Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Financiering werd verstrekt door de NIDDK, via P01 DK41315.

Alle dieren die worden gebruikt en de protocollen die in deze studie uitgevoerd in overeenstemming waren met de nationale instituten van gezondheid gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle procedures werden goedgekeurd door het institutionele dier gebruik en Care Comité bij de University of Nevada in Reno.
1. generatie van KitGCaMP6f muizen
<ol><li>Cross Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f muizen) en c-Kit+/ Cre-ERT2 (Kit-Cre muizen) voor het genereren van ICC speci...

CA2 + beeldvorming van specifieke soorten cellen binnen intact weefsels of netwerken van cellen vaak onthult complexe patronen van Ca2 + transiënten. Deze activiteit vereist zorgvuldige en grondige analyses en kwantificering te vangen zo veel mogelijk informatie over de onderliggende gebeurtenissen en kinetiek van deze gebeurtenissen. STM en PTCL analyse worden aangegrepen om de hoeveelheid kwantitatieve gegevens opgeleverd van opnames van dit type te maximaliseren.
De s...

CA2 + is een alomtegenwoordige intracellulaire boodschapper die een breed scala van cellulaire processen, zoals spier contractie1,2, metabolisme3, cel proliferatie3,4, onder controle 5, stimulatie van de neurotransmitter release op6,7van de terminals van de zenuw en activering van transcriptie factoren in de kern. 7 intracellulaire Ca2 + signalen vaak de vorm aannemen van voorbijgaande waterstand in cytosolische Ca2 +, en deze kunnen worden spontane of voortvloeien uit agonist stimulatie afhankelijk van de cel type8. Ruimtelijke, temporele en intensiteitswaarden intrinsieke tot Ca2 + signalen zoals frequentie, duur, vermeerdering, snelheid en amplitude kunnen de biologische informatie die nodig is voor de intracellulaire signalen5, 7 , 9. cytoplasmatische Ca2 + signalen kunnen ontstaan door de toestroom van Ca2 + vanuit de extracellulaire ruimte of via Ca2 + vrijlating uit het endoplasmatisch reticulum (ER) via Ca2 + release kanalen zoals ryanodine receptoren (RyRs) en inositol-tri-fosfaat receptoren (IP-3Rs)10. RyRs en IP-3Rs kunnen zowel bijdragen tot de generatie van Ca2 + signalen en de gezamenlijke opening van deze kanalen, die gecombineerd met verschillende Ca2 + toestroom mechanismen kan leiden tot een myriade van Ca2 + signalering van patronen die worden gevormd door de nummers en open kans van Ca2 + toestroom kanalen, het profiel van de expressie van Ca2 + release kanalen, de afstand tussen de Ca2 + toestroom en release kanalen, en expressie en distributie van Ca2 + reuptake en extrusie eiwitten. CA2 + signalen kunnen de vorm aannemen van uniforme, langdurige, hoge intensiteit global oscillaties dat voor verscheidene seconden of zelfs minuten duren kan, teeltmateriaal van intracellulaire en intercellulaire Ca2 + golven die intracellulaire afstanden mogen overschrijden meer dan 100 µm10,11,12,13,14,15,16of meer korte, ruimtelijk gelokaliseerde evenementen zoals Ca2 + sparks en Ca2 + soesjes die optreden op tientallen milliseconden tijdschalen en minder dan 5 µm17,18,19,20te verspreiden.
Fluorescent microscopie is wijd gebruikt om te controleren Ca2 + signalering in geïsoleerde en gekweekte cellen en weefsels intact. Traditioneel, deze experimenten betrokken het gebruik van fluorescerend Ca2 + indicatoren, ratiometric en niet-ratiometric kleurstoffen zoals Fura2, Fluo3/4 of Rhod2, o.a. 21,22,23. Deze indicatoren werden ontworpen om te worden luchtdoorlatend celmembranen en vervolgens worden gevangen in cellen door het splijten van een ester-groep via endogene esterasen. Binding van Ca2 + de hoge affiniteit indicatoren veroorzaakt veranderingen in fluorescentie wanneer de cellen en weefsels werden verlicht door passende golflengten van licht. Het gebruik van cel permeabele Ca2 + indicatoren verbeterd sterk ons begrip van Ca2 + signalering in levende cellen en toegestaan ruimtelijke resolutie en kwantificering van deze signalen, dat door het analyseren van Ca2 + signalen niet mogelijk was via andere middelen, zoals electrofysiologie. Traditionele Ca2 + indicatoren hebben echter verschillende beperkingen, zoals photobleaching dat over uitgebreide opname perioden24 optreedt. Terwijl de nieuwere Ca2 + indicator kleurstoffen zoals Cal520/590 hebben sterk verbeterde signaal ruisverhoudingen en de mogelijkheid om het detecteren van lokale Ca2 + signalen25, kunnen problemen met photobleaching blijven een zorg voor sommige onderzoekers 262827,,. Steile photobleaching wordt ook beperkt, de vergroting, aantal Beeldacquisitie, en resolutie die kan worden gebruikt voor opnamen, zoals meer objectieve macht en hogere tarieven van Beeldacquisitie vereisen verhoogd excitatie lichtintensiteit die verhoogt photobleaching.
Deze beperkingen van traditionele Ca2 + indicator kleurstoffen worden verergerd bij het opnemen van Ca2 + signalen ter plaatse, bijvoorbeeld wanneer opname intracellulaire Ca2 + signalen van intact weefsels. Als gevolg van de bovengenoemde problemen, visualisatie van Ca2 + signalen in situ cel permeabele Ca2 + indicatoren is beperkt tot laag vermogen vergroting en verlaagde tarieven van Fotolader, beperken het vermogen van onderzoekers te registreren en stoffelijk of ruimtelijk beperkte subcellular Ca2 + signalen te kwantificeren. Dus, het is al moeilijk te vangen, te analyseren en begrijpen van de complexiteit van het ruimtelijke en temporele van Ca2 + signalen, die van belang zijn in de generatie van gewenste biologische reacties, kunnen zoals hierboven beschreven. Analyse van Ca2 + signalen uit cellen in situ is meestal afhankelijk van eenvoudige intensiteit metingen uit geselecteerde gebieden van belang (ROI) binnen een beeldveld (FOV). De willekeurige keuze van het aantal, de grootte en de positie van ROIs, afhankelijk van de willekeur van de onderzoeker, kan ernstig vertekening van de verkregen resultaten. Evenals de inherente vooringenomenheid met ROI analyse, negeert deze aanpak veel van de belangrijke informatie zoals vervat in de FOV, als dynamische Ca2 + gebeurtenissen binnen een willekeurig gekozen signalering ROI zijn geselecteerd voor analyse. Bovendien, analyse van ROIs mislukt informatie te verstrekken over de ruimtelijke kenmerken van de Ca2 + signalen waargenomen. Bijvoorbeeld, het niet mogelijk onderscheid maken tussen een stijging van Ca2 + die voortvloeien uit een teeltmateriaal Ca2 + Golf en een uiterst gelokaliseerde Ca2 + release evenement van bijhouding van Ca2 + signalen binnen een ROI.
De komst van genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren (GECIs) is radicaal veranderd hoe Ca2 + beeldvorming kan worden uitgevoerd in situ29,30,31,32,33 . Er zijn verschillende voordelen aan het gebruik van GECIs over kleurstoffen. Het belangrijkste is misschien dat de expressie van GECI kan worden uitgevoerd op een specifieke wijze van cel, waardoor ongewenste achtergrondverontreiniging uit cellen niet van belang. Een ander voordeel van GECIs ten opzichte van traditionele Ca2 + indicatoren is dat photobleaching wordt verminderd (zoals fluorescentie en éénduidige photobleaching treedt alleen op wanneer cellen actief zijn), in vergelijking met kleurstof-geladen monsters, met name bij hoge vergroting en hoge beeld vastleggen34. Dus, imaging met GECIs, zoals de GCaMP-serie van optogenetic sensoren, biedt onderzoekers de mogelijkheid om opnemen kort, gelokaliseerde sub cellulaire Ca2 + signalen in situ en onderzoeken Ca2 + signalering in cellen binnen hun native omgevingen die eerder niet mogelijk zijn geweest. Herstel van gegevens uit dergelijke hoge resolutie opnamen te maximaliseren, is de juiste ruimtelijke en temporele analyse van de Ca2 + signalen vereist. Opgemerkt moet worden dat terwijl GECIs duidelijke voordelen bieden kan, recente studies is gebleken dat Ca2 + imaging met succes kan worden uitgevoerd vanaf de grote populaties van verschillende soorten neurochemical neuronen gelijktijdig gebruik van conventionele CA2 + indicatoren die niet genetisch zijn gecodeerd in de dierlijke35. Deze aanpak gebruikt post hoc immunohistochemistry te onthullen meerdere verschillende klassen van neuronen afvuren op hoge frequentie in gesynchroniseerde uitbarstingen, en het potentieel dat genetische modificaties aan het dier kunnen hebben bemoeid met de fysiologische vermeden gedrag de onderzoeker wil begrijpen35,,36.
De protocollen die worden beschreven in dit document vergemakkelijken meer volledige analyse en kwantificering van Ca2 + signalen opgenomen uit cellen in situ met behulp van een combinatie van Spatio kaart (STM)-op basis van de analyse en deeltje gebaseerde analyse. De protocollen ook beschrijven hoe verschillende patronen van Ca2 + signalering waargenomen in andere cel populaties in situ op de juiste wijze kunnen worden geanalyseerd. Ter illustratie wordt zal de methode onderzoeken Ca2 + signalering in een gespecialiseerde bevolking van cellen in de dunne darm, interstitiële cellen van Cajal (ICC). ICC zijn gespecialiseerde cellen in het maagdarmkanaal (GI) die vertonen dynamische intracellulaire Ca2 + signalering, als gevisualiseerd met behulp van muizen GCaMPs37,38,39,40, uiten 41,42. CA2 + transiënten in ICC zijn gekoppeld aan de activering van Ca2 +-geactiveerd Cl- (gecodeerd door Ano1) kanalen die belangrijk zijn bij het reguleren van de prikkelbaarheid van de intestinale vlotte spier cellen (SMCs)43, 44,,45. De studie van Ca2 + signalering in ICC is dus fundamenteel voor het begrip van de intestinale motiliteit. De lymfkliertest dunne darm biedt een uitstekend voorbeeld voor deze demonstratie vormt en er zijn twee klassen van Internationaal Strafhof dat zijn anatomisch gescheiden en onafhankelijk van elkaar kunnen worden gevisualiseerd: ik) ICC bevinden zich in het gebied tussen de verdienstelijke en cirkelvormige longitudinale gladde spieren lagen, rond de myenteric plexus (ICC-MY). Deze cellen dienen als pacemaker cellen en het genereren van de elektrische activiteit bekend als langzame golven46,47,48,49; II) ICC liggen ook onder een rijke in de terminals van motorische neuronen (diep gespierde plexus, aldus ICC-DMP) plexus. Deze cellen dienen als bemiddelaars van reacties op zuurbestendige motor transmissie37,39,40,50. ICC-MY ICC-DMP zijn morfologisch verschillend en hun Ca2 + signalering gedrag radicaal verschillen om hun specifieke taken. ICC-MY Notti in vorm en vormen een netwerk van onderling verbonden cellen via gap kruispunten51,52. CA2 + signalen in ICC-MY manifest als korte en ruimtelijk gelokaliseerde Ca2 + release gebeurtenissen die zich voordoen op meerdere locaties asynchroon via het ICC-mijn netwerk als gevisualiseerde binnen een FOV (beeld met een 60 X doelstelling)38. Deze asynchrone signalen worden geordend stoffelijk 1 seconde clusters die, wanneer samen tabelvorm, oplopen tot een netto 1 s cellulaire stijging van Ca2 +. Deze signalen doorgeven aan-cel binnen het ICC-netwerk en daarom organiseren Ca2 + signalering, gegenereerd op basis van sub cellulaire sites, in een weefsel breed Ca2 + Golf. Temporele clustering en sommatie van Ca2 + signalen in ICC-MY genoemd Ca2 + voorbijgaande clusters (CTCs)38. CTCs optreden ritmisch (bijvoorbeeld vrij gelijkaardig duur en soortgelijke periodes tussen CTCs) 30 perioden per minuut in de muis. Omgekeerd, ICC-DMP zijn spindel vormige cellen, sommige met secundaire processen, die verdelen tussen SMCs en spataderen zenuw processen en niet zelfstandig vormen een netwerk51,52. ICC-DMP formulier kloof aansluitingen met SMCs, echter, en de functie binnen dit grotere syncytium, bekend als de SIP syncytium53. CA2 + signalen die zich voordoen op meerdere locaties langs de lengte van de cellen, maar deze transiënten niet entrained of stoffelijk geclusterd, zoals waargenomen in ICC-MY37. CA2 + signalen in ICC-DMP optreden op stochastische wijze, met variabele intensiteit, duur en ruimtelijke kenmerken. De protocollen hieronder, met behulp van het voorbeeld van Ca2 + signalering in ICC-MY en ICC-DMP, technieken voor het analyseren van complexe signalering in specifieke soorten cellen in situ te beschrijven. We gebruikt het afleidbare Cre-Lox p systeem express GCaMP6f uitsluitend in ICC, na inducerende activering van Cre-Recombinase (Cre) gedreven door een specifieke promotor van ICC (Kit).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

CA2 + beeldvorming van geïsoleerde cellen of specifieke soorten cellen binnen intact weefsels vaak onthult complexe patronen van Ca2 + signalering. Deze activiteit vereist zorgvuldige en grondige analyses en kwantificering te vangen zo veel mogelijk informatie over de onderliggende gebeurtenissen. Ruimtelijke, temporele en intensiteitswaarden intrinsieke tot Ca2 + signalen zoals frequentie, de duur, de voortplanting, de snelheid en de amplitude kunnen bieden sommige biologische informatie die nodig is voor de intracellulaire signalering. Hoge resolutie Ca2 + imaging meestal resultaten in de overname van grote gegevensbestanden die zijn tijdrovend proces in termen van het vertalen van de beeldvorming informatie in meetbare gegevens, en dit proces kan worden vatbaar voor menselijke fouten en bias. Analyse van Ca2 + signalen uit cellen in situ is meestal afhankelijk van eenvoudige intensiteit metingen van willekeurig geselecteerde regio's van belang (ROI) binnen een beeldveld (FOV). Deze aanpak wordt veel van de belangrijke signalering informatie in de FOV genegeerd. Dus, om te maximaliseren van de terugwinning van gegevens van dergelijke hoge resolutie opnamen verkregen met Ca2 +kleurstoffen of optogenetic Ca2 + imaging, passende ruimtelijke en temporele analyse van de Ca2 + signalen is vereist. De protocollen die worden beschreven in dit artikel zal beschrijven hoe een hoog volume van gegevens kan worden verkregen uit Ca2 + imaging opnamen om meer volledige analyse en kwantificering van Ca2 + signalen opgenomen van cellen met behulp van een combinatie van Spatio kaart (STM)-op basis van de analyse en deeltje gebaseerde analyse. De protocollen ook beschrijven hoe verschillende patronen van Ca2 + signalering waargenomen in andere cel populaties in situ op de juiste wijze kunnen worden geanalyseerd. Ter illustratie wordt zal de methode onderzoeken Ca2 + signalering in een gespecialiseerde bevolking van cellen in de dunne darm, interstitiële cellen van Cajal (ICC), met behulp van GECIs.

Met behulp van Kit-Cre-GCaMP6F muizen (Figuur 1), dynamische Ca2 + signalering gedrag van ICC in het maag-darmkanaal kunnen ter plaatse worden beeld. Met confocale microscopie, kunnen resolutieafbeeldingen van specifieke populaties van ICC worden verworven zonder besmetten signalen van andere populaties van ICC binnen de dezelfde weefsel maar in anatomisch verschillende vliegtuigen van focus (figuur 2A)<sup class="xref...

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren (GECIs) hebben radicaal veranderd hoe in situ Ca2 + imaging wordt uitgevoerd. Maximaliseren van de terugwinning van de gegevens uit deze opnamen, is juiste analyse van Ca2 + signalen vereist. De protocollen in deze paper vergemakkelijken de kwantificering van Ca2 + signalen opgenomen in situ met behulp van Spatio mapping en deeltje gebaseerde analyse.

Toepassingen van de Spatio-temporele Mapping en analysetechnieken deeltje te kwantificeren intracellulaire Ca2 + signalering In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

De capaciteit om grote hoeveelheden gegevens te verkrijgen uit experimenten met calciumbeeldvorming is drastisch verbeterd, vooral met weefselbeeldvormingsexperimenten. Onze protocollen beschrijven de juiste analysetechnieken om deze gegevenssets te kwantificeren en te beschrijven. Onze protocollen genereren een reeks ruimtelijke, temporele en intensiteitswaarden die inherent zijn aan calciumsignalering in hele weefsels en dit kan verloren gaan in meer rudimentaire analyse.Een uur voor de beeldvorming overdracht van een dunne darm geoogst van een muis met interstitiële cellen van Cajal of ICC die specifiek uitdrukken een genetisch gecodeerde calcium indicator naar het stadium van een draaiende schijf confocale microscoop. En continu doorsnijd het weefsel met 37 graden Celsius Krebs-Ringer bicarbonaat of KRB oplossing. Met behulp van een 60 tot 100 X vergroting lokaliseren van de stellate-vormige myenteric plexus ICC of ICC-MY tussen de cirkelvormige en longitudinale gladde spierlagen van de dunne darm.Zoek vervolgens de spindelvormige diepe gespierde plexus ICC of ICC-DMP in één vlak tussen de cirkelvormige gladde spierlaag en de submucosale plexus en sla de films op als een stapel TIFF-beelden. Als u spatiotemporale kaarten of SMS van de calciumactiviteit ICC-DMP wilt maken, opent u de afbeeldingsstack in ImageJ en klikt u op Afbeelding, Type en 32-bits om de beeldkwaliteit te wijzigen. Als u een regelscan wilt maken, klikt u met de rechtermuisknop op het gereedschap Regelselectie en selecteert u gesegmenteerde lijn.Met één klikken links een lijn tekenen langs de middelste toegang van een individuele ICC-DMP, dubbelklikken wanneer de hele cel is geschetst. Selecteer Afbeelding, Stapels en Reslice. Er verschijnt een pop-upvenster.Selecteer 90 graden draaien om de lijnscan van links naar rechts te oriënteren, zodat deze kan worden gekalibreerd en afgelezen tegen de tijd op de x-as met ruimte op de y-as en op OK. De spatiotemporale kaart zal verschijnen. Om de amplitude van de calciumsignalen van de kaart nauwkeurig te meten, selecteert u rechthoekige selectie en tekent u een gebied van belang rond het gebied binnen de STM dat het meest uniforme en minst intense gebied van fluorescentie weergeeft. Klik op Analyseren en Histogram om een gemiddelde waarde van de intensiteit binnen het geselecteerde interessegebied te verkrijgen en klik op Bewerken, Selecteren, Alles selecteren om de hele STM te selecteren.Klik vervolgens op Proces, Wiskunde en Verdeel en voer de gemiddelde waarde van de intensiteit in met het geselecteerde STM-gebied dat van belang is in het pop-upvak. De STM wordt zwart. Corrigeer dit door in het pop-upvenster op Afbeelding, Aanpassen, Helderheid/Contrast en Automatisch te klikken.De lijnscan wordt nu gekalibreerd voor de amplitude met de intensiteit van de fluorescentie uitgedrukt als de fluorescentie gedeeld door de nulfluorescentie. De STM geeft het aantal frames in de TIFF-stapel op de x-as weer en het aantal pixels dat de lengte van de cel op de y-as weergeeft. Als u de temporele en ruimtelijke gegevens van de calciumsignalen wilt kwantificeren, klikt u op Afbeelding en Eigenschappen en voert u de juiste waarden in om de STM volledig te kalibreren voor ruimte en tijd in het pop-upvenster.Als u de afzonderlijke calciumgebeurtenissen wilt analyseren, klikt u op Rechte lijn en klikt u op de STM om een rechte horizontale lijn door het midden van een calciumgebeurtenis parallel aan de x-as te tekenen. Klik vervolgens op Profiel analyseren en plotten. Er verschijnt een vak met het plotprofiel van de calciumgebeurtenis.Open het filmbestand in Volumetry en klik met de rechtermuisknop om STK-filter Differentiate te selecteren voor deeltjesanalyse van de ICC-MY calciumsignaleringsgegevens. Klik nogmaals met de rechtermuisknop om een waarde in te voeren om te differentiëren. Druk op Enter en klik links om de differentiatie te starten.Als u deeltjes wilt maken, gebruikt u de middelste muisknop om door de film te bladeren om een framesectie van 20 tot 40 te selecteren die een rustige periode bevat, gevolgd door het optreden van een calciumtransient cluster en 20 tot 40 frames die direct na het cluster volgen. Wanneer alle frames met de rechtermuisknop zijn geselecteerd, klikt u in het filmvenster om toegang te krijgen tot STK OPS Ramp DS-deeltjesinformatie en klikt u om een deeltjesanalyseroutine uit te voeren die de drempel geleidelijk van het maximum naar de minimale intensiteit verhoogt. Om een succesvolle deeltjesanalyse te garanderen, moet u ervoor zorgen dat u zoveel mogelijk precaliumtransient cluster niet-activiteit opneemt, en zoveel postcalciumtransient cluster non-activiteit als je.Dit zal helpen om de signaal-ruisverhouding te stimuleren. De analyse wordt grafisch weergegeven in het plotvenster als plot van ruis en in het sporenvenster als drie kleursporen met het groene spoor dat het aantal deeltjes vertegenwoordigt, het rode spoor dat de gemiddelde deeltjesgrootte vertegenwoordigt, en het blauwe spoor dat de absolute intensiteitsdrempel vertegenwoordigt. Om histogram balans van de plot van deeltjeslawaai druk H op het toetsenbord.Druk vervolgens op de rechter beugeltoets om door kleurenschema's te fietsen totdat de achtergrond wit is met de kleursporen erop. Druk één keer op F op het toetsenbord om een meetinstrument naar boven te brengen. Druk vervolgens op F een tweede keer om een enkele verticale lijn te markeren in de schuifbalk van het sporenvenster op het perceel op het kruispunt waar de gekleurde percelen beginnen te verschuiven naar de rechterkant.In het venster Traces gebruikt u de middelste muisknop om van het buigpunt van het rode spoor naar de gemarkeerde witte verticale lijn te scrollen. Nadat u het weergegeven Y-gemiddelde hebt opgetensinterding, klikt u opnieuw op de middelste muisknop in het traceervenster om de selectie van het blauwe spoor uit te voeren. Klik in het filmvenster op C om een kleurenwiel naar boven te brengen en D om de drempelwaarde aan te passen.Geldige deeltjes worden nu in het rood weergegeven en de deeltjes die verzadigen zullen wit zijn. Gebruik de linker muisknop om te scrollen totdat de witte gebieden zijn verwijderd en gebruik de middelste muisknop om de gele numerieke waarde in het kleurenwiel aan te passen aan de gemiddelde waarde Y om alles in het rood toe te wijzen als een actief calciumsaleusdeeltje op het vastgestelde drempelpunt. Als u de gegevens wilt opslaan als een op coördinaat gebaseerd deeltjesbestand, klikt u met de rechtermuisknop om toegang te krijgen tot STK 3D, slaat u deeltje nul en klikt u met de linkerklik om het bestand op te slaan.Als u warmtekaarten voor deeltjesactiviteit wilt maken, opent u het opgeslagen deeltjesbestand en klikt u met de rechtermuisknop in het filmvenster om toegang te krijgen tot deeltjes-STKops, StatMap Flag en voert u vlagtoewijzingen in om te analyseren. Klik om de analyse en een warmtekaart met de totale lengte van de opname toe te passen met verschillende kleuren die het percentage optreden tijdens de opname vertegenwoordigen. Klik met de rechtermuisknop om de heatmap op te slaan als een TIFF-bestand.Klik vervolgens met de rechtermuisknop in het filmvenster om toegang te krijgen tot deeltjesmeting, deeltjesstatistieken STK is gelijk aan en voer een vlagtoewijzing in voor de analyse. Een reeks sporen zal worden gegenereerd in het spoor venster. STM-analyse biedt de mogelijkheid om de ruimtelijke kenmerken van calciumsignalering te monitoren en vast te leggen, zoals de ruimtelijke spreidings- en voortplantingssnelheid.Deze informatie kan worden vergaard om een vrij volledig beeld van calcium signalering gedrag binnen cellen in hun eigen omgeving. Met behulp van deeltjesanalyse kan kwantitatieve informatie over calciumsignalering worden berekend door het deeltjesgebied en het aantal deeltjes te meten, die samen kunnen worden gebruikt om de ruimtelijke bereiken van calciumsignaalactivering binnen een bepaald gezichtsveld te bepalen. Deeltjesanalyse maakt het ook mogelijk de diepgaande kwantificering van subcellulaire calcium signalering door middel van onderzoek van de locatie en het afvuren van calcium vuurplaatsen.Door de deeltjes in verschillende vlaggen toe te wijzen op basis van hun temporele eigenschappen, kunnen de initiërende deeltjes nauwkeurig in kaart worden gebracht. En een schat aan harde gegevens verkregen over het aantal initiatie sites, de grootte van de site in pixels en micrometers, waarschijnlijkheid van elke initiatie site afvuren een of meerdere keren tijdens elke calcium voorbijgaande cluster, en het percentage van het afvuren sites die brand tijdens elke calcium voorbijgaande cluster cyclus kan worden verkregen. Consistentie is de sleutel tot succes in dit protocol.Alle gegevenssets en alle films moeten precies hetzelfde worden behandeld om betrouwbare, herhaalbare resultaten te garanderen. Dit geldt vooral bij het omgaan met deeltjesbestanden. Onze protocollen maken een diepe karakterisering van calciumsignalering in situ mogelijk, en een reeks statistische methoden, wanneer ze op de juiste manier worden gebruikt, kunnen verschillen tussen een reeks ruimtelijke en temporele parameters beoordelen.Deze analysetechnieken in ons protocol hebben onderzoekers in staat gesteld om eerder niet-adresseerbare vragen te stellen en te beantwoorden met betrekking tot darmtempomaking, en darmenbinnenvatie, evenals de neuronale controle van de onderste urinewegen.

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Technieken voor Imaging Ca 2 + Signalering in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualisatie van vasculaire Ca 2 + Signalering Geactiveerd door Paracriene Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snelle Genetische analyse van epitheliale-mesenchymale signalering tijdens haar regeneratie

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Meten Intracellulaire Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Geautomatiseerde analyse van Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalen in reeksen afbeeldingen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...