Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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国家民主发展委员会通过 p01 dk41315 提供了资金。

本研究中使用的所有动物和执行的协议都符合国家实验室动物护理和使用健康研究所的规定。所有程序都得到了里诺内华达大学动物使用和护理机构委员会的批准。
1. kitgamp6f 小鼠的产生
<ol><li>cross ai95 (rcl-gmp6f)-d (gmp6f 小鼠) 和 c-kit+ cre-ert2 (kit-cree) 生成 icc 特定 gmp6f 表示动物 (kit-cre-gmp6-小鼠)。 请注意:GCaMP6f 的使用是由于其报告的效率, 在局部, 短暂的?...

ca2 +对完整组织内或细胞网络内特定类型细胞的成像通常揭示 ca2 +瞬态的复杂模式。这项活动需要认真和深入的分析和量化, 以获取尽可能多的关于这些事件的基本事件和动力学的信息。stm 和 ptcl 分析提供了一个机会, 最大限度地增加了从这种类型的录音中获得的定量数据的数量。
icc-dmp 的窄纺锤形形态使其非常适合从上述 stm 中获得的 stm 分析。但是, 此分析?...

ca2+是一种无处不在的细胞内信使, 它控制着广泛的细胞过程, 如肌肉收缩1,2, 代谢3, 细胞增殖3,4,5、刺激神经末梢的神经递质释放 6,7, 激活细胞核内的转录因子。7细胞内 ca2 +信号通常采取的形式, 在细胞质 ca2 +的瞬态升高, 这些可能是自发的或产生的激动剂刺激取决于细胞类型 8。ca2 +信号固有的空间、时间和强度参数, 如频率、持续时间、传播、速度和振幅, 可以提供细胞内信号5所需的生物信息.7.,9. 细胞质ca 2 +信号可能是由于细胞外空间中的 ca2 +的涌入, 也可能是通过 ca 2+释放通道 (er) 从内质网 (er) 中释放的 a2 +释放 (er), 如 ryanodine 受体(ryr) 和肌醇-三磷酸盐受体 (ip 3r)10。ryr 和 ip3r都可能有助于 ca2 +信号的生成, 这些通道的协调开放, 再加上各种 ca2 +流入机制, 可能会产生无数的 ca2 +信号模式由 ca2 +流入通道的数量和开放概率、ca2 +释放通道的表达谱、ca2 +流入和释放通道之间的接近度以及 ca 2 的表达式和分布所塑造的.+再摄取和挤出蛋白。ca2 +信号的形式可能是均匀、持久、高强度的全球振荡, 可能持续几秒钟甚至几分钟, 传播细胞内和细胞内的 ca 2+波, 这些波可能跨越细胞内的距离超过 100μm10、11、12、13、14、15、16或更简短的空间本地化事件, 如 ca2 +火花和 ca2 +喷口发生在几十毫秒的时间尺度上, 传播小于 5μm17、18、19、20。
荧光显微镜已被广泛用于监测 ca2 +信号在分离和培养的细胞和完整的组织。传统上, 这些实验涉及使用荧光 ca2 +指示器、比率和非比率染料, 如 fura2、fluo 或 rhod2 等, 以及21、22、23。这些指标被设计成可渗透到细胞膜, 然后通过内源性酯酶被酯组的裂解困在细胞中。当细胞和组织被适当波长的光照射时, ca2 +与高亲和力指标的结合会导致荧光的变化。细胞渗透性 ca2 +指标的使用极大地增进了我们对活细胞中 ca2 +信号的理解, 并允许通过检测 ca2 +信号来实现这些信号的空间分辨率和量化通过其他手段, 如电生理。但是, 传统的 ca2 +指标有几个限制, 例如在较长的记录周期内发生的光漂白24。虽然较新的 ca2 +指示染料 (如 cal520/ad990) 大大提高了信噪比和检测局部 ca2 +信号25的能力, 但光漂白问题仍然是一些研究人员关注的问题26,27,28。缓慢的光漂白还限制了可用于录制的放大倍率、图像采集速率和分辨率, 因为增加的目标功率和更高的图像采集速率需要增加激发光强度, 而增加光漂白。
传统 ca2 +指示染料的这些局限性在现场记录 ca2 +信号时 (例如, 在记录来自完整组织的细胞内 ca2 +信号时) 会加剧。由于上述问题, 使用细胞渗透 ca 2 + 指示器就地显示 ca2 +信号仅限于低功耗放大倍率和降低图像捕获率, 限制了调查人员记录和记录图像的能力。量化时间或空间上受限的亚细胞 ca2 +信号。因此, 很难捕获、分析和欣赏 ca2 +信号的空间和时间复杂性, 这在生成所需的生物响应时非常重要, 如上文所述。对来自原位细胞的 ca2 +信号的分析通常依赖于来自视场 (fov) 范围内选定感兴趣区域 (roi) 的简单强度测量。任意选择 roi 的数量、大小和位置, 取决于研究人员的一时冲动, 会严重偏向所获得的结果。除了投资回报率分析的固有偏差外, 这种方法忽略了 fov 中包含的许多重要信令信息, 因为选择任意选择的 roi 中的动态 ca2 +事件进行分析。此外, 对 roi 的分析未能提供有关所观察到的 ca2 +信号的空间特性的信息。例如, 可能无法区分由传播的 ca 2+波引起的 ca2 +的上升和高度本地化的 ca2 +释放事件与 roi 内 ca2 +信号的表格。
基因编码 ca2 +指标 (gecis) 的出现从根本上改变了 ca2 +成像在现场进行29、30、31、32、33的方式.与染料相比, 使用 geci 有几个优点。也许最重要的是, geci 的表达可以以细胞特定的方式进行, 从而减少不感兴趣的细胞不必要的背景污染。与传统的 ca2 +指标相比, geci 的另一个优点是光漂白减少 (因为与染色样品相比, 只有在细胞处于活动状态时才会出现荧光和随之而产生的光漂白), 尤其是在高的情况下放大倍率和高图像捕获率34。因此, 利用 gecis 成像, 例如 gcam 系列光成因传感器, 使研究人员能够在现场记录简短的、局部的亚细胞 ca2 +信号, 并在其细胞内研究 ca2 +信号。以前无法实现的本机环境。为了最大限度地从这种高分辨率记录中恢复信息, 需要对 ca2 +信号进行适当的空间和时间分析。需要注意的是, 虽然 geci 可以提供一些明显的优势, 但最近的研究表明, ca2 +成像可以成功地从不同神经化学类的神经元的大量人群中成功地使用传统的ca2 +指标, 不是基因编码到动物35。这种方法使用后组织化, 以揭示多个不同类别的神经元在同步爆发中在高频放电, 并避免了对动物的基因改造可能干扰生理的可能性调查人员试图理解35,36的行为。
本文概述的方案有助于更完整地分析和量化 ca 2 + 信号记录从细胞就地使用相结合的时空图 ( stm) 基于分析和粒子分析。这些协议还描述了如何在不同的细胞群中就地观察到的 ca2 +信号的不同模式进行适当的分析。为了说明, 该方法将检查 ca2 +信号在一个专门的人群的细胞在小肠, 间质细胞的 cajal (icc)。icc 是胃肠道 (gi) 中的特殊细胞, 表现出动态的细胞内 ca2 +信号, 可视化使用小鼠表达 gcam37,38,39,40, 41,42。ca2 +瞬态连接到激活 ca2 +激活 cl通道(由ano1编码), 这对于调节肠道平滑肌细胞 (smc)43的兴奋性非常重要, 44,45。因此, 在 icc 中研究 ca2 +信号是理解肠道运动的基础。小鼠小肠为这次演示提供了一个很好的例子, 因为有两类 icc 是解剖分离的, 可以独立地可视化: i) icc 位于圆形和纵向平滑肌之间的区域层, 周围的肠系膜神经丛 (icc-my)。这些细胞作为起搏器细胞, 并产生被称为慢波46,47,48,49的电活动;ii) icc 也位于一个神经丛中, 具有丰富的运动神经元 (深肌神经丛, 因此 icc-dmp) 的终端。这些细胞是对肠道运动神经传递的反应的介质 37,39,40,50。icc-my 和 icc-dmp 在形态上是不同的, 它们的 ca 2 +信令行为在完成其特定任务时具有根本的差异。icc-my 被星状, 并通过间隙连接 51, 52 形成一个相互连接的单元网络。icc-my 中的 ca2 +信号为简短且空间本地化的 ca2 +释放事件, 通过 icc-my 网络异步发生在多个站点上, 在 fov (以60x 目标进行成像)中可视化。这些异步信号被临时组织成1秒的集群, 如果一起制表, 相当于 ca2 + 中净 1的细胞上升。这些信号在 icc 网络内从细胞传播, 从而将从亚细胞位点生成的 ca2 +信号组织到组织宽 ca2 +波中。icc-my 中 ca2 +信号的时间聚类和求和被称为 ca2 +瞬态聚类 (ctc)38。ctc 有节奏地发生 (例如, 在小鼠体内每分钟发生30次类似的持续时间和类似的 ctc 之间的时间)。相反, icc-dmp 是纺锤形细胞, 有的具有二次处理, 分布在 smc 和静脉曲张神经过程之间, 并不独立形成网络51,52。然而, icc-dmp 形成与 smc 的缝隙连接, 并在这个更大的合胞体 (称为 sip 合胞53) 中发挥作用。ca2 +信号发生在细胞长度沿线的多个点, 但这些瞬态并不被夹带或暂时聚集, 正如在 icc-my37 中观察到的那样。icc-dmp 中的 ca2 +信号以随机方式发生, 具有不同的强度、持续时间和空间特征。下面的协议, 使用 icc-my 和 icc-dmp 中的 ca2 +信令示例, 描述了在特定类型的原位细胞中分析复杂信号的技术。我们利用诱导 cre-lox p 系统在 icc 中专门表达 gmp6f, 在诱导由 icc 特定启动子 (kit) 驱动的 Cre-Lox 酶 (cre) 激活后。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

ca2 +完整组织中分离细胞或特定类型细胞的成像通常揭示 ca2 +信号的复杂模式。这项活动需要仔细和深入的分析和量化, 以获取尽可能多的基础事件信息。ca2 +信号固有的空间、时间和强度参数, 如频率、持续时间、传播、速度和振幅, 可能提供细胞内信号所需的一些生物信息。高分辨率 ca2 +成像通常会导致获取大型数据文件, 这些文件在将成像信息转换为可量化的数据方面非常耗时, 并且此过程容易受到人为错误和偏差的影响。对来自原位细胞的 ca2 +信号的分析通常依赖于来自视场 (fov) 内任意选择的感兴趣区域 (roi) 的简单强度测量。这种方法忽略了 fov 中包含的许多重要信令信息。因此, 为了最大限度地从使用 ca2 +染料或光遗传学 ca2 +成像获得的高分辨率记录中恢复信息, 需要对 ca2 +信号进行适当的空间和时间分析。本文概述的协议将描述如何从 ca2 +成像记录中获得大量数据, 以促进更完整地分析和量化从细胞中记录的 ca2 +信号, 该信号使用基于时空图 (stm) 的分析和基于粒子的分析。这些协议还描述了如何在不同的细胞群中就地观察到的 ca2 +信号的不同模式进行适当的分析。为了说明, 该方法将检查 ca2 +信号在一个专门的群体的细胞在小肠, 间质细胞的 cajal (icc), 使用 gecis。

利用 kit-cre-gmcmp6f 小鼠 (图 1), 可以对 icc 在胃肠道中的动态 ca2 +信号行为进行原位成像。通过共聚焦显微镜, 可以在不污染来自 icc 其他种群的信号的情况下获得 icc 特定种群的高分辨率图像, 但在解剖上不同的焦点平面上 (图 2a)37,39,40,<sup class...

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Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

基因编码的 ca 2 +指标 (geci) 从根本上改变了原位 ca2 +成像的执行方式。为了最大限度地从此类记录中恢复数据, 需要对 ca2 +信号进行适当分析。本文的规程利用时空映射和粒子分析, 便于对现场记录的 ca2 +信号进行量化。

时空映射和粒子分析技术在细胞内 ca2 +原位信令定量中的应用

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

从钙成像实验中获取大量数据的能力已大大提高，尤其是组织成像实验。我们的协议描述了用于量化和描述这些数据集的适当分析技术。我们的协议生成一系列空间、时间和强度值，这些值是整个组织中钙信号所固有的，在更基本的分析中可能会丢失这些值。在成像前一小时，从具有Cajal或ICC间细胞的小鼠中采集的小肠，这些小肠专门将基因编码的钙指示器表达到旋转盘共合显微镜的阶段。并持续用37摄氏度的克雷布斯-林格碳酸氢盐或KRB溶液对组织进行持续吸附。使用 60 到 100 X 放大镜定位小肠的圆形和纵向平滑肌肉层之间的硬质状肠状肠状丛ICC或ICC-MY。然后将主轴形状的深肌肉丛ICC或ICC-DMP定位在圆形平滑肌肉层和亚木科形丛之间的单平面上，将影片保存为一叠TIFF图像。要创建 ICC-DMP 钙活性的时空贴图或 SM，请打开 ImageJ 中的图像堆栈，然后单击"图像、类型"和"32 位"以修改图像质量。要创建线扫描，请右键单击线选择工具并选择分段线。使用单个左键单击沿单个 ICC-DMP 的中游绘制一条线，当整个单元格被勾勒出后，双击。选择图像、堆栈和重新滑梯。将显示一个弹出窗口。选择"旋转 90 度"可从左向右定位线扫描，以便可以校准线扫描，并针对 x 轴上的时间读取，并在 y 轴上显示空间，然后单击"确定"。将出现时空地图。要准确测量地图中钙信号的振幅，请选择矩形选择，并在 STM 内显示最均匀、最不强烈的荧光区域的区域周围绘制一个感兴趣区域。单击"分析"和"直方图"以获取所选感兴趣区域内强度的均值，然后单击"编辑、选择、选择全部"以选择整个 STM。接下来，单击"过程"、"数学"和"分割"，并在弹出框中使用所选的 STM 区域输入强度的均值。STM 将变黑。通过单击弹出窗口中的"图像、调整、亮度/对比度"和"自动"来更正这一点。线扫描现在将校准振幅，荧光的强度表示为荧光除以零荧光。STM 将显示 x 轴上的 TIFF 堆栈中的帧数以及表示 y 轴上单元格长度的像素数。要量化钙信号的时空数据，请单击"图像和属性"并输入相应的值，以在弹出窗口中完全校准 STM 的空间和时间。要分析单个钙事件，请单击"直线"并单击并拖动 STM 以通过与 x 轴平行的钙事件中心绘制一条直线水平线。然后单击"分析和绘制配置文件"。将显示一个框，显示钙事件的情节配置文件。要对 ICC-MY 钙信号数据进行基于粒子的分析，请在音量中打开影片文件，右键单击以选择 STK 过滤器，进行区分。再次右键单击以输入要区分的值。按 Enter 和左键单击以启动差异化。要创建粒子，请使用鼠标中间按钮滚动影片，选择包含静止周期的 20 到 40 帧部分，然后是钙瞬态聚类和群集后 20 到 40 帧的间隔。当在影片窗口中选择所有帧时，右键单击以访问 STK OPS Ramp DS 粒子信息，然后单击以运行粒子分析例程，该例程将逐步将阈值从最大值提升至最小强度。为确保成功的粒子分析，请确保尽可能多地包含钙前瞬态聚类非活性，以及尽可能多的钙后瞬态聚类非活性。这将有助于提高信噪比。分析将在绘图窗口中以图形方式显示为噪声图，在跟踪窗口中显示为三种颜色轨迹，绿色轨迹表示粒子数，红色轨迹表示平均颗粒大小，蓝色轨迹表示绝对强度阈值。要平衡直方图，粒子噪声图按键盘上的 H。然后按右括号键循环通过配色方案，直到背景为白色，顶部有颜色痕迹。一次按键盘上的 F 可启动测量工具。然后按 F 第二次，在有色图开始向右侧移动的交叉点处的绘图上的轨迹窗口的滚动条中标记一条垂直线。在跟踪窗口中，使用鼠标中间按钮从红色轨迹的拐点滚动到标记的白色垂直线。注意到显示的 Y 平均值后，再次单击跟踪窗口中的中间鼠标按钮以取消选择蓝色跟踪。在影片窗口中单击 C 以启动色轮，单击 D 以调整阈值。有效粒子现在显示为红色，饱和的粒子将为白色。使用鼠标左键滚动，直到删除白色区域，并使用鼠标中间按钮将色轮中的黄色数值调整为 Y 平均值，以在确定阈值点将红色所有内容作为活性钙瞬态颗粒分配。要将数据另存为基于坐标的粒子文件，右键单击以访问 STK 3D，请保存粒子零，左键单击以保存文件。要创建粒子活动热图，请打开保存的粒子文件，并在影片窗口中右键单击以访问粒子 STKops、StatMap 标志并输入要分析的标记分配。单击以应用分析和热图，显示整个记录长度的总粒子，具有不同的颜色，表示整个录制过程中发生的百分比。右键单击以将热图保存为 TIFF 文件。然后在影片窗口中右键单击以访问粒子度量、粒子统计 STK 等于，并输入用于分析的标记分配。将在跟踪窗口中生成一系列跟踪。STM 分析提供监控和记录钙信号的空间特征的能力，例如空间传播和传播速度。这些信息可以积累起来，以提供一个相当完整的钙信号行为在其原生环境中的细胞。利用粒子分析，可以通过测量粒子面积和粒子计数来计算钙信号的定量信息，这些量值一起可用于确定指定视野内钙信号激活的空间范围。粒子分析还允许通过检查钙燃烧点的位置和发射概率，对亚细胞钙信号进行深度定量。通过将粒子根据时间特征分配给不同的标志，可以精确映射启动粒子。在启动站点数量、站点大小（以像素和千分）为单位、每个启动站点在每个钙瞬态聚类中发射一次或多次的概率以及每个钙瞬态聚类周期中发射位置的百分比等获取大量硬数据。一致性是此协议成功的关键。所有数据集和所有影片必须完全相同，以确保可靠、可重复的结果。在处理粒子文件时尤其如此。我们的协议允许对钙信号进行深层原位表征，一系列统计方法在适当使用时可以评估一系列空间和时间参数之间的差异。我们的协议中的这些分析技术使研究人员能够提出和回答以前无法解决的问题，这些问题与肠道起搏、肠道内膜以及下尿道的神经元控制有关。

Research

JoVE Journal

Biology

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