Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Finansieringen blev leveret af NIDDK via P01 DK41315.

Alle forsøgsdyr og de protokoller, der er foretaget i denne undersøgelse var i overensstemmelse med de nationale institutter sundhed Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle procedurer blev godkendt af institutionelle dyr brug og efterbehandling Udvalget på University of Nevada, Reno.
1. generation af KitGCaMP6f mus
<ol><li>Cross Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f mus) og c-Kit+/ Cre-ERT2 (Kit-Cre mus) til at generere ICC specifikke GCaMP6f udtrykker dyr (Kit-Cre-GCaMP6f m...

Ca2 + billeddannelse af bestemte typer celleområde intakt væv eller inden for netværk af celler ofte afslører komplekse mønstre af Ca2 + transienter. Denne aktivitet kræver omhyggelig og dybdegående analyser og kvantificering til at fange så mange oplysninger om de underliggende begivenheder og kinetik af disse begivenheder som muligt. STM og PTCL analyse giver en mulighed for at maksimere mængden kvantitative data givet fra optagelser af denne type.
Smalt, spind...

Ca2 + er en allestedsnærværende intracellulære messenger, som styrer en lang række cellulære processer såsom muskel sammentrækning1,2, stofskifte3, celle spredning3,4, 5, stimulering af neurotransmitter frigivelse på nerve terminaler6,7, og aktivering af transskription faktorer i cellekernen. 7 intracellulære Ca2 + signaler ofte tage form af forbigående stigninger i cytosole Ca2 +, og disse kan være spontan eller opstå som følge af agonist stimulation afhængigt af celle type8. Spatial, tidsmæssige og intensitet parametre iboende til Ca2 + signaler som hyppighed, varighed, formering, hastighed og amplitude kan give de biologiske oplysninger kræves til intracellulær signalering5, 7 , 9. cytoplasmatisk Ca2 + signaler kan skyldes en tilstrømning af Ca2 + fra det ekstracellulære rum eller via Ca2 + frigivelse fra det endoplasmatiske reticulum (ER) via Ca2 + release kanaler såsom ryanodine receptorer (RyRs) og inositol-tri-fosfat receptorer (IP3Rs)10. RyRs og IP3Rs kan både bidrage til generation af Ca2 + signaler og samordnet åbningen af disse kanaler, som kombineret med forskellige Ca2 + tilstrømning mekanismer kan resultere i et utal af Ca2 + signalering mønstre der er formet af numrene og åbne sandsynligheden af Ca2 + tilstrømning kanaler, udtryk-profil af Ca2 + release kanaler, nærhed mellem Ca2 + tilstrømning og slippe kanaler, og udtryk og distribution af Ca2 + reuptake og ekstrudering proteiner. Ca2 + signaler kan tage form af ensartede, lang holdbarhed, høj intensitet globale svingninger, der kan vare i flere sekunder eller endda minutter, formerings intracellulære og intercellulære Ca2 + bølger, der kan passere intracellulære afstande over 100 µm10,11,12,13,14,15,16, eller flere kort, rumligt lokaliseret begivenheder såsom Ca2 + sparks og Ca2 + pust, der forekommer på snesevis af millisekund tidsfrister og sprede mindre end 5 µm17,18,19,20.
Fluorescerende mikroskopi har været anvendes bredt til at overvåge Ca2 + signalering i isolerede og kulturperler celler og i intakt væv. Traditionelt disse eksperimenter involveret brug af fluorescerende Ca2 + indikatorer, ratiometric og ikke-ratiometric farvestoffer såsom Fura2, Fluo3/4 eller Rhod2, blandt andre 21,22,23. Disse indikatorer var designet til at blive gennemtrængelig for cellemembraner og derefter blive fanget i cellerne ved spaltning af en ester gruppe via endogene esteraser. Binding af Ca2 + høj affinitet indikatorer forårsaget ændringer i fluorescens når celler og væv blev belyst ved relevante bølgelængder af lys. Brug af celle gennemtrængelig Ca2 + indikatorer styrket vores forståelse af Ca2 + signalering i levende celler og tilladt rumlige opløsning og kvantificering af disse signaler, det ikke var muligt af aflæst Ca2 + signaler gennem andre midler, såsom Elektrofysiologi. Traditionelle Ca2 + indikatorer har dog flere begrænsninger, såsom photobleaching, der opstår over udvidede optagelse perioder24. Mens nyere Ca2 + indikator farvestoffer som Cal520/590 har stærkt forbedret signal til støj-forhold og evnen til at opdage lokale Ca2 + signaler25, kan problemer med photobleaching stadig forblive et anliggende for nogle efterforskere 26,27,28. Stejle photobleaching også begrænser forstørrelsen, sats på billede erhvervelse, og beslutning, som kan bruges for optagelser, da øget objektive magt og højere priser for image erhvervelse kræver øget excitation lysintensiteten, øger photobleaching.
Disse begrænsninger af traditionelle Ca2 + indikator farvestoffer er forværret ved registrering af Ca2 + signaler på stedet, for eksempel når optagelse intracellulære Ca2 + signaler fra intakt væv. På grund af ovennævnte problemer visualisering af Ca2 + signaler i situ ved hjælp af celle gennemtrængelig Ca2 + indikatorer har været begrænset til lavt strømforbrug forstørrelse og nedsatte billedoptagelse, begrænsende evne til efterforskerne til at optage og kvantificere tidsmæssigt eller geografisk begrænset subcellulært Ca2 + signaler. Således har det været vanskeligt at indsamle, analysere og værdsætter den rumlige og tidsmæssige kompleksitet af Ca2 + signaler, som kan være vigtige i generation af ønskede biologiske reaktioner, som skitseret ovenfor. Analyse af Ca2 + signaler fra celler in situ typisk bygger på enkle intensitet målinger fra udvalgte områder af interesse (ROI) i en field of view (FOV). Den vilkårlige valg af antallet, størrelsen og placeringen af ROIs, afhængig af indfald af forskeren kan alvorligt bias de opnåede resultater. Samt iboende bias med ROI analyse, denne tilgang ignorerer meget af den vigtige signalering oplysningerne i FOV, som dynamisk Ca2 + begivenheder inden for et vilkårligt valgte ROI er udvalgt til analyse. Derudover undlader analyse af ROIs at give oplysninger om de rumlige Karakteristik af Ca2 + signaler observeret. For eksempel, kan det ikke være muligt for at skelne mellem en stigning i Ca2 + som følge af en formerings Ca2 + bølge og et stærkt lokaliseret Ca2 + frigive begivenhed fra tabuleringerne af Ca2 + signaler inden for en ROI.
Fremkomsten af genetisk kodet Ca2 + indikatorer (GECIs) har radikalt ændret hvordan Ca2 + imaging kan være udført i situ29,30,31,32,33 . Der er flere fordele ved at bruge GECIs over farvestoffer. Det vigtigste er måske, udtryk for GECI kan udføres på en bestemt måde, celle, som reducerer uønskede baggrundsforurening fra celler ikke af interesse. En anden fordel ved GECIs over traditionelle Ca2 + indikatorer er at photobleaching reduceres (som fluorescens og som følge heraf photobleaching kun opstår Hvornår celler er aktive), sammenlignet med farvestof-loaded enheder, især ved høje forstørrelse og høje image capture34. Således imaging med GECIs, som GCaMP serien af sensorer, optogenetic, frembyder efterforskere evnen til at optage korte, lokaliserede subcellulære Ca2 + -signaler i situ og undersøge Ca2 + signalering i celler inden for deres Native miljøer, der ikke har været muligt tidligere. For at maksimere inddrivelsen af oplysninger fra sådanne høj opløsning optagelser, er passende rumlige og tidsmæssige analyse af Ca2 + signaler påkrævet. Det skal bemærkes, at mens GECIs kan tilbyde nogle klare fordele, de seneste undersøgelser har vist, at Ca2 + imaging kan udføres med succes fra store bestande af forskellige neurokemiske klasser af neuroner samtidigt ved hjælp af konventionelle Ca2 + indikatorer, der ikke er genetisk kodet ind i den animalske35. Denne fremgangsmåde anvendes post hoc Immunohistokemi til at afsløre flere forskellige klasser af neuroner fyring i høj frekvens i synkroniseret brister, og undgået det potentiale, som genetiske modifikationer til dyret kan have blandet sig med de fysiologiske adfærd investigator søger at forstå35,36.
De protokoller, der er skitseret i dette papir lette mere fuldstændig analyse og kvantificering af Ca2 + -signaler registreres fra celler på stedet ved hjælp af en kombination af spatiotemporelle kort (STM)-baseret analyse og partikel-baseret analyse. Protokollerne beskriver også, hvordan forskellige mønstre af Ca2 + signalering observerede i forskellige celle populationer på stedet kan analyseres korrekt. Illustration, vil metoden undersøge Ca2 + signalering i en specialiseret population af celler i tyndtarmen, interstitielle celler af Cajal (ICC). ICC er specialiserede celler i den gastrointestinal (GI) tarmkanalen, der udviser dynamisk intracellulære Ca2 + signalering, som visualiseres ved hjælp af mus at udtrykke GCaMPs37,38,39,40, 41,42. Ca2 + transienter i ICC er knyttet til aktivering af Ca2 +-aktiveret Cl- kanaler (kodet af Ano1), der er vigtige i reguleringen af ophidselse af intestinal glat muskel celler (SMCs)43, 44,45. Undersøgelse af Ca2 + signalering i ICC er således grundlæggende at forstå tarmens motilitet. Murine tyndtarmen tilbyder et fremragende eksempel for denne demonstration, som der er to klasser af ICC, der er anatomisk separeret, kan visualiseres uafhængigt: Jeg) ICC er beliggende i området mellem den cirkulære og langsgående glatte muskulatur lag, omkring myenteric plexus (ICC-min). Disse celler fungerer som pacemaker celler og generere den elektriske aktivitet kendt som langsom bølger46,47,48,49; II) ICC ligger også blandt en plexus rig på terminaler motor neuroner (dyb muskuløs plexus, således ICC-DMP). Disse celler fungerer som mediatorer af svar til enteriske motor neurotransmission37,39,40,50. ICC-MY og ICC-DMP er Morfologisk adskiller sig, og deres Ca2 + signaling adfærd afviger radikalt for at udføre deres specifikke opgaver. ICC-min er Stjernehus i form og danne et netværk af sammenkoblede celler via gap vejkryds51,52. Ca2 + -signaler i ICC-min manifest som kort og rumligt lokaliseret Ca2 + release hændelser på flere websteder asynkront gennem det ICC-mit netværk som visualiseret i en FOV (afbildet med en 60 X mål)38. Disse asynkrone signaler er inddelt tidsmæssigt i 1 sekund klynger der, når tabuleres sammen, beløber sig til en netto 1 s cellulære stigning i Ca2 +. Signalerne udbreder celle til celle i ICC netværket og derfor organisere Ca2 + signalering, genereret fra subcellulære websteder, i et væv bred Ca2 + bølge. Tidsmæssige klyngedannelse og summation af Ca2 + -signaler i ICC-min er blevet kaldt Ca2 + forbigående klynger (CTCs)38. CTCs forekomme rytmisk (fx ganske lignende varigheder og lignende perioder mellem CTCs) 30 gange pr. minut i musen. Omvendt, ICC-DMP er spindel formet celler, nogle med sekundære processer, der distribuerer mellem SMCs og åreknuder nerve processer og ikke selvstændigt danne et netværk51,52. ICC-DMP form gap vejkryds med SMCs, men og funktion inden for denne større syncytium, kendt som SIP syncytium53. Ca2 + signaler forekomme på flere steder langs længder af celler, men disse transienter er ikke medrives eller tidsligt klynger, som bemærket ICC-min37. Ca2 + signaler i ICC-DMP forekommer på stokastiske måde, med varierende intensitet, varighed og rumlige egenskaber. Protokollerne nedenfor, ved hjælp af eksemplet med Ca2 + signalering i ICC-MY og ICC-DMP, beskriver teknikker til at analysere komplekse signalering i bestemte typer af celler på stedet. Vi udnyttede det inducerbare Cre-Lox p system for at udtrykke GCaMP6f udelukkende i ICC, efter inducerende aktivering af Cre-Recombinase (Cre) drevet af en ICC specifikke promotor (Kit).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

Ca2 + billeddannelse af isolerede celler eller bestemte typer af celler i intakt væv ofte afslører komplekse mønstre af Ca2 + signalering. Denne aktivitet kræver omhyggelig og dybdegående analyser og kvantificering til at fange så mange oplysninger om de underliggende arrangementer som muligt. Spatial, tidsmæssige og intensitet parametre iboende til Ca2 + signaler som hyppighed, varighed, formering, hastighed og amplitude kan give nogle biologiske oplysninger kræves til intracellulær signalering. Høj opløsning Ca2 + imaging typisk resulterer i anskaffelsen af store datafiler, der er tidskrævende proces med hensyn til at oversætte de billeddiagnostiske oplysninger i kvantificerbare data, og denne proces kan være modtagelige for menneskelige fejl og bias. Analyse af Ca2 + signaler fra celler in situ typisk bygger på enkle intensitet målinger fra vilkårligt udvalgte områder af interesse (ROI) i en field of view (FOV). Denne tilgang ignorerer meget vigtig signalfunktion oplysningerne i FOV. Således, for at maksimere inddrivelsen af oplysninger fra sådanne høj opløsning optagelser opnået med Ca2 +farvestoffer eller optogenetic Ca2 + imaging, passende rumlige og tidsmæssige analyse af Ca2 + signaler er påkrævet. De protokoller, der er beskrevet i denne hvidbog vil beskrive, hvordan en stor mængde data kan fås fra Ca2 + imaging optagelser at lette mere fuldstændig analyse og kvantificering af Ca2 + signaler registreret fra celler ved hjælp af en kombination af spatiotemporelle kort (STM)-baseret analyse og partikel-baseret analyse. Protokollerne beskriver også, hvordan forskellige mønstre af Ca2 + signalering observerede i forskellige celle populationer på stedet kan analyseres korrekt. Illustration, vil metoden undersøge Ca2 + signalering i en specialiseret population af celler i tyndtarmen, interstitielle celler af Cajal (ICC), ved hjælp af GECIs.

Ved hjælp af Kit-Cre-GCaMP6F mus (figur 1), dynamisk Ca2 + signalering opførsel af ICC i mave-tarmkanalen kan være afbildet på stedet. Med Konfokal mikroskopi, kan høj opløsning billeder af bestemte populationer af ICC erhverves uden forurener signaler fra andre populationer af ICC i det samme væv, men i anatomisk adskilte fly af fokus (figur 2A)37 , 39 ...

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetisk kodet Ca2 + indikatorer (GECIs) har radikalt ændret hvordan in situ Ca2 + imaging er udført. For at maksimere datagendannelse fra sådanne optagelser, er relevant analyse af Ca2 + signaler påkrævet. Protokoller i dette papir lette kvantificering af Ca2 + -signaler registreres på stedet ved hjælp af spatiotemporelle kortlægning og partikel-baseret analyse.

Anvendelser af Spatio-temporale kortlægning og partikel analyseteknikker til at kvantificere intracellulære Ca2 + signalering In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Evnen til at erhverve store mængder data fra calciumbilleddannelsesforsøg er blevet drastisk forbedret, især med eksperimenter med vævsbilleddannelse. Vores protokoller beskriver passende analyseteknikker til at kvantificere og beskrive disse datasæt. Vores protokoller genererer en række rumlige, tidsmæssige og intensitetsværdier, der er uløseligt forbundet med calciumsignalering i hele væv, og dette kan gå tabt i mere rudimentær-baseret analyse.En time før billeddannelse overføre en tyndtarm høstet fra en mus med interstitielle celler i Cajal eller ICC, der specifikt udtrykker en genetisk kodet calcium indikator til scenen af en roterende disk konfokal mikroskop. Og kontinuerligt gennemgå vævet med 37 grader Celsius Krebs-Ringer bikarbonat eller KRB opløsning. Ved hjælp af en 60 til 100 X forstørrelse finde stellate-formede myenteric plexus ICC eller ICC-MY mellem cirkulære og langsgående glatte muskel lag af tyndtarmen.Find derefter den spindelformede dybe muskelplexus ICC eller ICC-DMP i et enkelt plan mellem det cirkulære glatte muskellag og den submucosale plexus og gem filmene som en stak TIFF-billeder. Hvis du vil oprette spatiotemporale kort eller STMs for ICC-DMP calciumaktiviteten, skal du åbne billedstakken i ImageJ og klikke på Billede, Type og 32-bit for at ændre billedkvaliteten. Hvis du vil oprette en linjescanning, skal du højreklikke på linjemarkeringsværktøjet og vælge segmenteret linje.Hvis du bruger enkelt venstre klik, tegnes en linje langs midtadgangen for en individuel ICC-DMP, skal du dobbeltklikke, når hele cellen er blevet skitseret. Vælg Billede, Stakke og Reslice. Der vises et pop op-vindue.Vælg Roter 90 grader for at orientere linjescanningen fra venstre mod højre, så den kan kalibreres og læses mod tiden på x-aksen med mellemrum på y-aksen, og klik på OK. Det spatiotemporale kort vises. For præcist at måle amplituden af calciumsignalerne fra kortet skal du vælge rektangulær markering og tegne en region af interesse omkring området inden for STM, der viser det mest ensartede og mindst intense område af fluorescens. Klik på Analysér og Histogram for at opnå en middelværdi af intensiteten inden for det valgte interesseområde, og klik på Rediger, Markering og markér alt for at markere hele STM.Klik derefter på Proces, Matematik og Del, og angiv middelværdien af intensiteten med det valgte STM-område af interesse i pop op-boksen. STM bliver sort. Ret dette ved at klikke på Billede, Juster, Lysstyrke/kontrast og Auto i pop op-vinduet.Linjescanningen vil nu blive kalibreret til amplituden med intensiteten af fluorescens udtrykt som fluorescens divideret med nul fluorescens. STM viser antallet af rammer i TIFF-stakken på x-aksen og antallet af pixel, der repræsenterer længden af cellen på y-aksen. Hvis du vil kvantificere de tidsmæssige og geotiske data fra calciumsignalerne, skal du klikke på Billede og Egenskaber og indtaste de relevante værdier for fuldt ud at kalibrere STM'en for tid og rum i pop op-vinduet.For at analysere de enkelte calciumhændelser skal du klikke på Lige linje og klikke og trække på STM'en for at tegne en lige vandret linje gennem midten af en calciumhændelse parallelt med x-aksen. Klik derefter på Analysér og afbild profil. Der vises en boks, der viser plottets profil for calciumhændelsen.Til partikelbaseret analyse af ICC-MY calciumsignaldata skal du åbne filmfilen i Volumetry og højreklikke for at vælge STK Filter, Differentiate. Højreklik igen for at indtaste en værdi for at skelne. Tryk på Enter og venstre-klik for at starte differentieringen.Hvis du vil oprette partikler, skal du bruge den midterste museknap til at rulle gennem filmen for at vælge en 20 til 40-rammesektion, der indeholder en quiescent-periode efterfulgt af forekomsten af en calciumtransientklynge og 20 til 40 billeder, der følger lige efter klyngen. Når alle rammerne er valgt højreklikke i filmvinduet for at få adgang til STK OPS Rampe DS-partikeloplysninger og klikke for at køre en partikelanalyserutine, der gradvist øger tærsklen fra den maksimale til den minimale intensitet. For at sikre en vellykket partikelanalyse skal du sikre dig, at du inkorporerer så meget præc calciumtransient klynge ikke-aktivitet, og så meget post-calcium forbigående klynge ikke-aktivitet, som du kan.Dette vil bidrage til at øge signal-støj-forholdet. Analysen vises grafisk i plotvinduet som støjområde og i sporvinduet som tre farvespor med det grønne spor, der repræsenterer antallet af partikler, det røde spor, der repræsenterer den gennemsnitlige partikelstørrelse, og det blå spor, der repræsenterer den absolutte intensitetstærskel. Tryk på H på tastaturet for at afbalancere plottet af partikelstøj.Tryk derefter på højre beslagstast for at bladre gennem farveskemaer, indtil baggrunden er hvid med farvesporene øverst. Tryk på F på tastaturet én gang for at få et måleværktøj frem. Tryk derefter på F en anden gang for at markere en enkelt lodret linje i rullepanelet i sporvinduet på plottet i krydset, hvor de farvede plots begynder at skifte til højre side.I sporingsvinduet skal du bruge den midterste museknap til at rulle fra bøjningspunktet for den røde sporing til den markerede hvide lodrette linje. Når du har noteret det viste Y-gennemsnit, skal du klikke på den midterste museknap igen i sporingsvinduet for at fravælge den blå sporing. Klik på C i filmvinduet for at få et farvehjul frem og D for at justere tærsklen.Gyldige partikler vil nu blive vist med rødt, og dem, der mætter vil være hvide. Brug venstre museknap til at rulle, indtil de hvide områder er fjernet, og brug den midterste museknap til at justere den gule numeriske værdi i farvehjulet til Y-gennemsnitsværdien for at tildele alt med rødt som en aktiv calciumtransientpartikel ved det fastsatte tærskelpunkt. Hvis du vil gemme dataene som en koordinatbaseret partikelfil, skal du højreklikke for at få adgang til STK 3D, gemme partikelnul og holde venstre for at gemme filen.Hvis du vil oprette partikelaktivitetsvarmekort, skal du åbne den gemte partikelfil og højreklikke i filmvinduet for at få adgang til partikel-STKops, StatMap Flag og indtaste flagopgaver, der skal analyseres. Klik her for at anvende analysen og et varmekort, der viser de samlede partikler for hele optagelsens længde med forskellige farver, der repræsenterer den procentvise forekomst i hele optagelsen. Højreklik for at gemme varmekortet som en TIFF-fil.Højreklik derefter i filmvinduet for at få adgang til partikelmål, partikelstatistik STK er lig med, og angiv en flagtildeling for analysen. Der genereres en række spor i sporingsvinduet. STM analyse giver mulighed for at overvåge og registrere de rumlige egenskaber af calcium signalering, såsom den rumlige spredning og formering hastighed.Disse oplysninger kan indsamles for at give en temmelig komplet visning af calcium signalering adfærd i celler i deres oprindelige miljøer. Ved hjælp af partikelanalyse kan kvantitative oplysninger om calciumsignalering beregnes ved at måle partikelområdet og partikeltallet, som tilsammen kan bruges til at bestemme de rumlige områder af calciumsignalaktivering inden for et bestemt synsfelt. Partikelanalyse giver også mulighed for dybdegående kvantificering af subcellulær calcium signalering gennem undersøgelse af placeringen og fyring sandsynligheder for calcium fyring steder.Ved at tildele partiklerne i forskellige flag baseret på deres tidsmæssige egenskaber kan de initierende partikler kortlægges præcist. Og et væld af hårde data erhvervet på antallet af indledning steder, størrelsen af stedet i pixels og mikrometer, sandsynligheden for hver indledning site fyring enten en eller flere gange i løbet af hver calcium forbigående klynge, og den procentdel af fyring steder, brand under hver calcium forbigående klynge cyklus kan opnås. Konsekvens er nøglen til succes i denne protokol.Alle datasæt og alle film skal behandles nøjagtigt ens for at sikre pålidelige, repeterbare resultater. Dette gælder især, når der beskæftiger sig med partikelfiler. Vores protokoller tillader en dyb karakterisering af calcium signalering in situ, og en række statistiske metoder, når de anvendes korrekt, kan vurdere forskelle mellem en række rumlige og tidsmæssige parametre.Disse analyseteknikker i vores protokol har gjort det muligt for forskere at stille og besvare tidligere uadresserbare spørgsmål vedrørende intestinal pacemaking, og intestinal innervation, samt neuronal kontrol af de nedre urinveje.

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualisering af Vascular Ca 2 + Signaling Triggered ved Paracrine Afledte ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput fysisk kortlægning af kromosomer under anvendelse Automatiseret<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hurtig genetisk analyse af Epithelial-mesenkyme Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Måling Intracellular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Ændringer i human Sperm med fire teknikker: Konventionel fluorometri, Stoppet Flow fluorometri, Flowcytometri og Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse af mRNA molekyler under anvendelse Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automatiseret analyse af dynamiske Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaler i billedsekvenser

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

To-foton Imaging af intracellulære Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Håndtering og nitrogenoxid Produktion i Endothelial og glatte muskelceller af en isoleret rotteaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optisk Kortlægning af Intra-reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Og transmembrane potentiale i Langendorff-perfunderet kanin Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open source Single-partikel Analyse for Super-resolution Microscopy med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...