Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

מימון סופק על ידי NIDDK, דרך P01 DK41315.

כל בעלי החיים שבהם משתמשים הפרוטוקולים ביצעו במחקר זה היו לפי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. כל ההליכים אושרו על-ידי שימוש חיה מוסדיים ו טיפול ועד האוניברסיטה של נבאדה, רינו.
1. דור של KitGCaMP6f עכברים
<ol><li>קרוס Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (עכברים GCaMP6f) ו- c-Kit/ C...

Ca2 + הדמיה של סוגי תאים בתוך הרקמות שלמים או רשתות של תאים ספציפיים לעיתים קרובות חושף דפוסים מורכבים של Ca2 + תופעות מעבר. פעילות זו מחייבת ניתוח זהיר ומעמיק כימות ללכוד כמה שיותר מידע אודות אירועים הבסיסית וקינטיקה של אירועים אלה ככל האפשר. ה-STM וניתוח PTCL לספק הזדמנות כדי למקסם א?...

Ca2 + הוא שליח תאיים בכל מקום אשר שולטת מגוון רחב של תהליכים תאיים, כגון שריר התכווצות1,2, חילוף החומרים3, תא התפשטות3,4, 5, גירוי של שחרור נוירוטרנסמיטר עצב מסופי6,7, והפעלה של שעתוק גורמים בגרעין. 7 Ca תאיים2 + מאותת לעיתים קרובות ללבוש הצורה של הגבהים חולף ב Ca cytosolic2 +, אלה יכולים להיות ספונטני או נובעים אגוניסט גירוי בהתאם סוג התא8. Spatial, זמני ופרמטרים בעוצמה מהותי Ca2 + אותות כגון תדירות, משך, הפצת, מהירות, משרעת לספק את המידע הביולוגי הדרושות האיתות תאיים5, 7 , 9. cytoplasmic Ca2 + אותות יכול לנבוע זרם של Ca2 + מן המרחב חוץ-תאית או באמצעות Ca2 + שחרור תוך-פלזמית (ER) באמצעות Ca2 + ערוצי הפצה כגון קולטנים ryanodine (RyRs) ו קולטנים אינוזיטול-tri-פוספט (IP3ר')10. RyRs ו- IP3ר' עשוי גם לתרום הדור של Ca2 + אותות, הפתח מתואמת של הערוצים הללו, אשר בשילוב עם Ca2 + זרם מנגנונים שונים יכולים לגרום מספר עצום של Ca2 + איתות דפוסים אשר עוצבו על ידי המספרים ולפתוח את ההסתברות של Ca2 + ערוצי זרימה, לפרופיל ביטוי של Ca2 + ערוצי הפצה, הקרבה בין Ca2 + זרם, ערוצי פרסום, ואת הביטוי והפצה של Ca2 + חלבונים ספיגה חוזרת של הבלטה. Ca2 + אותות עשוי ללבוש הצורה של מדים, ארוך טווח, תנודות הכללית בעוצמה גבוהה זה עשוי להימשך מספר שניות או דקות אפילו, הפצת תאיים המערכת Ca2 + גלים זה יכול לחצות מרחקים תאיים מעל 100 מיקרומטר10,11,12,13,14,15,16או יותר קצרה, במרחב מקומי אירועים כגון Ca2 + ניצוצות ו- Ca2 + פחזניות זה להתרחש על עשרות צירי זמן של אלפיות השנייה והתפשטה פחות מ- 5 מיקרומטר17,18,19,20.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי כבר בשימוש נרחב כדי לפקח Ca2 + איתות בתאים בתרבית מבודדים, ברקמות ללא פגע. באופן מסורתי, ניסויים אלו כרוך בשימוש פלורסנט Ca2 + אינדיקטורים, רציומטרי, רציומטרי שאינו צבענים כמו Fura2, Fluo3/4 או Rhod2, בין היתר 21,22,23. אינדיקטורים אלה נועדו להיות חדיר אל קרום התא, ואז הופכים לכוד בתוך תאים על-ידי המחשוף של קבוצת אסתר ויה esterases אנדוגני. איגוד של Ca2 + כדי האינדיקטורים זיקה גבוהה כתוצאה שינויים בזריחה תאים ורקמות היה מואר על ידי המתאים אורכי הגל של האור. השימוש תא חדיר Ca2 + מחוונים שיפור משמעותי ההבנה שלנו של Ca2 + איתות בתאים חיים, מותר רזולוציה מרחבית, כימות של אותות אלה היתה בלתי אפשרית על-ידי assaying Ca2 + אותות באמצעים אחרים, כגון אלקטרופיזיולוגיה. אולם, Ca מסורתי2 + מחוונים יש מספר מגבלות, כגון photobleaching המתרחשת על פני תקופות הקלטה מורחבת24. בעוד רשות אישורים חדשים2 + מחוון צבענים כמו Cal520/590 יש אות משופר מאוד רעש יחסי ואת היכולת לזהות המקומית Ca2 + אותות25, בעיות עם photobleaching ונעלמות דאגה כמה חוקרים 26,27,28. Photobleaching התלול גם מגבילה את ההגדלה, קצב רכישת התמונה, והגדילה רזולוציה שיכול לשמש עבור הקלטות, כפי כוח אובייקטיבי מוגברת שיעור גבוה יותר של ייבוא תמונות דורשים עוצמת האור עירור זה מגדילה את photobleaching.
מגבלות אלו של Ca מסורתי2 + מחוון צבע הם החמירו בעת הקלטת Ca2 + אותות באתרו, לדוגמה בעת ההקלטה תאיים Ca2 + אותות רקמות ללא פגע. בשל הבעיות שלעיל, יש ויזואליזציה של Ca2 + אותות בחיי עיר באמצעות תא חדיר Ca2 + אינדיקטורים הוגבל ההגדלה צריכת חשמל נמוכה, מופחת של לכידת תמונה, המגביל את היכולת של חוקרים כדי להקליט ו לכמת חנותם או במרחב מוגבל subcellular Ca2 + אותות. לפיכך, עבר קשה ללכוד, לנתח, להעריך את המורכבות יכולות של Ca2 + אותות, אשר יכול להיות חשובים בדורו של תגובות ביולוגיות הרצוי, כפי שתואר לעיל. ניתוח של Ca2 + אותות התאים באתרו בדרך כלל מסתמך על מדידות בעוצמה פשוטה אזורים שנבחרו עניין (ROI) בתוך שדה ראייה (FOV). הבחירה שרירותית המספר, הגודל והמיקום של ROIs, תלויים הגחמה של החוקרת, יכול קשות הטיה התוצאות המתקבלות. כמו גם הטיה הגלום עם ניתוח ROI, גישה זו מתעלמת הרבה החשובים איתות המידע הכלול של FOV, כמו דינמי Ca2 + אירועים בתוך שבחרת שרירותית רועי נבחרו לניתוח. יתר על כן, ניתוח של ROIs נכשלת לספק מידע אודות המאפיינים המרחביים של Ca2 + האותות שנצפו. לדוגמה, זה לא ייתכן שניתן להבחין בין עלייה Ca2 + הנובע הפצת Ca2 + גל ואני מאוד מקומי Ca2 + לשחרר את האירוע tabulations של Ca2 + אותות בתוך רועי.
כניסתו של Ca מקודדים גנטית2 + (GECIs) אינדיקטורים השתנה באופן קיצוני איך Ca2 + הדמיה יכול להיות שבוצעו ב באתרו29,30,31,32,33 . ישנם מספר יתרונות לשימוש GECIs על צבע. הוא אולי החשוב ביותר כי הביטוי של GECI יכול להתבצע באופן תא ספציפיים, אשר מפחית את זיהום הרקע הבלתי רצויים מתאי לא עניין. יתרון נוסף של GECIs מעל Ca מסורתי2 + מחוונים הוא photobleaching הזה מצטמצם (כמו זריחה, consequentially photobleaching מתרחשת רק כאשר תאים פעילים), לעומת דגימות צבע טעון, במיוחד בתיכון ההגדלה ואת שיעור גבוה של התמונה ללכוד34. לפיכך, הדמיה עם GECIs, כמו הסדרה GCaMP של חיישנים optogenetic, מעניקה חוקרים את היכולת להקליט לתדרך, שעברה לוקליזציה תת הסלולר Ca2 + מאותת בחיי עיר ולחקור Ca2 + איתות בתאים בתוך שלהם סביבות מקורי זה לא היה אפשרי בעבר. כדי ששחזור מידע מתוך הקלטות כאלו ברזולוציה גבוהה, נדרש ניתוח יכולות המתאים של Ca2 + האותות. יצוין כי בעוד GECIs יכולים להציע שלנקות כמה יתרונות, מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו כי ניתן לבצע בהצלחה Ca2 + הדמיה של אוכלוסיות גדולות של מחלקות שונות עצבית של נוירונים בו זמנית באמצעות קונבנציונלי Ca2 + אינדיקטורים לא מקודדים גנטית לתוך החיות35. גישה זו בשימוש אימונוהיסטוכימיה לאחר הוק לחשוף מספר מחלקות שונות של נוירונים שנשרפים בתדר גבוה ואינו מסונכרן, ונמנע את הפוטנציאל שינויים גנטיים החיה אולי הפרעת פיזיולוגיים התנהגות החוקר מבקש להבין35,36.
הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה להקל על ניתוח מפורט יותר ואותות כימות של Ca2 + נרשם מתאי באתרו באמצעות שילוב של מפת ייתכן (STM)-המבוסס על ניתוח וניתוח מבוסס חלקיק. הפרוטוקולים מתארים גם כמה שונה על ידי דפוסי Ca2 + איתות שנצפה בתא אחר אוכלוסיות באתרו ניתן לנתח אותם כראוי. להמחשה, השיטה יבחנו Ca2 + איתות אוכלוסיה מיוחדות של תאים במעי הדק, תאים ביניים של קחאל (ICC). ICC נמצאים תאים מיוחדים במערכת העיכול (GI) כי התערוכה דינמי תאיים Ca2 + איתות, כפי visualized באמצעות עכברים המבטאים GCaMPs37,38,39,40, 41,42. Ca2 + תופעות מעבר ב- ICC מקושרים הפעלה של Ca2 +-מופעל Cl– ערוצים (מקודד על-ידי Ano1) חשובים בוויסות של דעתנית של שריר חלק המעי תאים (SMCs)43, 44,45. לפיכך, המחקר של Ca2 + איתות ב- ICC הוא יסוד להבנת תנועתיות מעיים. המעי הדק מאתר ומציע דוגמה מצוינת לצורך ההדגמה, שכן ישנם שני סוגים של ICC מופרדים מבחינה אנטומית, ניתן לאבחן באופן עצמאי: אני) ICC ממוקמים באזור שבין שריר חלק מעגלי האורך והרוחב שכבות, המקיפים את מקלעת myenteric (ICC-שלי). תאים אלה משמשים כתאים קוצב לב ולהפיק את הפעילות החשמלית המכונה גלים איטיים46,47,48,49; ii) ICC נמצאים גם בקרב מקלעת עשיר המסופים של מוטורי לגלוקוז (מקלעת עמוק שרירים, ובכך DMP-ICC). תאים אלה לשמש כמתווכים של התגובות עצבית מנוע המעית37,39,40,50. ICC-מיי ICC-DMP נפרדים מורפולוגית, Ca2 + איתות והתנהגותם שונה באופן קיצוני להשלים את משימותיהם ספציפיים. ICC-מיי stellate בכושר, יוצרים רשת של תאים מחוברים באמצעות פער צמתי51,52. Ca2 + מאותת במניפסט ICC-מיי כמו קצר ומקומי, במרחב Ca2 + שחרור אירועים המתרחשים באתרים מרובים באופן אסינכרוני דרך הרשת ICC-מיי כמו מטמיעים בתוך FOV (עם תמונה עם יעד X 60)38. אותות אסינכרוני אלה מאורגנות חנותם לשנייה אחת אשכולות זה, כאשר ייערכו יחד, בסכום נטו 1 s הסלולר עלייה Ca2 +. אותות אלה מפיצות מתא לתא בתוך הרשת ICC, ולכן לארגן Ca2 + איתות, שנוצר מתוך אתרי משנה הסלולר, לתוך רקמות רחב Ca2 + גל. קיבוץ באשכולות הטמפורלי, סיכום של Ca2 + אותות ב- ICC-שלי יש כבר שנקרא Ca2 + אשכולות ארעי (CTCs)38. CTCs להתרחש בקצב אחיד (למשל די דומה ולקשרים תקופות דומות בין CTCs) 30 פעמים בדקה העכבר. לעומת זאת, ICC-DMP פלך בצורת התאים, חלקם עם תהליכים משניים, להפיץ בין SMCs לבין תהליכים עצב דליות. ואינם באופן עצמאי טופס51,רשת52. ICC-DMP טופס צמתי הפער עם SMCs, עם זאת, פונקציה בתוך זה syncytium גדול יותר, המכונה של syncytium SIP53. Ca2 + אותות להתרחש באתרים מרובים לאורך האורכים של תאים, אך אלה תופעות מעבר לא entrained או חנותם מקובצים באשכולות, כפי שנצפה ב- ICC-מיי37. Ca2 + אותות ב- ICC-DMP להתרחש בצורה סטוכסטי, עם עוצמות משתנה, משכים, המאפיינים המרחביים. הפרוטוקולים להלן, לפי הדוגמה של Ca2 + איתות ב- ICC-מיי, ICC-DMP, לתאר את שיטות לניתוח מורכב איתות בסוגים ספציפיים של תאים באתרו. אנחנו מנוצל מערכת p Cre-לקס inducible לבטא GCaMP6f באופן בלעדי ב- ICC, לאחר גרימת ההפעלה של Cre-Recombinase (Cre) מונע על ידי יזם ספציפי ICC (קיט).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

Ca2 + הדמיה של תאים בודדים או סוגים ספציפיים של תאים בתוך הרקמות שלמים לעיתים קרובות חושף דפוסים מורכבים של Ca2 + איתות. פעילות זו מחייבת ניתוח זהיר ומעמיק כימות ללכוד כמה שיותר מידע על האירועים כבסיס ככל האפשר. Spatial, זמני ופרמטרים בעוצמה מהותי Ca2 + אותות כגון תדירות, משך, הפצת, מהירות, משרעת עשוי לספק מידע ביולוגי הדרושים עבור איתות תאיים. ברזולוציה גבוהה Ca2 + הדמיה בדרך כלל תוצאות ברכש של קובצי נתונים גדולים שנמצאים זמן רב כדי תהליך מבחינת לתרגם את המידע ההדמיה לתוך מידע כמיתים, תהליך זה יכול להיות רגישים הטיה של טעות אנוש. ניתוח של Ca2 + אותות התאים באתרו בדרך כלל מסתמך על מדידות בעוצמה פשוטה אזורים שנבחרו באופן שרירותי של הריבית (ROI) בתוך שדה ראייה (FOV). גישה זו מתעלמת הרבה של המידע איתות חשוב FOV. לכן, על מנת למקסם את השחזור של מידע מתוך הקלטות כאלו ברזולוציה גבוהה שהושג עם Ca2 +צבע או optogenetic Ca2 + ניתוח יכולות הדמיה, המתאים של Ca2 + האותות נדרש. הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה יתאר כיצד ניתן להשיג כמות גדולה של נתונים Ca הקלטות2 + הדמיה כדי להקל על ניתוח מפורט יותר, כימות של Ca2 + אותות הקליט מתאי באמצעות שילוב של ייתכן מפה (STM)-המבוסס על ניתוח וניתוח מבוסס חלקיק. הפרוטוקולים מתארים גם כמה שונה על ידי דפוסי Ca2 + איתות שנצפה בתא אחר אוכלוסיות באתרו ניתן לנתח אותם כראוי. להמחשה, השיטה יבחנו Ca2 + איתות אוכלוסיה מיוחדות של תאים במעי הדק, תאים ביניים של קחאל (ICC), באמצעות GECIs.

באמצעות ערכת-Cre-GCaMP6F עכברים (איור 1), דינמי Ca2 + איתות התנהגויות של ICC במערכת העיכול יכולים לדימות באתרו. עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של אוכלוסיות ספציפיות של ICC בלי לזהם אותות אחרים אוכלוסיות של ICC בתוך רקמת אותו אבל במיש...

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca מקודדים גנטית2 + מחוונים (GECIs) השתנו באופן קיצוני איך באתרו Ca2 + הדמיה מבוצעת. כדי למקסם את שחזור נתונים מהקלטות אלו, נדרש ניתוח הולם של Ca2 + אותות. הפרוטוקולים נייר זה להקל על כימות של Ca2 + מאותת הקליט באתרו באמצעות מיפוי ייתכן וניתוח מבוסס חלקיק.

יישומים של מיפוי-עתיים, טכניקות ניתוח חלקיקים לכמת Ca תאיים2 + איתות בחיי עיר

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

היכולת לרכוש כמויות גדולות של נתונים מניסויים בהדמיית סידן השתפרה באופן דרסטי, במיוחד עם ניסויים בהדמיית רקמות. הפרוטוקולים שלנו מתארים טכניקות ניתוח מתאימות לכימות ולתיארו של ערכות נתונים אלה. הפרוטוקולים שלנו מייצרים מגוון של ערכים מרחביים, זמניים ועוצמתיים שהם מהותיים לאיתות סידן ברקמות שלמות וזה יכול ללכת לאיבוד בניתוח בסיסי יותר.שעה לפני ההדמיה להעביר מעי דק שנקטפו מעכבר עם תאים interstitial של Cajal או ICC המבטאים במיוחד מחוון סידן מקודד גנטית לשלב של מיקרוסקופ קונפוקל דיסק מסתובב. ומבלבלים ללא הרף את הרקמה עם 37 מעלות צלזיוס קרבס-רינגר ביקרבונט או פתרון KRB. באמצעות הגדלה של 60 עד 100 X, אתר את המקלעת המעי הגס בצורת סטלטה ICC או ICC-MY בין שכבות השריר החלקות המעגליות והאורך של המעי הדק.לאחר מכן אתר את מקלעת השרירים העמוקה בצורת ציר ICC או ICC-DMP במישור אחד בין שכבת השריר החלקה המעגלית לבין מקלעת תת-התערובת ושמור את הסרטים כערימת תמונות TIFF. ליצירת מפות מרחביות או STMs של פעילות הסידן ICC-DMP, פתחו את ערימת התמונות ב- ImageJ ולחצו על תמונה, הקלד ו- 32 סיביות כדי לשנות את איכות התמונה. ליצירת סריקת קו לחצו לחיצה ימנית על כלי בחירת הקו ובחרו קו מקולח.באמצעות לחיצות בודדות שמאלה לצייר קו לאורך הגישה האמצעית של ICC-DMP בודדים, לחיצה כפולה כאשר התא כולו כבר מיתאר. בחר תמונה, ערימות ו- Reslice. יופיע חלון מוקפץ.בחר סובב 90 מעלות כדי לכוון את סריקת הקו משמאל לימין כך שניתן יהיה לכייל אותה ולקרוא אותה כנגד הזמן בציר ה- x עם רווח על ציר ה- y ולחץ על אישור. המפה המרחבית תופיע. כדי למדוד במדויק את משרעת אותות הסידן מהמפה, בחר בחירה מלבנית וצייר אזור מעניין באזור STM המציג את האזור האחיד והפחות אינטנסיבי של פלואורסצנטיות. לחץ על נתח והיסטוגרמה כדי לקבל ערך ממוצע של העוצמה בתוך אזור העניין שנבחר ולחץ על ערוך, בחירה, בחר הכל כדי לבחור את STM כולו.לאחר מכן, לחצו על 'תהליך', 'מתמטיקה' ו'חילוק' והזינו את הערך הממוצע של העוצמה עם אזור STM שנבחר של עניין בתיבה הנפתחת. STM יהפוך שחור. תקן זאת על-ידי לחיצה על תמונה, כוונון, בהירות/ניגודיות ואוטואי אוטומטי בחלון המוקפץ.סריקת הקו כעת תהיה מכוילת עבור משרעת בעוצמת הפלואורסצנטיות המובעת כנוהורסצנטיות המחולקת על ידי אפס פלואורסצנטיות. STM יציג את מספר המסגרות בערימה TIFF על ציר x ואת מספר הפיקסלים המייצגים את אורך התא על ציר y. כדי לכמת את הנתונים הזמניים והמרחביים מאותות הסידן, לחץ על תמונה ומאפיינים והזן את הערכים המתאימים כדי לכייל באופן מלא את ה- STM למרחב ולזמן בחלון המוקפץ.כדי לנתח את אירועי הסידן הבודדים לחץ על קו ישר ולחץ וגרור על STM כדי לצייר קו אופקי ישר דרך מרכז אירוע סידן במקביל לציר x. לאחר מכן לחץ על נתח והתווית פרופיל. תופיע קופסה המציגה את פרופיל העלילה של אירוע הסידן.לניתוח מבוסס חלקיקים של נתוני איתות הסידן ICC-MY, פתח את קובץ הסרט ב- Volumetry ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור מסנן STK, להבדיל. לחץ שוב באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להזין ערך להבחנה. הקש Enter ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי ליזום את ההידול.כדי ליצור חלקיקים, השתמש בלחצן העכבר האמצעי כדי לגלול בסרט כדי לבחור מקטע מסגרת של 20 עד 40 הכולל תקופת התכה הדרגתית, ואחריו התרחשות של אשכול סידן ארעי ו- 20 עד 40 מסגרות הבאות מיד לאחר האשכול. כאשר כל המסגרות נבחרו לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון הסרט כדי לגשת למידע חלקיקי STK OPS Ramp DS ולחץ כדי להפעיל שגרת ניתוח חלקיקים המדרגה בהדרגה את הסף מהעוצמה המרבית לעוצמה המינימלית. כדי להבטיח ניתוח חלקיקים מוצלח, ודא שאתה משלב כמה שיותר טרום סידן צביר ארעי אי פעילות, וכמה שיותר לאחר סידן צביר ארעי אי פעילות כפי שאתה יכול.זה יעזור להגביר את יחס האות לרעש. הניתוח יוצג בצורה גרפית בחלון העלילה כמזימה של רעש ובחלון העקבות כשלושה עקבות צבע עם העקבות הירוקים המייצגים את מספר החלקיקים, העקבות האדומים המייצגים את גודל החלקיקים הממוצע, ואת העקבות הכחולים המייצגים את סף העוצמה המוחלטת. כדי לאזן את העלילה של רעש חלקיקים הקש H על המקלדת.לאחר מכן הקש על מקש הסוגר הימני כדי לעבור בין ערכות צבעים עד שהרקע יהיה לבן עם עקבות הצבע למעלה. הקש F על המקלדת פעם אחת כדי להעלות כלי מדידה. לאחר מכן הקש F פעם נוספת כדי לסמן קו אנכי יחיד בפס הגלילה של חלון העקבות בהתוויה בצומת שבה החלקות הצבעוניות מתחילות לעבור לצד ימין.בתוך חלון המעקבים השתמש בלחצן העכבר האמצעי כדי לגלול מנקודת הפריסה של המעקב האדום לקו האנכי הלבן המסומן. לאחר שרשמת את ממוצע ה- Y המוצג, לחץ שוב על לחצן העכבר האמצעי בתוך חלון המעקבים כדי לבטל את הבחירה בעקבות הכחולים. בחלון הסרט, לחץ על C כדי להעלות גלגל צבעים, ועל D כדי להתאים את הסף.חלקיקים תקפים יוצגו כעת באדום, ואלה הרוויים יהיו לבנים. השתמש בלחצן העכבר השמאלי כדי לגלול עד הסרת האזורים הלבנים ולהשתמש בלחצן העכבר האמצעי כדי להתאים את הערך המספרי הצהוב בגלגל הצבעים לערך הממוצע Y כדי להקצות הכל באדום כחלקיק ארעי סידן פעיל בנקודת הסף שנקבעה. לשמירת הנתונים כקובץ חלקיקים מבוסס קואורדינטות לחצו לחיצה ימנית כדי לגשת ל-STK 3D, שמרו אפס חלקיקים ולחצו שמאלה לשמירת הקובץ.כדי ליצור מפות חום של פעילות חלקיקים, פתח את קובץ החלקיקים שנשמר ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון הסרט כדי לגשת לחלקיקים STKops, דגל StatMap והזן הקצאות דגל לניתוח. לחץ כדי להחיל את הניתוח ומפת חום המציגה את כל החלקיקים לכל אורך ההקלטה עם צבעים שונים המייצגים את מופע האחוזים לאורך ההקלטה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לשמור את מפת החום כקובץ TIFF.לאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון הסרט כדי לגשת למדידת חלקיקים, סטטיסטיקת החלקיקים STK שווה והזן הקצאת דגל עבור הניתוח. סידרה של עקבות תיווצר בחלון המעקב. ניתוח STM מספק את היכולת לנטר ולתרשם את המאפיינים המרחביים של איתות סידן, כגון התפשטות מרחבית ומהירות התפשטות.מידע זה יכול להיות צבר כדי לספק תצוגה מלאה למדי של התנהגויות איתות סידן בתוך תאים בסביבות המקומיות שלהם. באמצעות ניתוח חלקיקים, מידע כמותי על איתות סידן יכול להיות מחושב על ידי מדידת אזור החלקיק ואת ספירת החלקיק, אשר יחד ניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את הטווחים המרחביים של הפעלת אות סידן בתוך שדה תצוגה מסוים. ניתוח חלקיקים מאפשר גם כימות מעמיק של איתות סידן תת-תאי באמצעות בדיקת המיקום והסתברויות הירי של אתרי ירי סידן.על ידי קצתית החלקיקים לדגלים שונים בהתבסס על המאפיינים הזמניים שלהם, ניתן למפות במדויק את החלקיקים היוזם. ושפע של נתונים קשים שנרכשו על מספר אתרי החניכה, גודל האתר בפיקסלים ומיקרומטרים, ההסתברות שכל אתר חניכה יורה פעם או מספר פעמים במהלך כל אשכול סידן ארעי, ואחוז אתרי הירי שיורים במהלך כל מחזור אשכול ארעי סידן ניתן להשיג. עקביות היא המפתח להצלחה בפרוטוקול זה.כל ערכות הנתונים וכל הסרטים חייבים להיות מטופלים בדיוק אותו הדבר כדי להבטיח תוצאות אמינות הניתנות לחזרה. הדבר נכון במיוחד כאשר עוסקים בקבצי חלקיקים. הפרוטוקולים שלנו מאפשרים אפיון עמוק של איתות סידן באתרו, ומגוון שיטות סטטיסטיות, כאשר נעשה בהן שימוש הולם, יכולות להעריך הבדלים בין מגוון פרמטרים מרחביים ותז זמניים.טכניקות ניתוח אלה בפרוטוקול שלנו אפשרו לחוקרים לשאול ולענות על שאלות שלא ניתן היה לענות עליהן בעבר הנוגעות לקצב המעיים, והפנמה במעיים, כמו גם לשליטה העצבית בדרכי השתן התחתונות.

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

טכניקות הדמיה Ca 2 + איתות זרע אנושי

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

ויזואליזציה של כלי דם Ca 2 + איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

מדידת תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; שינויים בזרע אנושי באמצעות ארבע טכניקות: fluorometry הקונבנציונלי, הפסיק fluorometry זרימה, cytometry זרימה והדמיה תא יחיד

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...