدة من Ca2 + إشارات. ويتطلب هذا النشاط تحليلات متأنية ومتعمقة، والتقدير الكمي لالتقاط قدر ممكن من المعلومات حول الأحداث الأساسية. المكانية، الزمانية وكثافة معلمات المضمنة إلى Ca2 + إشارات مثل تواتر ومدة، ونشر، والسرعة والسعة قد توفر بعض المعلومات البيولوجية اللازمة للإشارات داخل الخلايا. عالية الاستبانة Ca2 + التصوير عادة النتائج في الحصول على ملفات البيانات الكبيرة التي تستغرق وقتاً طويلاً للعملية من حيث ترجمة المعلومات التصوير إلى بيانات قابلة للقياس الكمي، وهذه العملية يمكن أن تكون عرضه للخطأ البشري والتحيز. تحليل Ca2 + الإشارات من الخلايا في الموقع يعتمد عادة على قياسات كثافة بسيطة من مناطق مختارة تعسفاً للفائدة (ROI) ضمن مجال رؤية (FOV). وهذا النهج يتجاهل الكثير من المعلومات الهامة إرسال الإشارات الواردة في فوف. وهكذا، من أجل تحقيق أقصى قدر من استرداد المعلومات من هذه التسجيلات عالية الدقة التي تم الحصول عليها مع Ca2 +الأصباغ أو أوبتوجينيتيك Ca2 + التحليل المكاني والزماني التصوير، والمناسبة من Ca2 + الإشارات مطلوب. وسيصف البروتوكولات المبينة في هذه الورقة كيف يمكن الحصول على حجم كبير من البيانات من Ca2 + تصوير تسجيلات لتيسير تحليل أكثر اكتمالا والتحديد الكمي ل Ca2 + الإشارات المسجلة من الخلايا باستخدام مزيج من خريطة الزمانية المكانية (STM)-استناداً إلى التحليل والتحليل القائم على الجسيمات. كما وصف البروتوكولات كيف مختلف أنماط Ca2 + الإشارات الملحوظة في خلية مختلفة يمكن تحليل السكان في الموقع المناسب. للتوضيح، الطريقة التي ستدرس Ca2 + إشارات في عدد سكان متخصصة من الخلايا في الأمعاء الدقيقة، الخلايا فراغي من كيال (ICC)، استخدام جيسيس.

استخدام الفئران كيت-لجنة المساواة العرقية-GCaMP6F (الشكل 1)، دينامية Ca2 + إشارات السلوكيات للمحكمة الجنائية الدولية في الجهاز الهضمي يمكن تصويرها في الموقع. مع الفحص المجهري [كنفوكل]، يمكن الحصول على صور عالية الاستبانة لفئات معينة من السكان للمحكمة الج...

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

وراثيا المرمزة Ca2 + المؤشرات (جيسيس) قد تغيرت تغيرا جذريا في الموقع كيف Ca2 + تصوير تتم. إلى أقصى حد ممكن لاستعادة البيانات من هذه التسجيلات، مطلوب تحليل Ca2 + إشارات مناسبة. البروتوكولات في هذه الورقة تيسير التحديد الكمي ل Ca2 + إشارات سجلت في الموقع باستخدام رسم الخرائط الزمانية المكانية والتحليل القائم على الجسيمات.

تطبيقات رسم الخرائط الزمانية وتقنيات تحليل الجسيمات للتحديد الكمي لداخل الخلية Ca2 + إشارات في الموقع

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

وقد تحسنت القدرة على الحصول على كميات كبيرة من البيانات من تجارب تصوير الكالسيوم بشكل كبير، وخاصة مع تجارب تصوير الأنسجة. تصف بروتوكولاتنا تقنيات التحليل المناسبة لتحديد مجموعات البيانات هذه ووصفها. بروتوكولاتنا تولد مجموعة من القيم المكانية والزمانية والكثافة التي هي جوهرية للإشارة الكالسيوم في الأنسجة بأكملها وهذا يمكن أن تضيع في التحليل أكثر بدائية المستندة.قبل ساعة واحدة من التصوير نقل الأمعاء الدقيقة حصادها من الماوس مع الخلايا الخلالية من Cajal أو ICC التي تعبر على وجه التحديد عن مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا إلى مرحلة المجهر النقسج القرص الغزل. و باستمرار يغرس الأنسجة مع 37 درجة مئوية كريبس-رينغر بيكربونات أو حل KRB. باستخدام 60 إلى 100 X التكبير تحديد موقع ممتاز على شكل plexus myenteric ICC أو ICC-MY بين طبقات العضلات السلسة الدائرية والطولية من الأمعاء الدقيقة.ثم حدد موقع الضفير العضلي العميق على شكل المغزل ICC أو ICC-DMP في مستوى واحد بين طبقة العضلات السلس الدائرية والصفعة الضفيرة دون المخاطية وحفظ الأفلام ككومة من صور TIFF. لإنشاء خرائط اعظمية أو STMs لنشاط الكالسيوم ICC-DMP افتح مكدس الصور في ImageJ، وانقر على الصورة والنوع و32 بت لتعديل جودة الصورة. لإنشاء خط المسح الضوئي بزر الماوس الأيمن فوق أداة تحديد الخط وحدد خط مجزأة.باستخدام نقرات واحدة اليسرى رسم خط على طول الوصول منتصف من الفردية ICC-DMP، النقر المزدوج عندما تم تحديد الخلية بأكملها. حدد الصورة والمكدسات والعيد. ستظهر نافذة منبثقة.حدد تدوير 90 درجة لتوجيه مسح الخط من اليسار إلى اليمين بحيث يمكن معايرته وقراءته في الوقت على المحور س مع مساحة على المحور ص وانقر فوق موافق. سوف تظهر الخريطة الوشقية الزمانية. لقياس سعة إشارات الكالسيوم من الخريطة بدقة، حدد التحديد المستطيل وارسم منطقة ذات أهمية حول المنطقة داخل STM التي تعرض المنطقة الأكثر تناسقًا والأقل كثافة من الفلور. انقر فوق تحليل و الرسم البياني للحصول على قيمة متوسطة للكثافة داخل المنطقة المحددة من الاهتمام وانقر فوق تحرير، تحديد، حدد الكل لتحديد STM بأكمله.بعد ذلك، انقر فوق معالجة، الرياضيات والقسمة وأدخل القيمة المتوسطة للكثافة مع منطقة STM المحددة التي تهم في المربع المنبثق. سيتحول الـ(ستم) إلى اللون الأسود قم بتصحيح هذا بالنقر فوق الصورة، الضبط، السطوع/التباين، والسيارات في النافذة المنبثقة.سيتم الآن معايرة مسح الخط لاتساع مع شدة الفلوريسنس التي تم التعبير عنها كـ الفلوريسكين مقسوماً على الفلوريسينتر الصفري. سيتم عرض STM عدد الإطارات في مكدس TIFF على المحور س وعدد بكسل يمثل طول الخلية على المحور ص. لتحديد حجم البيانات الزمنية والمكانية من إشارات الكالسيوم انقر فوق صورة وخصائص وأدخل القيم المناسبة لمعايرة STM كاملة للمساحة والوقت في النافذة المنبثقة.لتحليل أحداث الكالسيوم الفردية انقر فوق Straight Line وانقر واسحب على STM لرسم خط أفقي مستقيم عبر وسط حدث الكالسيوم موازياً لمحور س. ثم انقر فوق تحليل و ملف تعريف الرسم. سيظهر مربع يعرض ملف تعريف الرسم لحدث الكالسيوم.لتحليل الجسيمات المستندة إلى بيانات إشارات الكالسيوم ICC-MY، افتح ملف الفيلم في Volumetry وانقر بزر الماوس الأيمن لتحديد STK Filter، تمييز. انقر بزر الماوس الأيمن مرة أخرى لإدخال قيمة للتمييز. اضغط على Enter وانقر بزر الماوس الأيمن لبدء التمييز.لإنشاء الجسيمات، استخدم زر الماوس الأوسط للتمرير خلال الفيلم لتحديد مقطع إطار 20 إلى 40 يتضمن فترة هادئة، متبوعاً بحدوث كتلة عابرة الكالسيوم و 20 إلى 40 إطارًا يتبع مباشرة بعد الكتلة. عندما تم اختيار جميع الإطارات بزر الماوس الأيمن في نافذة الفيلم للوصول إلى STK OPS Ramp DS معلومات الجسيمات وانقر لتشغيل روتين تحليل الجسيمات التي سلالم تدريجيا عتبة من الحد الأقصى إلى الحد الأدنى كثافة. لضمان تحليل الجسيمات الناجحة، تأكد من أن تقوم بتضمين أكبر قدر من قبل الكالسيوم العابرة كتلة غير نشاط، وبقدر ما بعد الكالسيوم عابرة كتلة غير نشاط ما تستطيع.وهذا سوف يساعد على زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. سيتم عرض التحليل بيانيا في نافذة المؤامرة كما مؤامرة من الضوضاء وفي نافذة آثار كما آثار ثلاثة لون مع تتبع الأخضر الذي يمثل عدد من الجسيمات، التتبع الأحمر الذي يمثل متوسط حجم الجسيمات، واللرق الأزرق الذي يمثل عتبة كثافة المطلقة. إلى توازن الرسم البياني مؤامرة من الضوضاء الجسيمات اضغط H على لوحة المفاتيح.ثم اضغط على مفتاح القوس الأيمن للتنقل بين أنظمة الألوان حتى تكون الخلفية بيضاء مع آثار اللون في الأعلى. اضغط F على لوحة المفاتيح مرة واحدة لإحضار أداة قياس. ثم اضغط F مرة ثانية لوضع علامة على خط واحد عمودي في شريط التمرير من نافذة آثار على المؤامرة عند تقاطع حيث تبدأ المؤامرات الملونة للتحول إلى الجانب الأيمن.داخل نافذة تتبع استخدام زر الماوس الأوسط للتمرير من نقطة انقلاب من التتبع الأحمر إلى خط عمودي أبيض ملحوظ. بعد الإشارة إلى متوسط Y المعروض، انقر فوق زر الماوس الأوسط مرة أخرى داخل نافذة التتبع لإلغاء تحديد التتبع الأزرق. في إطار الفيلم انقر فوق C لإحضار عجلة لون و D لضبط العتبة.سيتم الآن عرض الجسيمات الصالحة باللون الأحمر، وتلك التي تشبع سوف تكون بيضاء. استخدم زر الماوس الأيسر للتمرير حتى تتم إزالة المناطق البيضاء واستخدام زر الماوس الأوسط لضبط القيمة الرقمية الصفراء في عجلة الألوان إلى متوسط القيمة Y لتعيين كل شيء باللون الأحمر كجسيمات عابرة الكالسيوم النشط عند نقطة العتبة المحددة. لحفظ البيانات كملف الجسيمات المستندة إلى إحداثي انقر بزر الماوس الأيمن للوصول إلى STK 3D، حفظ الجسيمات صفر، وانقر على اليسار لحفظ الملف.لإنشاء الجسيمات نشاط الحرارة الخرائط فتح ملف الجسيمات المحفوظة وانقر بزر الماوس الأيمن في نافذة الفيلم للوصول إلى الجسيمات STKops، StatMap العلم وأدخل واجبات العلم لتحليل. انقر لتطبيق التحليل وخريطة الحرارة التي تبين الجسيمات الإجمالية لكامل طول التسجيل بألوان مختلفة تمثل نسبة الحدوث في جميع أنحاء التسجيل. انقر بزر الماوس الأيمن لحفظ مخطط الحرارة كملف TIFF.ثم انقر بزر الماوس الأيمن في نافذة الفيلم للوصول إلى قياس الجسيمات ، وإحصائيات الجسيمات STK يساوي ، وأدخل واجب العلم للتحليل. سيتم إنشاء سلسلة من التعقب في نافذة التتبع. يوفر تحليل STM القدرة على رصد وتسجيل الخصائص المكانية لإشارات الكالسيوم، مثل الانتشار المكاني وسرعة الانتشار.يمكن جمع هذه المعلومات لتوفير عرض كامل بدلا من الكالسيوم إشارات السلوكيات داخل الخلايا في بيئاتهم الأصلية. وباستخدام تحليل الجسيمات، يمكن حساب المعلومات الكمية المتعلقة بالإشارة إلى الكالسيوم عن طريق قياس منطقة الجسيمات وعدد الجسيمات، والتي يمكن استخدامها معا لتحديد النطاقات المكانية لتنشيط إشارة الكالسيوم ضمن مجال محدد من الرؤية. كما يسمح تحليل الجسيمات بالكمي المتعمق لإشارات الكالسيوم دون الخلية من خلال فحص الموقع واحتمالات إطلاق النار في مواقع إطلاق الكالسيوم.من خلال تخصيص الجسيمات في أعلام مختلفة على أساس خصائصها الزمنية ، يمكن تعيين الجسيمات البادئة بدقة. وثروة من البيانات الثابتة التي تم الحصول عليها على عدد مواقع البدء، وحجم الموقع بالبكسل والميكروفيترات، واحتمال إطلاق كل موقع للبدء إما مرة أو عدة مرات خلال كل كتلة عابرة الكالسيوم، ونسبة مواقع إطلاق النار التي تطلق خلال كل دورة عنقودية عابرة الكالسيوم يمكن الحصول عليها. الاتساق هو مفتاح النجاح في هذا البروتوكول.يجب معاملة جميع مجموعات البيانات وجميع الأفلام بنفس الطريقة لضمان نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. هذا صحيح خصوصا عند التعامل مع ملفات الجسيمات. تسمح بروتوكولاتنا بتحديد عميق لإشارات الكالسيوم في الموقع ، ويمكن لمجموعة من الطرق الإحصائية ، عند استخدامها بشكل مناسب ، تقييم الاختلافات بين مجموعة من المعلمات المكانية والزمانية.وقد سمحت تقنيات التحليل هذه في بروتوكول لدينا للباحثين لطرح والإجابة على الأسئلة التي لم يسبق لها معالجة والمتعلقة بتداخل ضربات القلب المعوية ، و القاعات المعوية ، فضلا عن السيطرة العصبية في المسالك البولية السفلى.

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

تقنيات التصوير كاليفورنيا 2 + في اشارة الى الحيوانات المنوية البشرية

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

تصور كا الأوعية الدموية 2 + اشارة سببها ريوس المشتقة نظير الصماوي

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

قياس الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2 +</sup&gt; التغييرات في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام تقنيات أربعة: قياس التألق التقليدية، وتوقفت قياس التألق التدفق، التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

التحليل الآلي من ديناميك كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; إشارات في تسلسلات الصور

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

رسم الخرائط البصرية البينية العضلية شبكية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; وإمكانية الغشاء في قلب الأرنب Langendorff perfused-

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...