Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Finanzierung wurde durch die NIDDK über P01 DK41315 bereitgestellt.

Alle verwendeten Tiere und die Protokolle, die in dieser Studie durchgeführt wurden in Übereinstimmung mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Alle Verfahren wurden vom institutionellen Animal Use and Care Committee an der University of Nevada, Reno genehmigt.
1. Generation der KitGCaMP6f Mäuse
<ol><li>Ai95 Kreuz (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f Mäuse) und c-Kit+ / Cre-ERT2 (Kit-Cre Mäuse), ICC spezifische GCaMP6f mit dem Ausdruc...

Ca2 + Bildgebung der bestimmte Arten von Zellen im intakten Gewebe oder in Netzwerken von Zellen oft offenbart komplexe Muster von Ca2 + Transienten. Diese Tätigkeit erfordert eine sorgfältige und eingehende Analysen und Quantifizierung, so viele Informationen über die zugrunde liegenden Ereignisse und Kinetik dieser Ereignisse wie möglich zu erfassen. STM und PTCL Analyse bieten die Möglichkeit, die Menge von quantitativen Daten ergab von Aufnahmen dieser Art zu maximieren.
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Ca2 + ist eine allgegenwärtige intrazellulären Messenger steuert eine Vielzahl von zellulären Prozessen, z. B. Muskel Kontraktion1,2, Stoffwechsel3, Zelle Verbreitung3,4, 5, Stimulation der Freisetzung von Neurotransmittern im Nerv Klemmen6,7und Aktivierung der Transkription Faktoren im Zellkern. 7 intrazellulären Ca2 + Signale oft nehmen die Form von vorübergehenden Erhöhungen im cytosolischen Ca2 +, und diese können spontan oder ergeben sich aus Agonist Stimulation abhängig von der Zelle Typ8. Räumliche, zeitliche und Intensität Parameter untrennbar mit Ca2 + Signale wie Häufigkeit, Dauer, Ausbreitung, Geschwindigkeit und Amplitude können die biologische erforderlich für intrazelluläre Signalwege5, Informationen 7 , 9. zytoplasmatischen Ca2 + Signale können resultieren aus dem Zustrom von Ca2 + aus dem extrazellulären Raum oder über Ca2 + Release aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) über Ca2 + Release-Kanäle wie Ryanodin-Rezeptoren (RyRs) und Inositol-Tri-Phosphat-Rezeptoren (IP3Rs)10. RyRs und IP-3Rs können beide tragen zu der Generation von Ca2 + Signale und die konzertierte Öffnung dieser Kanäle, die in mit verschiedenen Ca2 + Zustrom Mechanismen Kombination kann dazu führen, dass eine Vielzahl von Ca2 + Signalisierung Muster Das sind geprägt durch die Zahlen und Wahrscheinlichkeit von Ca2 + Zustrom Kanälen, das Expressionsprofil von Ca2 + Release-Kanäle, die Nähe zwischen Ca2 + Zustrom und Release-Kanäle und Ausdruck und Verteilung von Ca2 Öffnen + Reuptake und Extrusion Proteine. Ca2 + Signale dauern Form von einheitlichen, langlebig, hohe Intensität globale Schwingungen, die für mehrere Sekunden oder sogar Minuten dauern propagieren intrazelluläre und interzelluläre Ca2 + Wellen, die intrazelluläre Strecken kreuzen kann mehr als 100 µm10,11,12,13,14,15,16oder mehr kurze, räumlich lokalisierte Ereignisse wie Ca2 + Funken und Ca2 + Züge, die auf Zehntausende Millisekunde Fristen auftreten und weniger als 5 µm17,18,19,20zu verbreiten.
Fluoreszenz-Mikroskopie hat am meisten benutzt, um Ca2 + Signalisierung in Zellen isoliert und kultiviert und in intakten Geweben zu überwachen. Traditionell, diese Experimente beteiligt die Verwendung von fluoreszierenden Ca2 + Indikatoren, ratiometrischen und nicht ratiometrischen Farbstoffe wie Fura2, Fluo3/4 oder Rhod2, unter anderem 21,22,23. Diese Indikatoren wurden entwickelt, um auf Zellmembranen durchlässig sein und dann in den Zellen durch die Spaltung der Estergruppe über endogene Esterasen eingeschlossen werden. Bindung von Ca2 + , die hohe Affinität Indikatoren verursachten Veränderungen in Fluoreszenz, wenn die Zellen und Gewebe von entsprechenden Wellenlängen des Lichts beleuchtet wurden. Die Verwendung der Zelle durchlässig Ca2 + Indikatoren verbessert stark unser Verständnis von Ca2 + Signalisierung in lebenden Zellen und räumliche Auflösung und Quantifizierung dieser Signale, die nicht möglich war, durch Prüfung Ca2 + Signale erlaubt durch andere Mittel, wie Elektrophysiologie. Traditionelle Ca2 + Indikatoren müssen jedoch einige Einschränkungen, z. B. Immunofluoreszenz, die über erweiterte Aufnahme Perioden24auftritt. Während neuere Ca2 + Indikator Farbstoffe wie z. B. Cal520/590 haben stark verbesserte Signal-Rausch-Verhältnis und die Fähigkeit, lokale Ca2 + Signale25zu erkennen, können Probleme mit Immunofluoreszenz immer noch ein Problem für einige Forscher bleiben. 26,27,28. Steilen Immunofluoreszenz schränkt auch die Vergrößerung, die Rate der Bildaufnahme, und Auflösung, die für Aufnahmen verwendet werden kann, da mehr objektive Leistung und höhere Raten von Bildaufnahme erfordern erhöhte Erregung Lichtintensität, die Immunofluoreszenz erhöht.
Diese Einschränkungen des traditionellen Ca2 + Indikatorfarbstoffen verstärkt werden, wenn Sie Ca2 + Signale an Ort und Stelle aufnehmen, zum Beispiel wenn Signale Aufnahme intrazellulären Ca2 + von intakten Gewebe. Aufgrund der oben genannten Probleme Visualisierung von Ca2 + Signale in Situ Zelle durchlässige Ca2 + Indikatoren zu verwenden wurde beschränkt auf low-Power-Vergrößerung und reduzierte Preise der Bilderfassung, Einschränkung der Fähigkeit der Ermittler zu erfassen und zeitlich oder räumlich eingeschränkt subzelluläre Ca2 + Signale zu quantifizieren. Daher ist es schwierig zu erfassen, zu analysieren und zu schätzen wissen die räumliche und zeitliche Komplexität der Ca2 + Signale, die in der Generation der gewünschten biologischen Reaktionen wichtig sein kann, wie oben beschrieben gewesen. Analyse von Ca2 + Signale von Zellen in-situ stützt sich in der Regel auf einfache Intensität Messungen aus ausgewählten Regionen von Interesse (ROI) in ein Sichtfeld (FOV). Die willkürliche Wahl der Anzahl, Größe und Position des ROIs, abhängig von der Laune des Forschers, kann die Ergebnisse stark beeinflussen. Neben inhärenten Bias mit ROI-Analyse, dieser Ansatz ignoriert ein Großteil der wichtigen Signalisierung Informationen in das Blickfeld, als dynamische Ca2 + -Ereignisse innerhalb einer willkürlich gewählten ROI für die Analyse ausgewählt sind. Analyse des ROIs versäumt darüber hinaus Auskunft über die räumlichen Eigenschaften der Ca2 + Signale beobachtet. Beispielsweise ist es nicht möglich um zu unterscheiden zwischen einem Anstieg Ca2 + infolge einer Vermehrung Ca2 + Welle und eine sehr lokalisierte Ca2 + release Event von Tabellen von Ca2 + Signale innerhalb eines ROI.
Das Aufkommen der genetisch codierten Ca2 + Indikatoren (GECIs) hat sich radikal verändert wie Ca2 + Bildgebung durchgeführt in Situ29,30,31,32,33 sein kann . Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung von GECIs über Farbstoffe. Das wichtigste ist vielleicht, dass Ausdruck der GECI Zelle gezielt erfolgen kann, die reduziert unerwünschte Hintergrundgeräusche Kontamination von Zellen nicht von Interesse. Ein weiterer Vorteil von GECIs gegenüber traditionellen Ca2 + Indikatoren ist, dass Immunofluoreszenz reduziert (wie Fluoreszenz und consequentially Immunofluoreszenz tritt nur auf, wenn Zellen aktiv sind), im Vergleich zu Farbstoff beladen Exemplare, besonders bei hohen Vergrößerung und hohe Bild erfassen34. So kurze, lokalisierte subzellulären Ca2 + Signale in Situ imaging mit GECIs, wie z. B. die GCaMP Reihe von optogenetische Sensoren bietet Ermittler die Möglichkeit zur Aufzeichnung und untersuchen Ca2 + signalisieren in den Zellen innerhalb ihrer nativen Umgebungen, die zuvor nicht möglich gewesen. Um die Verwertung von Informationen aus solchen hochauflösende Aufnahmen zu maximieren, ist die entsprechende räumliche und zeitliche Analyse der Ca2 + Signale erforderlich. Es sei darauf hingewiesen, dass während GECIs einige klare Vorteile bieten können, haben neuere Studien gezeigt, dass Ca2 + Bildgebung von großen Populationen verschiedener neurochemischen Klassen von Neuronen, die gleichzeitig mit herkömmlichen erfolgreich durchgeführt werden kann Ca2 + Indikatoren, die in der tierischen35nicht genetisch codiert sind. Dieser Ansatz verwendet post-hoc-Immunohistochemistry, um mehrere verschiedene Klassen von Neuronen feuern mit hoher Frequenz in den synchronisierten Stössen zu offenbaren, und das Potenzial, das genetische Veränderungen für das Tier mit den physiologischen eingegriffen haben können vermieden Verhalten der Ermittler versucht,35,36zu verstehen.
Die Protokolle, die in diesem Dokument beschriebenen erleichtern vollständigere Analyse und Quantifizierung von Ca2 + -Signale aufgezeichnet von Zellen an Ort und Stelle mit einer Kombination aus raumzeitlichen Karte (STM)-Basis und Partikel-basierte Analyse. Die Protokolle beschreiben auch wie verschiedene Muster von Ca2 + signalisieren beobachteten in andere Zelle, die Bevölkerung vor Ort angemessen analysiert werden können. Zur Veranschaulichung wird die Methode Ca2 + Signalisierung in eine spezialisierte Population von Zellen im Dünndarm, interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) prüfen. ICC sind spezialisierte Zellen im Gastrointestinaltrakt (GI), die dynamische intrazellulären Ca2 + -Signalisierung, aufweisen wie visualisiert mit Mäusen, die mit dem Ausdruck GCaMPs37,38,39,40, 41,42. Ca2 + Transienten in ICC sind verbunden zu einer Aktivierung von Ca2 +-aktiviert Cl– Kanäle (kodiert durch Ano1), die wichtig bei der Regulation der Erregbarkeit der intestinalen glatten Muskel Zellen (SMCs)43, 44,45. Somit ist die Studie von Ca2 + Signalisierung in ICC grundlegend für das Verständnis der intestinalen Motilität. Der murinen Dünndarm bietet ein hervorragendes Beispiel für diese Demonstration, da gibt es zwei Klassen von ICC, die anatomisch getrennt und unabhängig voneinander visualisiert werden: ich) ICC befinden sich im Bereich zwischen der Kreis- und längs glatten Muskulatur Schichten, rund um den Auerbach-Plexus (ICC-MY). Diese Zellen dienen als Schrittmacher Zellen und erzeugen die elektrische Aktivität bekannt als langsame Wellen46,47,48,49; (II) ICC befinden sich ebenfalls unter einem Plexus reich an den Klemmen des motorischen Neuronen (tiefe muskuläre Plexus, also ICC-DMP). Diese Zellen dienen als Vermittler von Antworten auf enterischen motor Neurotransmission37,39,40,50. ICC-MY ICC-DMP unterscheiden sich morphologisch und ihrer Ca2 + Signalisierung Verhaltensweisen unterscheiden sich radikal um ihre spezifischen Aufgaben zu erfüllen. ICC-mein Ganglion in Form und bilden ein Netzwerk von miteinander verbundenen Zellen über Gap Junctions51,52. Ca2 + -Signale in ICC-mein Manifest als kurze und räumlich lokalisierte Ca2 + Release Ereignisse, die an mehreren Standorten asynchron durch die ICC-mein Netzwerk als visualisierte innerhalb einer FOV (abgebildet mit einem 60 X Ziel)38. Diese asynchrone Signale zeitlich gliedern sich in Cluster 1 Sekunde, die, wenn zusammen tabelliert, belaufen sich auf einen Netto 1 s zellulären Anstieg Ca2 +. Diese Signale verbreiten von Zelle zu Zelle innerhalb des ICC-Netzwerks und deshalb organisieren Ca2 + -Signalisierung, aus subzellulären Websites in einem Gewebe Breite Ca2 + Welle erzeugt. Zeitliche clustering und Summierung von Ca2 + Signale ICC-mein Ca2 + transiente Cluster (CTCs)38bezeichnet worden. CTC auftreten rhythmisch (z. B. ganz ähnliche Laufzeiten und ähnliche Zeiträume zwischen CTCs) 30 Mal pro Minute in der Maus. Umgekehrt, ICC-DMP sind Spindel förmigen Zellen, teilweise mit sekundären Prozesse, die zwischen SMCs und Krampfadern Nerv Prozesse zu verteilen und nicht selbständig bilden ein Netzwerk51,52. ICC-DMP Form Lücke Kreuzungen mit SMCs, jedoch und Funktion innerhalb dieser größere Synzytien, bekannt als die SIP Synzytien53. Ca2 + Signale auftreten an mehreren Standorten entlang der Länge der Zellen, aber diese Transienten nicht mitgerissen oder zeitlich gruppiert, wie in ICC-MY37beobachtet. Ca2 + Signale in ICC-DMP auftreten in einer stochastischen Weise mit variabler Intensität, Dauer und räumlichen Eigenschaften. Die Protokolle unter, am Beispiel von Ca2 + Signalisierung in ICC-MY und ICC-DMP, Techniken zur Analyse komplexer Signalisierung in bestimmte Arten von Zellen an Ort und Stelle zu beschreiben. Wir nutzten das induzierbare Cre Lox-p-System GCaMP6f ausschließlich in ICC, auszudrücken, nach Aktivierung des Cre-Rekombinase (Cre) angetrieben durch ein ICC-spezifischen Promotor (Kit) induzieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

Ca2 + Bildgebung von isolierten Zellen oder bestimmte Arten von Zellen im intakten Gewebe oft offenbart komplexe Muster von Ca2 + -Signalisierung. Diese Tätigkeit erfordert eine sorgfältige und eingehende Analysen und Quantifizierung, so viele Informationen über die zugrunde liegenden Ereignisse wie möglich zu erfassen. Räumliche, zeitliche und Intensität Parameter untrennbar mit Ca2 + Signale wie Dauer, Ausbreitung, Geschwindigkeit, Frequenz und Amplitude können einige biologische Informationen zur intrazellulären Signalgebung erforderlich. Hochauflösende Ca2 + imaging in der Regel Ergebnisse bei der Akquisition von großen Dateien, die in Bezug auf die Bildinformationen in quantifizierbare Daten zu übersetzen, und dieser Prozess zeitaufwendig sind werden anfällig für menschliche Fehler und Vorurteile. Analyse von Ca2 + Signale von Zellen in-situ stützt sich in der Regel auf einfache Intensität Messungen aus willkürlich ausgewählten Regionen von Interesse (ROI) in ein Sichtfeld (FOV). Dieser Ansatz ignoriert viel wichtiger Signalisierung Informationen in das Blickfeld. Somit ist zur Wiederherstellung von Informationen aus solchen hochauflösende Aufnahmen mit Ca2 +Farbstoffe oder optogenetische Ca2 + erhalten Maximierung Bildgebung, angemessene räumliche und zeitliche Analyse der Ca2 + Signale erforderlich. Die Protokolle, die in diesem Dokument beschriebenen werden beschrieben, wie ein hohes Volumen an Daten von Ca2 + bildgebenden Aufnahmen ermöglichen umfassendere Analyse und Quantifizierung von Ca2 + Signale aufgezeichnet von Zellen mit einer Kombination aus abgerufen werden kann räumlich-zeitliche Karte (STM)-Basis und Partikel-basierte Analyse. Die Protokolle beschreiben auch wie verschiedene Muster von Ca2 + signalisieren beobachteten in andere Zelle, die Bevölkerung vor Ort angemessen analysiert werden können. Zur Veranschaulichung wird die Methode Ca2 + Signalisierung in eine spezialisierte Population von Zellen im Dünndarm, interstitiellen Zellen von Cajal (ICC), mit GECIs prüfen.

Mit Hilfe von Kit-Cre-GCaMP6F Mäusen (Abbildung 1), dynamische Ca2 + signalisieren, dass Verhaltensweisen von ICC im Magen-Darm-Trakt in-situ abgebildet werden können. Mit der konfokalen Mikroskopie können hochauflösende Bilder von bestimmten Populationen von ICC erworben werden, ohne Kontamination Signale von anderen Populationen der ICC innerhalb der gleichen Gewebe, sondern in anatomisch unterschiedliche Ebenen von Fokus (<strong class="xfig...

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Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetisch codierte Ca2 + Indikatoren (GECIs) haben sich radikal verändert wie in-situ Ca2 + Bildgebung durchgeführt wird. Um die Wiederherstellung von Daten aus solchen Aufnahmen zu maximieren, ist die entsprechende Analysen von Ca2 + Signale erforderlich. Die Protokolle in diesem Papier erleichtern die Quantifizierung von Ca2 + Signale an Ort und Stelle mit räumlich-zeitliche Zuordnung und partikelbasierten Analyse aufgezeichnet.

Anwendungen der räumlich-zeitliche Zuordnung und Partikel-Analyse-Techniken zu quantifizieren, intrazellulären Ca2 + Signalisierung In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Die Fähigkeit, große Datenmengen aus Kalzium-Bildgebungsexperimenten zu erfassen, hat sich drastisch verbessert, insbesondere bei Gewebebildversuchen. Unsere Protokolle beschreiben geeignete Analysetechniken zur Quantifizierung und Beschreibung dieser Datensätze. Unsere Protokolle erzeugen eine Reihe von räumlichen, zeitlichen und Intensitätswerten, die der Kalziumsignalisierung in ganzen Geweben innewohnen, und dies kann in einer rudimentäreren Analyse verloren gehen.Eine Stunde vor der Bildgebung transferiert ein Dünndarm von einer Maus mit interstitiellen Zellen von Cajal oder ICC geerntet, die speziell einen genetisch kodierten Kalzium-Indikator auf das Stadium eines Spinnscheibe konfokalen Mikroskops ausdrücken. Und durchdringen Sie kontinuierlich das Gewebe mit 37 Grad Celsius Krebs-Ringer Bicarbonat oder KRB-Lösung. Mit einer 60 bis 100 X Vergrößerung lokalisieren Sie den stellatförmigen myenterischen Plexus ICC oder ICC-MY zwischen den kreisförmigen und längsglatten Muskelschichten des Dünndarms.Dann lokalisieren Sie den spindelförmigen tiefen Muskelplexus ICC oder ICC-DMP in einer einzigen Ebene zwischen der kreisförmigen glatten Muskelschicht und dem submucosalen Plexus und speichern Sie die Filme als Stapel von TIFF-Bildern. Um raumzeitliche Karten oder STMs der ICC-DMP-Calciumaktivität zu erstellen, öffnen Sie den Bildstapel in ImageJ, und klicken Sie auf Bild, Typ und 32-Bit, um die Bildqualität zu ändern. Um einen Zeilenscan zu erstellen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Linienauswahlwerkzeug, und wählen Sie die segmentierte Linie aus.Zeichnen Sie mit einzelnen Linken klickt eine Linie entlang des mittleren Zugriffs eines einzelnen ICC-DMP, indem Sie doppelklicken, wenn die gesamte Zelle umrissen wurde. Wählen Sie Bild, Stapel und Reslice. Es wird ein Popupfenster angezeigt.Wählen Sie Um90 Grad drehen, um den Linienscan von links nach rechts auszurichten, damit er kalibriert und gegen die Zeit auf der x-Achse mit Leerzeichen auf der y-Achse gelesen werden kann, und klicken Sie auf OK. Die raumzeitliche Karte wird angezeigt. Um die Amplitude der Kalziumsignale aus der Karte genau zu messen, wählen Sie die rechteckige Auswahl aus und zeichnen Sie einen Bereich von Interesse um das Gebiet innerhalb des STM, der den gleichmäßigsten und am wenigsten intensiven Fluoreszenzbereich anzeigt. Klicken Sie auf Analysieren und Histogramm, um einen Mittelwert der Intensität innerhalb des ausgewählten Interessenbereichs zu erhalten, und klicken Sie auf Bearbeiten, Auswahl, Alle auswählen, um den gesamten STM auszuwählen.Klicken Sie als Nächstes auf Prozess, Mathe und Divide, und geben Sie den Mittelwert der Intensität mit der ausgewählten STM-Region ein, die von Interesse ist, in das Pop-up-Feld. Der STM wird schwarz. Korrigieren Sie dies, indem Sie im Popup-Fenster auf Bild, Anpassen, Helligkeit/Kontrast und Auto klicken.Der Linienscan wird nun für die Amplitude mit der Intensität der Fluoreszenz kalibriert, ausgedrückt als Fluoreszenz geteilt durch die Nullfluoreszenz. Der STM zeigt die Anzahl der Frames im TIFF-Stack auf der x-Achse und die Anzahl der Pixel an, die die Länge der Zelle auf der y-Achse darstellen. Um die zeitlichen und räumlichen Daten aus den Calciumsignalen zu quantifizieren, klicken Sie auf Bild und Eigenschaften und geben Sie die entsprechenden Werte ein, um den STM vollständig auf Raum und Zeit im Pop-up-Fenster zu kalibrieren.Um die einzelnen Calciumereignisse zu analysieren, klicken Sie auf Gerade Linie, und klicken und ziehen Sie auf den STM, um eine gerade horizontale Linie durch die Mitte eines Calciumereignisses parallel zur x-Achse zu zeichnen. Klicken Sie dann auf Analysieren und Plotprofil. Es wird ein Feld angezeigt, das das Diagrammprofil des Kalziumereignisses anzeigt.Für die partikelbasierte Analyse der ICC-MY Calcium-Signaldaten öffnen Sie die Filmdatei in Volumetry und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um STK-Filter, Differenzieren auszuwählen. Klicken Sie erneut mit der rechten Maustaste, um einen zu differenzierenden Wert einzugeben. Drücken Sie die Eingabetaste, und klicken Sie mit der linken Maustaste, um die Differenzierung zu initiieren.Um Partikel zu erstellen, scrollen Sie mit der mittleren Maustaste durch den Film, um einen 20 bis 40 Frame-Abschnitt auszuwählen, der eine Ruhezeit enthält, gefolgt vom Auftreten eines kalziumtransienten Clusters und 20 bis 40 Frames, die direkt nach dem Cluster folgen. Wenn alle Frames mit der rechten Maustaste im Filmfenster ausgewählt wurden, um auf STK OPS Ramp DS-Partikelinformationen zuzugreifen, klicken Sie auf eine Partikelanalyseroutine, die den Schwellenwert schrittweise von der maximalen auf die minimale Intensität hochleitet. Um eine erfolgreiche Partikelanalyse sicherzustellen, stellen Sie sicher, dass Sie so viel präkalziumtransiente Cluster-Nichtaktivität und so viel post-Calcium transientCluster-Nichtaktivität wie möglich integrieren.Dies wird dazu beitragen, das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Die Analyse wird im Plotfenster grafisch als Rauschendiagramm und im Ablaufverfolgungsfenster als drei Farbspuren dargestellt, wobei die grüne Spur die Anzahl der Partikel, die rote Spur, die die durchschnittliche Partikelgröße darstellt, und die blaue Spur, die den Schwellenwert für die absolute Intensität darstellt, darstellt. Um das Histogramm auszugleichen, drücken Sie die Darstellung des Partikelrauschens H auf der Tastatur.Drücken Sie dann die rechte Klammertaste, um Farbschemata zu durchlaufen, bis der Hintergrund weiß ist und die Farbspuren oben sind. Drücken Sie einmal F auf der Tastatur, um ein Messwerkzeug aufzurufen. Drücken Sie dann ein zweites Mal F, um eine einzelne vertikale Linie in der Bildlaufleiste des Diagrammfensters auf dem Diagramm an der Kreuzung zu markieren, an der sich die farbigen Diagramme auf die rechte Seite verschieben.Verwenden Sie im Ablaufverfolgungsfenster die mittlere Maustaste, um vom Wendepunkt der roten Spur zur markierten weißen vertikalen Linie zu scrollen. Nachdem Sie den angezeigten Y-Durchschnitt notiert haben, klicken Sie erneut auf die mittlere Maustaste im Ablaufverfolgungsfenster, um die Blaue Spur zu deaktivieren. Klicken Sie im Filmfenster auf C, um ein Farbrad aufzuführen, und D, um den Schwellenwert anzupassen.Gültige Partikel werden nun rot angezeigt, und diejenigen, die gesättigt sind, werden weiß sein. Verwenden Sie die linke Maustaste, um zu scrollen, bis die weißen Bereiche entfernt sind, und verwenden Sie die mittlere Maustaste, um den gelben numerischen Wert im Farbrad an den Y-Durchschnittswert anzupassen, um alles in Rot als aktives transientes Kalziumpartikel am festgelegten Schwellenwert zuzuweisen. Um die Daten als koordinatenbasierte Partikeldatei zu speichern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf STK 3D, speichern Sie Partikel Null, und klicken Sie mit der linken Maustaste, um die Datei zu speichern.Um Partikelaktivitäts-Heatmaps zu erstellen, öffnen Sie die gespeicherte Partikeldatei und klicken Sie mit der rechten Maustaste in das Filmfenster, um auf Partikel STKops, StatMap Flag zuzugreifen und Flagzuweisungen einzugeben, um sie zu analysieren. Klicken Sie hierauf, um die Analyse und eine Heatmap anzuwenden, in der die Gesamtpartikel für die gesamte Aufzeichnungslänge mit unterschiedlichen Farben angezeigt werden, die das prozentuale Vorkommen während der Aufzeichnung darstellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Heatmap als TIFF-Datei zu speichern.Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste in das Filmfenster, um auf partikelmess, Partikelwerte STK gleich zu greifen, und geben Sie eine Flagzuweisung für die Analyse ein. Im Ablaufverfolgungsfenster wird eine Reihe von Ablaufverfolgungen generiert. Die STM-Analyse bietet die Möglichkeit, die räumlichen Merkmale der Calciumsignalisierung zu überwachen und aufzuzeichnen, wie z. B. die räumliche Ausbreitung und Ausbreitungsgeschwindigkeit.Diese Informationen können angesammelt werden, um eine ziemlich vollständige Ansicht des Kalziumsignalverhaltens innerhalb von Zellen in ihren nativen Umgebungen zu bieten. Mittels Partikelanalyse können quantitative Informationen über die Kalziumsignalisierung durch Messung der Partikelfläche und der Partikelzahl berechnet werden, die zusammen verwendet werden können, um die räumlichen Bereiche der Calciumsignalaktivierung innerhalb eines bestimmten Sichtfeldes zu bestimmen. Die Partikelanalyse ermöglicht auch die eingehende Quantifizierung der subzellulären Calciumsignalisierung durch Untersuchung der Standort- und Brennwahrscheinlichkeiten von Kalziumbrennstellen.Durch die Zuordnung der Partikel in verschiedene Flaggen basierend auf ihren zeitlichen Eigenschaften können die anrichtenden Teilchen genau abgebildet werden. Und eine Fülle von harten Daten über die Anzahl der Initiationsstandorte, die Größe des Standorts in Pixeln und Mikrometern, die Wahrscheinlichkeit, dass jede Initiationsstelle während jedes Kalzium-Transientenclusters ein- oder mehrmals ausgelöst wird, und der Prozentsatz der Brennstellen, die während jedes Kalziumtransienten-Cluster-Zyklus feuern, kann ermittelt werden. Konsistenz ist der Schlüssel zum Erfolg in diesem Protokoll.Alle Datensätze und alle Filme müssen exakt gleich behandelt werden, um zuverlässige, wiederholbare Ergebnisse zu gewährleisten. Dies gilt insbesondere für den Umgang mit Partikeldateien. Unsere Protokolle ermöglichen eine tiefe Charakterisierung der Kalziumsignalisierung vor Ort, und eine Reihe statistischer Methoden kann bei sachgemäßer Verwendung Unterschiede zwischen einem Bereich räumlicher und zeitlicher Parameter bewerten.Diese Analysetechniken in unserem Protokoll haben es Forschern ermöglicht, zuvor unadressierbare Fragen im Zusammenhang mit der Darmpacemaking und Darminnervation sowie der neuronalen Kontrolle der unteren Harnwege zu stellen und zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Biology

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