Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Finanziamento è stato fornito da NIDDK, via P01 DK41315.

Tutti gli animali utilizzati e i protocolli effettuati in questo studio erano in conformità con l'istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di cura presso la University of Nevada, Reno e uso animale istituzionale.
1. generazione di topi KitGCaMP6f
<ol><li>Attraversare Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f topi) e c-Kit+ / Cre-ERT2 (Kit-Cre topi) per generare animali di GCaMP6f specifici ICC di es...

CA2 + imaging di tipi specifici di cellule all'interno dei tessuti intatti o all'interno di reti di cellule spesso rivela complessi pattern di transitori di Ca2 + . Questa attività richiede un'attenta e approfondite analisi e quantificazione di catturare quante più informazioni possibili sugli eventi sottostanti e la cinetica di questi eventi. STM e analisi PTCL offrono l'opportunità di massimizzare la quantità di dati quantitativi risultanti dalle registrazioni di questo tipo.
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CA2 + è un messaggero intracellulare onnipresente che controlla una vasta gamma di processi cellulari, come muscolo contrazione1,2, metabolismo3, cella proliferazione3,4, 5, stimolazione del rilascio di neurotrasmettitore a nervo terminali6,7e l'attivazione della trascrizione fattori nel nucleo. 7 intracellulare Ca2 + segnali spesso assumere la forma di aumenti transitori in citosolico Ca2 +, e questi possono essere spontanee o derivano dalla stimolazione agonista a seconda il tipo di cella8. Spaziale, temporale e i parametri di intensità intrinseci di Ca2 + segnali come frequenza, durata, propagazione, velocità e ampiezza possono fornire le informazioni biologiche necessarie per segnalazione intracellulare5, 7 , 9. citoplasmatica Ca2 + segnali possono derivare dall'afflusso di Ca2 + dallo spazio extracellulare o tramite rilascio di Ca2 + dal reticolo endoplasmico (ER) tramite canali del Ca2 + rilascio come recettori della rianodina (RyRs) e recettori di inositolo-tri-fosfato (IP3Rs)10. RyRs e IP3Rs può contribuire alla generazione di Ca2 + segnali e l'apertura concertata di questi canali, che combinato con vari Ca2 + afflusso meccanismi può causare una miriade di Ca2 + modelli di segnalazione che sono modellati dai numeri e aprire la probabilità di canali del Ca2 + afflusso, il profilo di espressione di canali di rilascio di Ca2 + , la prossimità fra afflusso di Ca2 + e canali di rilascio ed espressione e la distribuzione di Ca2 + proteine della ricaptazione ed estrusione. CA2 + segnali possono assumere la forma di uniforme, di lunga durata, oscillazioni globali ad alta intensità che può durare per diversi secondi o addirittura minuti, moltiplicazione intracellulare e intercellulare Ca2 + onde che possono attraversare distanze intracellulare oltre 100 µm10,11,12,13,14,15,16, o più brevi, spazialmente localizzati eventi come Ca2 + scintille e Ca2 + sbuffi che si verificano su decine di millisecondi scale cronologiche e sviluppa meno di 5 µm17,18,19,20.
La microscopia fluorescente è stata utilizzata ampiamente per monitorare Ca2 + segnalazione in cellule isolate e coltivate e nei tessuti intatti. Tradizionalmente, questi esperimenti prevedevano l'utilizzo di indicatori fluorescenti per Ca2 + , raziometrici e non-raziometrici coloranti quali Fura2, Fluo3/4 o Rhod2, tra gli altri 21,22,23. Questi indicatori sono stati progettati per essere permeabile alle membrane delle cellule e quindi diventare intrappolati nelle cellule tramite la fenditura di un gruppo di estere tramite esterasi endogene. Associazione di Ca2 + per gli indicatori di alta affinità causato cambiamenti in fluorescenza quando le cellule e tessuti sono stati illuminati da adeguate lunghezze d'onda della luce. L'uso di cellulare permeabile Ca2 + indicatori notevolmente migliorato la nostra comprensione di Ca2 + segnalazione in cellule viventi e consentito la risoluzione spaziale e la quantificazione di questi segnali che non era possibile analizzando Ca2 + segnali attraverso altri mezzi, ad esempio di elettrofisiologia. Tuttavia, Ca2 + gli indicatori tradizionali presentano alcune limitazioni, ad esempio photobleaching che si verifica nel corso di periodi di registrazione estesa24. Mentre più recente2 + indicatore di Ca coloranti come Cal520/590 hanno notevolmente migliorato segnale ai rapporti di rumore e la capacità di rilevare locale Ca2 + segnali25, problemi con photobleaching possono ancora rimangono una preoccupazione per alcuni ricercatori 26,27,28. Precipitosa photobleaching limita anche l'ingrandimento, tasso di acquisizione dell'immagine, e la risoluzione che può essere utilizzata per le registrazioni, come richiedono maggiore potenza oggettiva e più alti tassi di acquisizione immagine aumentata intensità di luce di eccitazione che aumenta photobleaching.
Queste limitazioni di tradizionale Ca2 + indicatore coloranti sono esacerbati durante la registrazione di Ca2 + segnali in situ, ad esempio quando registrazione intracellulare di Ca2 + segnali dai tessuti intatti. A causa di problemi di cui sopra, visualizzazione di Ca2 + segnali in situ tramite cellulare permeabile Ca2 + indicatori è stato limitato a basso ingrandimento e ridotto i tassi di cattura delle immagini, vincolando la capacità degli investigatori per registrare e quantificare il Ca2 + segnali subcellulari temporalmente o spazialmente limitati. Così, è stato difficile catturare, analizzare e apprezzare la complessità spaziale e temporale di Ca2 + segnali, che può essere importante nella generazione di risposte biologiche desiderate, come indicato in precedenza. Analisi di Ca2 + segnali dalle cellule in situ in genere si basa su misure di intensità semplice da determinate regioni di interesse (ROI) all'interno di un campo visivo (FOV). Scelta arbitraria del numero, dimensione e posizione di ROIs, dipendente per il capriccio del ricercatore, gravemente può influenzare i risultati ottenuti. Così come intrinseca parzialità con analisi del ROI, questo approccio ignora gran parte delle importanti informazioni contenute nel FOV, come Ca2 + gli eventi dinamici all'interno di un arbitrariamente scelto di segnalazione ROI sono selezionati per l'analisi. Inoltre, analisi di ROIs non riesce a fornire informazioni circa le caratteristiche spaziali del Ca2 + segnali osservati. Ad esempio, potrebbe non essere possibile distinguere tra un aumento del Ca2 + risultanti da una moltiplicazione Ca2 + onda e altamente localizzata Ca2 + rilascio evento da tabulazioni di Ca2 + segnali all'interno di un ROI.
L'avvento di codificato geneticamente Ca2 + indicatori (GECIs) ha cambiato radicalmente come Ca2 + formazione immagine possa essere eseguite in situ29,30,31,32,33 . Ci sono molti vantaggi di utilizzare GECIs sopra coloranti. La più importante è forse che espressione di GECI possa essere eseguite in modo specifico delle cellule, che riduce la contaminazione di fondo indesiderati dalle cellule non di interesse. Un altro vantaggio di GECIs in Ca2 + gli indicatori tradizionali è che photobleaching è ridotta (come fluorescenza e conseguenza photobleaching si verifica solo quando le cellule sono attive), rispetto agli esemplari di tintura-caricato, particolarmente ad alta ingrandimento e alti tassi di immagine catturano34. Così, con GECIs, di imaging, come la serie GCaMP di sensori optogenetica, offre gli investigatori la capacità di registrare brevi, localizzato sub-cellulare Ca2 + segnali in situ e indagare Ca2 + segnalazione in cellule all'interno di loro ambienti nativi che non stato possibili in precedenza. Per massimizzare il recupero di informazioni da tali registrazioni ad alta risoluzione, opportune analisi spaziale e temporale dei segnali Ca2 + è necessario. Dovrebbe essere notato che mentre GECIs può offrire che alcuni vantaggi evidenti, recenti studi hanno rivelato che il Ca2 + formazione immagine può essere eseguita con successo da grandi popolazioni di neurochemical diverse classi di neuroni simultaneamente utilizzando convenzionali CA2 + indicatori che non sono geneticamente codificati nel animale35. Questo approccio utilizzato post-hoc immunohistochemistry per rivelare più diverse classi di neuroni sparando ad alta frequenza in modalità burst, sincronizzato ed evitato il potenziale che le modificazioni genetiche dell'animale possono interferire con il fisiologico comportamento l'investigatore cerca di comprendere35,36.
Quantificazione di Ca2 + segnali registrati dalle cellule in situ utilizzando una combinazione di spatiotemporal mappa (STM) e i protocolli illustrati in questo articolo facilitano l'analisi più completa-base analisi e analisi basate su particelle. I protocolli descrivono anche come diversi modelli di Ca2 + segnalazione osservata in cellule diverse popolazioni in situ possono essere analizzati in modo appropriato. Per l'illustrazione, esaminerà il metodo Ca2 + segnalazione in una popolazione specializzata di cellule nel piccolo intestino, cellule interstiziali di Cajal (ICC). ICC sono cellule specializzate nel tratto gastrointestinale (GI) che esibiscono dinamico intracellulare Ca2 + segnalazione, come visualizzato usando topi che esprimono GCaMPs37,38,39,40, 41,42. CA2 + transitori in ICC sono legati all'attivazione di Ca2 +-attivato Cl– canali (codificati dal Ano1) che sono importanti nel regolare l'eccitabilità della muscolatura liscia intestinale cellule (SMCs)43, 44,45. Così, lo studio di Ca2 + segnalazione in ICC è fondamentale per comprendere la motilità intestinale. Il piccolo intestino murino offre un eccellente esempio per questa dimostrazione, come ci sono due classi di ICC che anatomicamente sono separate e possono essere visualizzate in modo indipendente: io) ICC si trovano nella zona tra la muscolatura liscia circolare e longitudinale strati, che circonda il plesso mioenterico (ICC-mio). Queste cellule fungono da cellule pacemaker e generano l'attività elettrica conosciuta come onde lente46,47,48,49; II) ICC si trovano tra un plesso ricco nei terminali dei motoneuroni (plesso muscolare profondo, così ICC-DMP). Queste cellule fungono da mediatori di risposte a enterico neurotrasmissione motore37,39,40,50. ICC-MY e ICC-DMP sono morfologicamente distinte, e i loro comportamenti segnalazione Ca2 + differiscono radicalmente per svolgere i loro compiti specifici. ICC-MY sono stellari in forma e formano una rete di cellule interconnesse tramite gap junctions51,52. CA2 + segnali nel ICC-MY manifesto come brevi e spazialmente localizzati Ca2 + rilascio eventi che si verificano in più siti in modo asincrono attraverso la rete ICC-MY come visualizzati all'interno di un FOV (imaged con un obiettivo 60x)38. Questi segnali asincroni sono organizzati temporaneamente in 1 secondo cluster che, quando tabulati insieme, ammontano ad un netto aumento di 1 s cellulare in Ca2 +. Questi segnali si propagano cellula--cellula all'interno della rete ICC e pertanto organizzano Ca2 + segnalazione, generati da siti sub-cellulare, in un tessuto largo Ca2 + dell'onda. Clustering temporale e la sommatoria di Ca2 + segnali ICC-MY è stato chiamato Ca2 + cluster transitoria (CTCs)38. CTCs verificarsi ritmicamente (ad es. abbastanza simili durate e periodi simili tra CTCs) 30 volte al minuto nel topo. Al contrario, ICC-DMP sono cellule fusiformi, alcuni con processi secondari, che distribuiscono tra SMC e processi del nervo varicose e non in modo indipendente formano una rete51,52. Giunzioni di gap di forma di ICC-DMP con paesi del Mediterraneo meridionale, tuttavia e funzione all'interno di questo maggiore del sincizio, conosciuto come il SIP del sincizio53. CA2 + segnali si verificano in più siti lungo le lunghezze delle cellule, ma questi transitori non sono trascinati o raggruppati temporaneamente, come osservato in ICC-MY37. CA2 + segnali in ICC-DMP si verificano in modo stocastico, con intensità variabile, durate e caratteristiche spaziali. I protocolli di seguito, utilizzando l'esempio di Ca2 + segnalazione in ICC-MY e ICC-DMP, descrivono le tecniche per analizzare segnali complessi in tipi specifici di cellule in situ. Abbiamo utilizzato il sistema inducibile di Cre-Lox p per esprimere GCaMP6f esclusivamente in ICC, dopo che inducono l'attivazione di Cre-Recombinase (Cre) guidato da un promotore di specifiche ICC (Kit).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

CA2 + imaging di cellule isolate o tipi specifici di cellule all'interno dei tessuti intatti spesso rivela modelli complessi di segnalazione di Ca2 + . Questa attività richiede un'attenta e approfondite analisi e quantificazione di catturare quante più informazioni possibili sugli eventi sottostanti. Spaziale, temporale e i parametri di intensità intrinseci di Ca2 + segnali quali frequenza, durata, propagazione, velocità e ampiezza possono fornire qualche informazione biologiche necessarie per la segnalazione intracellulare. Alta risoluzione Ca2 + imaging in genere comporta la successiva acquisizione di file di dati di grandi dimensioni che richiedono molto tempo al processo in termini di tradurre le informazioni di imaging in dati quantificabili e questo processo può essere suscettibile di pregiudizi e di errore umano. Analisi di Ca2 + segnali dalle cellule in situ in genere si basa su misure di intensità semplice da arbitrariamente selezionate regioni di interesse (ROI) all'interno di un campo visivo (FOV). Questo approccio ignora gran parte le informazioni di segnalazione importante contenute nel FOV. Quindi, al fine di massimizzare il recupero di informazioni da tali registrazioni ad alta risoluzione ottenute con Ca2 +coloranti o optogenetica Ca2 + imaging, appropriata analisi spaziale e temporale dei segnali Ca2 + è necessario. I protocolli illustrati in questo articolo descriverò come un volume elevato di dati possa essere ottenuto da Ca2 + imaging registrazioni per facilitare la più completa analisi e quantificazione del Ca2 + segnali registrati dalle celle usando una combinazione di Mappa spazio-temporale (STM)-basato su analisi e analisi basate su particelle. I protocolli descrivono anche come diversi modelli di Ca2 + segnalazione osservata in cellule diverse popolazioni in situ possono essere analizzati in modo appropriato. Per l'illustrazione, esaminerà il metodo Ca2 + segnalazione in una popolazione specializzata di cellule nel piccolo intestino, cellule interstiziali di Cajal (ICC), utilizzando GECIs.

Utilizzando topi Kit-Cre-GCaMP6F (Figura 1), dinamica Ca2 + segnalazione di comportamenti di ICC nel tratto gastrointestinale possono essere imaged in situ. Con la microscopia confocale, immagini ad alta risoluzione di specifiche popolazioni di ICC possono essere acquisite senza contaminare i segnali provenienti da altre popolazioni di ICC all'interno del tessuto stesso, ma in anatomicamente distinti piani di messa a fuoco (Fig...

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Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Indicatori di codificato geneticamente Ca2 + (GECIs) hanno cambiato radicalmente come in situ Ca2 + imaging viene eseguita. Per massimizzare il recupero dei dati da tali registrazioni, analisi appropriata di Ca2 + segnali è necessaria. I protocolli in questa carta facilitano la quantificazione di Ca2 + segnali registrati in situ utilizzando spatiotemporal mappatura e analisi delle particelle.

Applicazioni di mappatura spazio-temporale e tecniche di analisi delle particelle per quantificare la segnalazione intracellulare Ca2 + In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

La capacità di acquisire grandi quantità di dati da esperimenti di imaging del calcio è drasticamente migliorata, specialmente con gli esperimenti di imaging tissutale. I nostri protocolli descrivono tecniche di analisi appropriate per quantificare e descrivere questi set di dati. I nostri protocolli generano una gamma di valori spaziali, temporali e di intensità che sono intrinseci alla segnalazione del calcio in interi tessuti e questo può essere perso in analisi più rudimentali.Un'ora prima del trasferimento dell'imaging un intestino tenue raccolto da un topo con cellule interstiziali di Cajal o ICC che esprimono specificamente un indicatore di calcio geneticamente codificato allo stadio di un microscopio confocale del disco rotante. E perfonde continuamente il tessuto con bicarbonato Di 37 gradi Celsius Krebs-Ringer o soluzione KRB. Utilizzando un ingrandimento da 60 a 100 X individuare il plesso myenterico a forma stellata ICC o ICC-MY tra gli strati muscolari lisci circolari e longitudinali dell'intestino tenue.Quindi individuare il plesso muscolare profondo a forma di mandrino ICC o ICC-DMP in un unico piano tra lo strato muscolare liscio circolare e il plesso submucoso e salvare i film come una pila di immagini TIFF. Per creare mappe spaziotemporali o MTM dell'attività calcio ICC-DMP, aprire lo stack di immagini in ImageJ e fare clic su Immagine, Tipo e a 32 bit per modificare la qualità dell'immagine. Per creare un'analisi delle linee, fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento di selezione della linea e selezionare la linea segmentata.Utilizzando i singoli clic a sinistra disegnare una linea lungo l'accesso centrale di un singolo ICC-DMP, facendo doppio clic quando l'intera cella è stata delineata. Selezionate Immagine (Image), Pile (Stacks) e Rislice (Reslice). Verrà visualizzata una finestra popup.Selezionare Ruota di 90 gradi per orientare la scansione della linea da sinistra a destra in modo che possa essere calibrata e letta rispetto al tempo sull'asse x con spazio sull'asse y e fare clic su OK. Apparirà la mappa spatiotemporale. Per misurare con precisione l'ampiezza dei segnali di calcio dalla mappa, selezionare la selezione rettangolare e disegnare una regione di interesse intorno all'area all'interno dell'STM che mostra l'area di fluorescenza più uniforme e meno intensa. Fate clic su Analizza (Analyze) e Istogramma (Istogram) per ottenere un valore medio dell'intensità all'interno dell'area di interesse selezionata e fate clic su Modifica (Edit), Selezione (Selection), Seleziona tutto (Select All) per selezionare l'intero STM.Quindi, fate clic su Processo (Process), Matematica (Math) e Dividi (Divide) e immettete il valore medio dell'intensità con l'area STM selezionata di interesse nella casella popup. L'STM diventerà nero. Correggere questa impostazione facendo clic su Immagine, Regola, Luminosità/Contrasto e Automatico nella finestra popup.La scansione di linea sarà ora calibrata per l'ampiezza con l'intensità della fluorescenza espressa come fluorescenza divisa per la fluorescenza zero. L'STM mostrerà il numero di fotogrammi nello stack TIFF sull'asse x e il numero di pixel che rappresentano la lunghezza della cella sull'asse y. Per quantificare i dati temporali e spaziali dai segnali calcio, fare clic su Immagine e proprietà e immettere i valori appropriati per calibrare completamente l'STM per spazio e tempo nella finestra popup.Per analizzare i singoli eventi calcio, fate clic su Linea retta (Straight Line) e fate clic e trascinate l'STM per disegnare una linea orizzontale retta attraverso il centro di un evento calcio parallelo all'asse x. Quindi fate clic su Analizza (Analyze) e traccia profilo (Plot Profile). Apparirà una scatola che mostra il profilo della trama dell'evento calcio.Per l'analisi basata su particelle dei dati di segnalazione del calcio ICC-MY, aprite il file filmato in Volumetry e fate clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Filtro STK (STK Filter), Differenzia (Differentiate). Fare di nuovo clic con il pulsante destro del mouse per immettere un valore da differenziare. Premere INVIO e fare clic con il pulsante sinistro del mouse per avviare la differenziazione.Per creare particelle, usate il pulsante centrale del mouse per scorrere il filmato per selezionare una sezione di fotogrammi da 20 a 40 che include un periodo quiescente, seguita dall'occorrenza di un cluster transitorio di calcio e da 20 a 40 fotogrammi che seguono subito dopo il cluster. Quando tutti i fotogrammi sono stati selezionati, fate clic con il pulsante destro del mouse nella finestra del filmato per accedere alle informazioni sulle particelle STK OPS Ramp DS e fate clic per eseguire una routine di analisi delle particelle che aumenta progressivamente la soglia dall'intensità massima a quella minima. Per garantire un'analisi delle particelle di successo, assicurarsi di incorporare quanta più non attività dell'ammasso transitorio pre-calcio e quanta più non attività dell'ammasso transitorio post-calcio possibile.Ciò contribuirà ad aumentare il rapporto segnale/rumore. L'analisi verrà visualizzata graficamente nella finestra del grafico come grafico del rumore e nella finestra delle tracce come tre tracce di colore con la traccia verde che rappresenta il numero di particelle, la traccia rossa che rappresenta la dimensione media delle particelle e la traccia blu che rappresenta la soglia di intensità assoluta. Per l'istogramma bilanciare la trama della pressione del rumore delle particelle H sulla tastiera.Quindi premere il tasto della parentesi destra per scorrere le combinazioni di colori fino a quando lo sfondo non è bianco con le tracce di colore in alto. Premere F sulla tastiera una volta per creare uno strumento di misurazione. Quindi premere F una seconda volta per contrassegnare una singola linea verticale nella barra di scorrimento della finestra delle tracce sul tracciato all'intersezione in cui i grafici colorati iniziano a spostarsi sul lato destro.All'interno della finestra delle tracce utilizzare il pulsante centrale del mouse per scorrere dal punto di flessione della traccia rossa alla linea verticale bianca contrassegnata. Dopo aver annotato la media Y visualizzata, fare di nuovo clic sul pulsante centrale del mouse all'interno della finestra delle tracce per deselezionare la traccia blu. Nella finestra del filmato fare clic su C per far salire una ruota dei colori e su D per regolare la soglia.Le particelle valide saranno ora mostrate in rosso e quelle sature saranno bianche. Utilizzare il pulsante sinistro del mouse per scorrere fino a rimuovere le aree bianche e utilizzare il pulsante centrale del mouse per regolare il valore numerico giallo nella rotellina di colore sul valore medio Y per assegnare tutto in rosso come particella transitoria di calcio attivo nel punto di soglia determinato. Per salvare i dati come file di particelle basato su coordinate, fate clic con il pulsante destro del mouse per accedere a STK 3D, salvate la particella zero e fate clic con il pulsante sinistro del mouse per salvare il file.Per creare mappe di calore dell'attività delle particelle, aprite il file di particelle salvato e fate clic con il pulsante destro del mouse nella finestra del filmato per accedere alle particelle STKops, StatMap Flag e immettere le assegnazioni dei flag da analizzare. Fare clic per applicare l'analisi e una mappa termica che mostri le particelle totali per l'intera lunghezza della registrazione con colori diversi che rappresentano l'occorrenza percentuale durante la registrazione. Fare clic con il pulsante destro del mouse per salvare la mappa termica come file TIFF.Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra del filmato per accedere alla misura delle particelle, le statistiche delle particelle STK sono uguali e immettere un'assegnazione di contrassegno per l'analisi. Una serie di tracce verrà generata nella finestra di traccia. L'analisi STM fornisce la capacità di monitorare e registrare le caratteristiche spaziali della segnalazione del calcio, come la diffusione spaziale e la velocità di propagazione.Queste informazioni possono essere ammassate per fornire una visione piuttosto completa dei comportamenti di segnalazione del calcio all'interno delle cellule nei loro ambienti nativi. Utilizzando l'analisi delle particelle, le informazioni quantitative sulla segnalazione del calcio possono essere calcolate misurando l'area delle particelle e il conteggio delle particelle, che insieme possono essere utilizzate per determinare gli intervalli spaziali di attivazione del segnale di calcio all'interno di un campo visivo specificato. L'analisi delle particelle consente anche la quantificazione approfondita della segnalazione subcellulare del calcio attraverso l'esame della posizione e delle probabilità di attivazione dei siti di cottura del calcio.Allocando le particelle in diverse bandiere in base alle loro caratteristiche temporali, le particelle di avvio possono essere mappate con precisione. E una ricchezza di dati dati rigidi acquisiti sul numero di siti di iniziazione, le dimensioni del sito in pixel e micrometri, la probabilità che ogni sito di iniziazione ucciva una o più volte durante ogni ammasso transitorio di calcio e la percentuale di siti di cottura che si sparano durante ogni ciclo del cluster transitorio di calcio. La coerenza è la chiave del successo di questo protocollo.Tutti i set di dati e tutti i filmati devono essere trattati esattamente allo stesso modo per garantire risultati affidabili e ripetibili. Questo è particolarmente vero quando si ha a che fare con file di particelle. I nostri protocolli consentono una caratterizzazione profonda della segnalazione del calcio in situ e una serie di metodi statistici, se usati in modo appropriato, possono valutare le differenze tra una gamma di parametri spaziali e temporali.Queste tecniche di analisi nel nostro protocollo hanno permesso ai ricercatori di porre e rispondere a domande precedentemente non indirizzabili relative al pacemaking intestinale e all'innervazione intestinale, nonché al controllo neuronale del tratto urinario inferiore.

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

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Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

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Biologia

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