Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Financé par le NIDDK, via DK41315 P01.

Tous les animaux utilisés et les protocoles réalisées dans cette étude étaient conformes au Guide National des instituts de santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures ont été approuvées par l’Institutional Animal Use et le Comité de protection de l’Université du Nevada, Reno.
1. génération de souris KitGCaMP6f
<ol><li>Croix de Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f, souris) et c-Kit+ / Cre ERT2 (Kit-Cre souris) pour générer d...

Ca2 + imagerie des types spécifiques de cellules dans les tissus intacts ou au sein des réseaux de cellules souvent révèle des motifs complexes de transitoires de Ca2 + . Cette activité nécessite une analyse attentive et approfondie et quantification de capturer plus d’informations sur les événements sous-jacents et la cinétique de ces événements que possible. STM et analyse PTCL fournissent une occasion de maximiser la quantité de données quantitatives dans les enregistrements de ce ...

Ca2 + est un messager intracellulaire ubiquitaire qui contrôle une large gamme de processus cellulaires, comme le muscle contraction1,2,3de métabolisme, cellule prolifération3,4, 5, stimulation de la libération des neurotransmetteurs au nerf bornes6,7et l’activation de la transcription factors dans le noyau. 7 Ca intracellulaire2 + signale souvent prendre la forme d’élévations transitoires cytosolique Ca2 +, et ceux-ci peuvent être spontanées ou résultent d’une stimulation agoniste selon le type de cellule8. Spatial, temporel et paramètres d’intensité intrinsèques de Ca2 + signaux tels que la fréquence, la durée, propagation, vitesse et amplitude peuvent fournir les informations biologiques nécessaires à la signalisation intracellulaire5, 7 , 9. cytoplasmique Ca2 + signaux peuvent résulter de l’influx de Ca2 + de l’espace extracellulaire ou par libération de Ca2 + du réticulum endoplasmique (re) par l’intermédiaire de canaux de Ca2 + libération tels que les récepteurs de la ryanodine (RyRs) et des récepteurs de l’inositol-triphosphate (IP3Rs)10. RyRs et IP3Rs peuvent tous deux contribuent à la génération de signaux de Ca2 + et l’ouverture concertée de ces canaux, ce qui combiné à divers mécanismes de Ca2 + afflux peut entraîner une myriade de Ca2 + modèles de signalisation qui sont façonnés par les nombres et ouvrir la probabilité des canaux Ca2 + afflux, le profil d’expression des canaux Ca2 + libération, la proximité entre l’influx de Ca2 + et des canaux de libération et expression, répartition du Ca2 + protéines recaptage et extrusion. Ca2 + signaux peuvent prendre la forme d’uniforme, longue durée, oscillations global de haute intensité qui peut durer pendant plusieurs secondes ou minutes même, multiplication intracellulaires et intercellulaires Ca2 + vagues pouvant traverser des distances intracellulaires plus de 100 µm10,11,12,13,14,15,16, ou des événements plus brèves, localisées dans l’espace comme Ca2 + sparks et Ca2 + bouffées qui se produisent sur des dizaines de milliseconde échelles de temps et la propagation de moins de 5 µm17,18,19,20.
Microscopie de fluorescence a été utilisée largement pour surveiller Ca2 + signalisation dans les cellules isolées et cultivées et dans les tissus intacts. Traditionnellement, ces expériences comportait l’utilisation de fluorescent Ca2 + indicateurs, ratiométrique et non-ratiométrique colorants tels que Fura2, Fluo3/4 ou Rhod2, entre autres, 21,22,23. Ces indicateurs ont été conçus pour être perméable aux membranes cellulaires et puis piégé dans les cellules par le clivage d’un groupe ester par des estérases endogènes. Fixation du Ca2 + pour les indicateurs de haute affinité cause des changements dans la fluorescence lorsque les cellules et les tissus ont été éclairés par des longueurs d’onde de lumière. L’utilisation de cellules perméables Ca2 + indicateurs grandement amélioré notre compréhension de Ca2 + signalisation dans les cellules vivantes et permis la résolution spatiale et la quantification de ces signaux qui n’a pas été possible en testant des signaux de Ca2 + par d’autres moyens, tels que de l’électrophysiologie. Cependant, Ca2 + indicateurs traditionnels présentent plusieurs limites, telles que le Photoblanchiment qui se produit au cours de l’enregistrement de longues périodes24. Tandis que l’indicateur2 + Ca nouveaux colorants tels que Cal520/590 ont grandement amélioré signal aux rapports de bruit et de la capacité à détecter des locaux Ca2 + signaux25, problèmes avec le Photoblanchiment peuvent rester encore un sujet de préoccupation pour certains chercheurs 2627,de,28. Photoblanchiment précipité limite également le grossissement, le taux d’acquisition d’image, et résolution qui peut être utilisée pour des enregistrements, comme le besoin d’augmenter la puissance objective et des taux plus élevés d’acquisition d’images a augmenté l’intensité lumineuse excitation qui augmente le Photoblanchiment.
Ces limitations de traditionnel Ca2 + indicateur colorants sont exacerbées lors de l’enregistrement des signaux2 + Ca in situ, par exemple lorsque enregistrement intracellulaire Ca2 + des signaux de tissus intacts. En raison des problèmes ci-dessus, visualisation de signaux2 + Ca in situ à l’aide de cellules perméables Ca2 + indicateurs a été limitée à un grossissement de faible puissance et réduit les taux de capture d’image, limitant la capacité des enquêteurs pour enregistrer et quantifier les signaux2 + Ca subcellulaires restreintes dans le temps ou dans l’espace. Ainsi, il a été difficile à capturer, analyser et apprécier la complexité spatiale et temporelle des signaux Ca2 + , ce qui peut être important dans la génération de réponses biologiques souhaités, comme indiqué ci-dessus. Analyse des signaux de Ca2 + des cellules in situs s’appuie généralement sur les mesures d’intensité simple de certaines régions d’intérêt (ROI) dans un champ de vision (FOV). Le choix arbitraire du nombre, taille et position des ROIs, dépendants de la fantaisie du chercheur, peut sérieusement biaiser les résultats obtenus. Ainsi que de la distorsion inhérente à l’analyse du retour sur investissement, cette approche ignore une grande partie des importantes informations contenues dans le champ de vision, comme Ca2 + événements dynamiques dans un arbitrairement choisi de signalisation ROI sont sélectionnés pour l’analyse. En outre, analyse des ROIs ne parvient pas à fournir des informations sur les caractéristiques spatiales des Ca2 + signaux observés. Par exemple, il ne serait pas possible d’établir une distinction entre une augmentation de Ca2 + résultant d’une multiplication Ca2 + wave et un très localisée Ca2 + sortie événement de totalisations des signaux de Ca2 + au sein d’un retour sur investissement.
L’avènement de codé génétiquement Ca2 + indicateurs (GECIs) a radicalement changé comment Ca2 + imagerie peut être effectué sur place29,30,31,32,33 . Il y a plusieurs avantages à utiliser GECIs sur teintures. Le plus important peut-être est que l’expression de GECI peut être effectuée d’une manière spécifique de cellule, ce qui réduit la contamination de fond indésirables des cellules pas d’intérêt. Un autre avantage de GECIs Ca2 + indicateurs traditionnels est que Photoblanchiment est réduit (comme la fluorescence et par conséquent le Photoblanchiment se produit uniquement quand les cellules sont actifs), par rapport aux échantillons chargés en colorant, particulièrement à haute grossissement et des taux élevés d’image capturent34. Ainsi, imagerie avec GECIs, tels que la série de GCaMP d’optogenetic capteurs, offre chercheurs la possibilité d’enregistrer brève, localisée subcellulaires Ca2 + signaux in situ et étudier Ca2 + signalisation dans les cellules au sein de leur environnements natifs qui n’ont pas été possibles auparavant. Pour maximiser la récupération d’informations provenant de ces enregistrements de haute résolution, analyse spatiale et temporelle appropriée des Ca2 + signaux est nécessaire. Il convient de noter que tandis que GECIs peut offrir que certains avantages évidents, des études récentes ont révélé que Ca2 + imagerie peut être effectuée avec succès de grandes populations de différentes classes neurochimiques des neurones simultanément à l’aide de classiques Ca2 + indicateurs qui ne sont pas codés génétiquement dans l' animal35. Cette approche immunohistochimie post-hoc permettant de révéler plusieurs différentes classes de neurones tir à haute fréquence en rafales synchronisés et évite la possibilité que des modifications génétiques de l’animal peuvent avoir nui à la physiologique comportement de l’enquêteur cherche à comprendre les35,36.
Les protocoles décrits dans le présent document facilitent l’analyse plus complète et quantification de Ca2 + des signaux enregistrés à partir de cellules in situs en utilisant une combinaison de carte spatio-temporelle (STM)-fonction analyse et analyse axée sur les particules. Les protocoles décrivent également comment les différents modèles de Ca2 + signalisation observés dans différentes cellules in situ des populations peuvent être analysées de façon appropriée. À titre d’exemple, la méthode examinera Ca2 + signalisation dans une population spécialisée des cellules dans l’intestin, cellules interstitielles de Cajal (CIC). ICC sont des cellules spécialisées dans le système gastro-intestinal (GI) qui présentent dynamique intracellulaire Ca2 + signalisation, tel qu’il est visualisé à l’aide de souris exprimant GCaMPs37,38,39,40, 41,42. Transitoires de ca2 + en ICC sont liés à l’activation de Ca2 +-activé Cl– canaux (codées par Ano1) qui sont importants dans la régulation de l’excitabilité du muscle lisse intestinal cellules (CML)43, 44,45. Ainsi, l’étude de Ca2 + signalisation dans ICC est fondamentale pour comprendre la motilité intestinale. L’intestin grêle murine offre un excellent exemple pour cette démonstration, qu’il sont a deux classes de CPI qui sont anatomiquement séparés et peuvent être visualisées indépendamment : J’ai) ICC sont situés dans la zone située entre les muscles lisses circulaires et longitudinaux couches, entourant le plexus myentérique (ICC-MY). Ces cellules servent de cellules de stimulateur cardiaque et génèrent de l’activité électrique appelée ondes lentes46,47,48,49; II) ICC se trouvent également parmi un plexus riche dans les terminaisons des neurones moteurs (plexus musculaire profond, donc ICC-DMP). Ces cellules servent de médiateurs des réactions à la neurotransmission entérique moteur37,39,40,50. MY-ICC et ICC-DMP sont morphologiquement différentes, et leurs Ca2 + signalisation comportements diffèrent radicalement pour accomplir leurs tâches spécifiques. ICC-MY sont stellaire en forme et forment un réseau de cellules interconnectées via gap jonctions,51,52. Ca2 + des signaux dans le manifeste de l’ICC-MY brèves et localisées dans l’espace Ca2 + sortie des événements se produisant à plusieurs sites de façon asynchrone par le biais de l’ICC-mon réseau comme visualisées dans un champ de vision (photographié avec un objectif X 60)38. Ces signaux asynchrones est organisés dans le temps en 1 seconde de clusters qui, lorsque totalisées ensemble, s’élèvent à une net 1 s cellulaire augmentation de Ca2 +. Ces signaux propage de cellule-cellule au sein du réseau ICC et donc organise Ca2 + signalisation, générés à partir des sites subcellulaires, sous une tissu large Ca2 + vague. Temporelle de clustering et de sommation de Ca2 + signaux dans ICC-MY a appelé Ca2 + grappes transitoire (CTC)38. CTC se produire rythmiquement (durées par exemple assez semblables et des périodes similaires entre CTC) 30 périodes par minute chez la souris. À l’inverse, ICC-DMP sont les cellules fusiforme, certains avec des processus secondaires, qui distribuent entre les CML et les axones variqueux et ne sont pas indépendamment forment un réseau51,52. Toutefois, ICC-DMP forment les jonctions avec la CML et fonction au sein de ce grand syncytium, connu comme le SIP syncytium53. Signaux de ca2 + se produisent à plusieurs endroits le long de la longueur des cellules, mais ces transitoires ne sont pas entraînés ou groupées dans le temps, tel qu’observé dans ICC-MY37. Ca2 + signaux dans ICC-DMP se produisent de manière stochastique, avec des intensités variables, des durées et des caractéristiques spatiales. Les protocoles ci-dessous, en utilisant l’exemple de Ca2 + signalisation dans MY-ICC et ICC-DMP, décrivent des techniques pour analyser la signalisation complexes dans les types spécifiques de cellules in situs. Nous avons utilisé le système de p de Cre-Lox inductible pour exprimer GCaMP6f exclusivement à la CPI, après induisant l’activation de Cre-Recombinase (Cre), conduite par un promoteur spécifique de l’ICC (Kit).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

Ca2 + imagerie de cellules isolées ou de types spécifiques de cellules dans les tissus intacts souvent révèle des motifs complexes de signalisation Ca2 + . Cette activité nécessite une analyse attentive et approfondie et quantification de capturer autant d’informations que possible sur les événements sous-jacents. Spatial, temporel et intensité paramètres intrinsèques aux signaux de Ca2 + comme fréquence, durée, propagation, vitesse et l’amplitude peuvent fournir certaines informations biologiques requises pour signalisation intracellulaire. Haute résolution Ca2 + imagerie typiquement résultats dans l’acquisition des fichiers de données volumineux qui prennent beaucoup de temps au processus en termes de traduire l’information d’imagerie en données quantifiables et ce processus peuvent être sensibles à la partialité et l’erreur humaine. Analyse des signaux de Ca2 + des cellules in situs s’appuie généralement sur les mesures d’intensité simple d’arbitrairement certaines régions d’intérêt (ROI) dans un champ de vision (FOV). Cette approche ignore une grande partie des signalisation des informations importantes contenues dans le champ de vision. Ainsi, afin de maximiser la récupération d’informations provenant de ces enregistrements haute résolution obtenue avec Ca2 +colorants ou optogenetic Ca2 + , d’imagerie, il conviendra d’analyse spatiale et temporelle des signaux2 + Ca est requis. Les protocoles décrits dans le présent document décrira comment un volume élevé de données peut provenir de Ca2 + imageries enregistrements pour faciliter l’analyse plus complète et la quantification des signaux2 + Ca enregistrés à partir de cellules en utilisant une combinaison de carte spatio-temporelle (STM)-fonction analyse et analyse axée sur les particules. Les protocoles décrivent également comment les différents modèles de Ca2 + signalisation observés dans différentes cellules in situ des populations peuvent être analysées de façon appropriée. À titre d’exemple, la méthode examinera Ca2 + signalisation dans une population spécialisée des cellules dans l’intestin, cellules interstitielles de Cajal (CIC), à l’aide de GECIs.

À l’aide de Kit-Cre-GCaMP6F souris (Figure 1), dynamique Ca2 + signalisation comportements d’ICC dans le tractus gastro-intestinal peuvent être photographiées sur place. Avec la microscopie confocale, photos haute résolution de certaines populations de CPI peuvent être acquis sans contaminer les signaux des autres populations d’ICC dans le même tissu mais en avions anatomiquement distinctes de mise au point (Figure ...

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Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2 + indicateurs génétiquement encodés (GECIs) ont radicalement changé comment in situ Ca2 + imagerie est réalisée. Pour optimiser la récupération de données de ces enregistrements, il faut une analyse appropriée des signaux de Ca2 + . Les protocoles dans le présent document facilitent la quantification de Ca2 + des signaux enregistrés sur place à l’aide de la cartographie spatio-temporelle et analyse axée sur les particules.

Applications de cartographie spatio-temporelle et Techniques d’analyse des particules pour quantifier la signalisation intracellulaire Ca2 + In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

La capacité d’acquérir de grandes quantités de données à partir d’expériences d’imagerie calcique s’est considérablement améliorée, en particulier avec des expériences d’imagerie tissulaire. Nos protocoles décrivent les techniques d’analyse appropriées pour quantifier et décrire ces ensembles de données. Nos protocoles génèrent une gamme de valeurs spatiales, temporelles et d’intensité qui sont intrinsèques à la signalisation du calcium dans des tissus entiers et qui peuvent être perdues dans une analyse plus rudimentaire.Une heure avant le transfert d’imagerie d’un intestin grêle récolté à partir d’une souris avec des cellules interstitielles de Cajal ou ICC qui expriment spécifiquement un indicateur de calcium génétiquement codé au stade d’un microscope confocal de disque de filature. Et infuser continuellement le tissu avec 37 degrés Celsius Krebs-Ringer bicarbonate ou KRB solution. À l’aide d’un grossissement de 60 à 100 X, localisez le plexus myenterique en forme de stellate ICC ou ICC-MY entre les couches musculaires lisses circulaires et longitudinales de l’intestin grêle.Ensuite, localisez le plexus musculaire profond en forme de fuseau ICC ou ICC-DMP dans un seul plan entre la couche musculaire lisse circulaire et le plexus submucosal et enregistrez les films comme une pile d’images du TIFF. Pour créer des cartes spatiotemporales ou des MS de l’activité calcium ICC-DMP, ouvrez la pile d’images dans ImageJ, et cliquez sur Image, Type et 32 bits pour modifier la qualité de l’image. Pour créer un clic droit de balayage en ligne sur l’outil de sélection des lignes et sélectionnez la ligne segmentée.À l’aide de clics simples à gauche tracer une ligne le long de l’accès moyen d’un ICC-DMP individuel, en cliquant en double lorsque l’ensemble de la cellule a été décrite. Sélectionnez Image, Piles et Reslice. Une fenêtre contextée apparaîtra.Sélectionnez Tournez à 90 degrés pour orienter l’analyse de la ligne de gauche à droite afin qu’elle puisse être calibrée et lue contre le temps sur l’axe x avec de l’espace sur l’axe y et cliquez sur OK. La carte spatiotemporal apparaîtra. Pour mesurer avec précision l’amplitude des signaux calciques de la carte, sélectionnez la sélection rectangulaire et dessinez une région d’intérêt autour de la zone de la STM qui affiche la zone de fluorescence la plus uniforme et la moins intense. Cliquez sur Analyser et Histogramme pour obtenir une valeur moyenne de l’intensité dans la région sélectionnée d’intérêt et cliquez sur Modifier, Sélectionner, Sélectionner tous pour sélectionner l’ensemble de la STM.Ensuite, cliquez sur Processus, Mathématiques et Diviser et entrez la valeur moyenne de l’intensité avec la région STM sélectionnée d’intérêt dans la boîte pop-up. La STM deviendra noire. Corrigez cela en cliquant sur Image, Ajustez, Luminosité/Contraste et Auto dans la fenêtre pop-up.L’analyse en ligne sera maintenant calibrée pour l’amplitude avec l’intensité de la fluorescence exprimée sous forme de fluorescence divisée par la fluorescence zéro. La STM affichera le nombre d’images dans la pile TIFF sur l’axe x et le nombre de pixels représentant la longueur de la cellule sur l’axe y. Pour quantifier les données temporelles et spatiales des signaux de calcium cliquez sur Image et Propriétés et entrez les valeurs appropriées pour calibrer complètement la STM pour l’espace et le temps dans la fenêtre contexturée.Pour analyser les différents événements calcique, cliquez sur Straight Line et cliquez et faites glisser sur la STM pour tracer une ligne horizontale droite à travers le centre d’un événement calcium parallèle à l’axe x. Cliquez ensuite analyser et tracer le profil. Une boîte apparaîtra montrant le profil de l’intrigue de l’événement calcium.Pour l’analyse basée sur les particules des données de signalisation de calcium ICC-MY, ouvrez le fichier de film en volume et cliquez à droite pour sélectionner filtre STK, Différenciez-vous. Cliquez à nouveau à droite pour saisir une valeur à différencier. Appuyez sur Entrez et cliquez à gauche pour initier la différenciation.Pour créer des particules, utilisez le bouton de la souris moyenne pour faire défiler le film pour sélectionner une section de 20 à 40 images qui comprend une période de quiescent, suivie de l’apparition d’un cluster transitoire en calcium et de 20 à 40 images qui suivent juste après l’amas. Lorsque tous les cadres ont été sélectionnés en clic droit dans la fenêtre du film pour accéder aux informations sur les particules STK OPS Ramp DS et cliquez pour exécuter une routine d’analyse des particules qui accélère progressivement le seuil du maximum à l’intensité minimale. Pour assurer une analyse réussie des particules, assurez-vous d’incorporer autant de non-activité transitoire avant le calcium et autant de non-activité transitoire post-calcium que vous le pouvez.Cela aidera à augmenter le rapport signal-bruit. L’analyse sera affichée graphiquement dans la fenêtre de l’intrigue comme parcelle de bruit et dans la fenêtre de traces comme trois traces de couleur avec la trace verte représentant le nombre de particules, la trace rouge représentant la taille moyenne des particules, et la trace bleue représentant le seuil d’intensité absolue. Pour équilibrer l’histogramme, l’intrigue du bruit des particules presse H sur le clavier.Ensuite, appuyez sur la touche support droit pour cycle à travers les schémas de couleurs jusqu’à ce que l’arrière-plan est blanc avec les traces de couleur sur le dessus. Appuyez une fois sur F sur le clavier pour mettre en place un outil de mesure. Appuyez ensuite sur F une deuxième fois pour marquer une seule ligne verticale dans la barre de défilement de la fenêtre de traces sur la parcelle à l’intersection où les parcelles colorées commencent à se déplacer vers le côté droit.Dans la fenêtre de traces, utilisez le bouton de la souris moyenne pour faire défiler du point d’inflexion de la trace rouge à la ligne verticale blanche marquée. Après avoir noté la moyenne Y affichée, cliquez à nouveau sur le bouton de la souris du milieu à l’intérieur de la fenêtre des traces pour désélectionner la trace bleue. Dans la fenêtre de film cliquez sur C pour faire monter une roue de couleur, et D pour ajuster le seuil.Les particules valides seront désormais affichées en rouge, et celles qui saturent seront blanches. Utilisez le bouton de la souris gauche pour faire défiler jusqu’à ce que les zones blanches soient enlevées et utilisez le bouton de la souris moyenne pour ajuster la valeur numérique jaune de la roue de couleur à la valeur moyenne Y pour attribuer tout en rouge comme particule transitoire active de calcium au seuil déterminé. Pour enregistrer les données en tant que fichier de particules basé sur la coordination, cliquez à droite pour accéder à STK 3D, économisez la particule zéro et cliquez à gauche pour enregistrer le fichier.Pour créer des cartes de chaleur d’activité des particules, ouvrez le fichier de particules enregistré et cliquez à droite dans la fenêtre du film pour accéder aux particules STKops, StatMap Flag et saisir les affectations de drapeau à analyser. Cliquez pour appliquer l’analyse et une carte thermique montrant le total des particules pour toute la durée de l’enregistrement avec différentes couleurs représentant le pourcentage d’occurrence tout au long de l’enregistrement. Cliquez à droite pour enregistrer la carte thermique en tant que fichier TIFF.Puis cliquez à droite dans la fenêtre du film pour accéder à la mesure des particules, stats de particules STK égale, et entrez une affectation de drapeau pour l’analyse. Une série de traces seront générées dans la fenêtre de trace. L’analyse de la STM permet de surveiller et d’enregistrer les caractéristiques spatiales de la signalisation du calcium, comme la propagation spatiale et la vitesse de propagation.Ces informations peuvent être amassées pour fournir une vue assez complète des comportements de signalisation du calcium dans les cellules de leur environnement natif. À l’aide de l’analyse des particules, des informations quantitatives sur la signalisation du calcium peuvent être calculées en mesurant la zone des particules et le nombre de particules, qui ensemble peuvent être utilisés pour déterminer les plages spatiales d’activation du signal calcique dans un champ de vision spécifique. L’analyse des particules permet également la quantification en profondeur de la signalisation subcellulaire du calcium par l’examen de l’emplacement et les probabilités de cuisson des sites de cuisson du calcium.En allouant les particules en différents drapeaux en fonction de leurs caractéristiques temporelles, les particules initiatiques peuvent être cartographiées avec précision. Et une mine de données dures acquises sur le nombre de sites d’initiation, la taille du site en pixels et micromètres, la probabilité que chaque site d’initiation tire une ou plusieurs fois au cours de chaque grappe transitoire de calcium, et le pourcentage de sites de cuisson qui s’en tirent au cours de chaque cycle transitoire de cluster de calcium peuvent être obtenus. La cohérence est la clé du succès de ce protocole.Tous les ensembles de données et tous les films doivent être traités exactement de la même manière pour garantir des résultats fiables et reproductibles. Cela est particulièrement vrai lorsqu’il s’agit de fichiers de particules. Nos protocoles permettent une caractérisation profonde de la signalisation du calcium in situ, et une gamme de méthodes statistiques, lorsqu’elles sont utilisées de manière appropriée, peuvent évaluer les différences entre une gamme de paramètres spatiaux et temporels.Ces techniques d’analyse dans notre protocole ont permis aux chercheurs de poser et de répondre à des questions auparavant non adressées concernant le rythme intestinal, et l’innervation intestinale, ainsi que le contrôle neuronal des voies urinaires inférieures.

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

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