Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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P01 DK41315 を介して、NIDDK によって提供された資金。

使用されるすべての動物と本研究で実施プロトコル ケアと実験動物の使用のための健康ガイドの国立機関に従ってだった。すべてのプロシージャは、制度上の動物の使用とネバダ大学リノ校でケア委員会によって承認されました。
1 KitGCaMP6f マウスの発生
<ol><li>Ai95 クロス (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f マウス) と c キット+/Cre ERT2 (キット Cre マウス) ICC 特定 GCaMP6f 表現する...

Ca2 +イメージング細胞そのまま組織内または細胞のネットワーク内の特定の種類の多くの場合では、Ca2 +過渡現象の複雑なパターンを明らかにします。この活動は、慎重かつ詳細な分析と定量化可能な基になるイベントとこれらのイベントの速度論について多くの情報をキャプチャするために必要です。STM および白金分析この種類の録音から得られた量的データの量を最大化?...

Ca2 +は筋収縮1,2, 代謝3、細胞増殖3,4,などの細胞プロセスの広い範囲を制御するユビキタス細胞内メッセンジャー5、神経端末6、7、伝達物質の放出の刺激および転写活性化の核要因します。7細胞内 Ca2 +信号多くのゾル性細胞質 Ca2 +、一時的な標高の形をとるこれらが自発的にしたり、セル型8によってアゴニスト刺激から生じる。空間、時間の強度パラメーター Ca2 +信号振幅、速度、伝搬時間周波数などに本質的な細胞内シグナル伝達5,に必要な生物学的情報を提供できます。7,9. 細胞質 Ca2 +シグナルは、Ca2 +放出チャネル リアノジン受容体などを介して Ca2 +小胞体 (ER) からの Ca2 +放出もしくは細胞外からの流入と起因できます。(RyRs) とイノシトール 3 リン酸受容体 (IP3Rs)10。RyRs と IP3Rs 両方に貢献するかもしれない Ca2 +信号の生成と無数の Ca2 +シグナル パターンで様々 な Ca2 +流入機構と組み合わせてこれらのチャネルの協調開始可能性があります。数字で形作られているし、確率の Ca2 +流入チャネル、Ca2 +放出チャネルの Ca2 +流入と放出チャネルと Ca2 の分布と発現の間の近さの表現のプロフィールを開く+再取り込みと押し出しの蛋白質。Ca2 +シグナルは、フォーム、制服の長期的な続くことがあるいくつかの数秒あるいは数分、細胞内および細胞間 Ca2 +波細胞内の距離を越える場合があります。 を伝播する高強度グローバル振動をかかることがあります。以上 100 μ m10、11,12,13,14,15,16、または Ca 2 +などのより簡単な空間的にローカライズされたイベント火花および Ca2 +パフが数十ミリ秒のタイム スケールで発生し、広がる未満 5 μ m17,18,19,20。
蛍光顕微鏡は、Ca2 +シグナルの分離および培養細胞および組織内そのままを監視するため広く使用されています。伝統的に、これらの実験に関与蛍光 Ca2 +インジケーター、レシオ メトリックの使用と非レシオ メトリック染料 Fura2 や Fluo3/4 Rhod2 など他の人の間で21,22,23。これらの指標は、細胞膜の透過性と細胞に閉じ込めてなる内因性エステラーゼを介してエステル基の開裂によって設計されていた。Ca2 +親和性の高い指標にバインドは、細胞や組織は、適切な波長の光によって照らされたとき蛍光性の変更を発生します。細胞透過性の Ca2 +インジケーターの使用が Ca2 +細胞内シグナル伝達と空間分解能および Ca2 +シグナルの試金によって不可能であったこれらの信号の定量化の私達の理解を大幅に強化電気生理学などの他の手段。しかし、伝統的な Ca2 +インジケーターは長時間録画期間24で発生する退色など、いくつかの制限にあります。一方、新しい Ca2 +インジケーターは染料 Cal520/590 大幅改良された信号ノイズ比、ローカル Ca 2 +シグナル25を検出する能力のようです、退色の問題残っていることがいくつかの捜査官の懸念26,,2728。急激な退色も倍率、画像取り込みの速度を制限し、客観的電力の増加と画像の取得率が高い必要がありますように録音のため使用できる解像度は、励起光強度を増加します。退色が増加します。
伝統的な Ca2 +インジケーター染料が悪化して Ca2 +シグナルの現場を記録するときの制限、たとえばとき録音細胞内 Ca2 +からの信号はそのまま組織。上記の問題のため細胞透過性 Ca2 +インジケーターを使用してその場で Ca2 +シグナルの可視化は低倍率に限られており、イメージ キャプチャ、記録する捜査官の能力の制約の割引と時間的または空間的に制限された細胞内 Ca2 +シグナルを定量化します。したがって、キャプチャ、分析、および上記のように目的の生体反応の生成に重要にすることができます Ca2 +シグナルの時空の複雑さを味わうことは困難だった。原細胞からの Ca2 +シグナルの解析は、通常、利益 (率 ROI) 視野 (FOV) 内の選択された領域から簡単な強度の測定に依存します。数、サイズおよび Roi、研究者の気まぐれに依存しての位置の任意選択することができます結果をバイアスして深刻な。ROI 分析で固有バイアスだけでなく、このアプローチは多くの重要な無視信号任意選ばれた内の動的な Ca2 +イベントとして、視野に含まれる情報投資収益率が分析のために選択されています。さらに、Roi の分析は、観測された Ca2 +信号の空間特性に関する情報を提供するために失敗します。たとえば、可能性があります可能になる Ca2 +伝ぱ挙動に起因で上昇を区別する Ca2 +波と局所高 Ca2 +リリース ROI 内の Ca2 +シグナルの一覧表からのイベント。
遺伝子にエンコードされた Ca2 +インジケーター (GECIs) の出現は Ca2 +イメージングが行われたその場で29,30,31,32,33 をすることができますどのように根本的に変わった.染料を GECIs を使用するいくつかの利点があります。最も重要なおそらくは GECI の式をセルの特定方法は、関心のない細胞から不要なバック グラウンド汚染を削減で実行できること。伝統的な Ca2 +インジケーター上 GECIs のもう一つの利点は、退色を低減 (蛍光と退色はのみ発生するとセルがアクティブなとき)、色素ロード標本、特に高と比較して倍率およびイメージの高い率は、34をキャプチャします。したがって、ローカライズされた細胞内 Ca2 +信号をその場で簡単な GECIs、光センサー GCaMP シリーズ affords 捜査能力を記録するなど、イメージングと調査 Ca2 +細胞内シグナル伝達の以前可能なされていないネイティブ環境。このような高解像度の記録からの情報の回復を最大限に Ca2 +シグナルの時空の適切な分析が必要です。GECIs 明確な利点を提供していますが、最近の研究が明らかにしたこと同時に従来による神経細胞の神経化学的クラスの大規模な集団から Ca2 +イメージングを正常に実行できることに注意してください。遺伝子組み換え動物35にエンコードされていない Ca2 +インジケーター。このアプローチのニューロンの発火の同期バースト高周波の複数の異なったクラスを明らかにする事後的免疫組織化学を使用し、動物に遺伝の修正は生理と干渉している可能性があります可能性を避ける行動調査官35,36を理解するように努めます。
本稿に記載されているプロトコルの詳細な分析を容易にし、Ca2 +の定量信号の時空間マップ (STM) の組み合わせを使用してその場で細胞から記録・解析と粒子ベースの分析に基づきます。プロトコルは、Ca2 +異なる細胞集団の場を適切に分析できる観測信号のどのように異なるパターンもについて説明します。たとえば、メソッドを検討する Ca2 +細胞、小腸における間質細胞のカハール (ICC) の専門にされた人口におけるシグナル伝達します。ICC は動的細胞内 Ca2 +シグナル伝達、GCaMPs37,38,39,40,を発現するマウスを使用して可視化を示す胃腸 (GI) に特殊化した細胞 41,42。Ca2 +過渡電流 ICC での Ca2 +活性化にリンクされて-腸管平滑筋細胞 (SMCs)43の興奮性の調節に重要なチャネル ( Ano1でエンコード) Cl-を活性化 44,45。したがって、Ca2 +シグナル ICC の研究は腸の運動を理解します。ICC 解剖学的分離され独立して視覚化することができる 2 つのクラスがあるので、マウスの小腸はこのデモのための優秀な例を提供しています: 私) ICC に円形と縦の滑らかな筋肉の間の領域であります。筋間神経叢を取り巻く層 (ICC マイ)。これらの細胞のペース メーカー細胞として機能し、徐波46,47,48,49; として知られている電気的活動を生成ii) ICC が運動ニューロン (神経叢深い筋肉、従って ICC DMP) のターミナルの豊富な神経叢の中でもあります。これらの細胞は腸運動神経伝達37,39,40,50レスポンスの仲介者として機能します。ICC-MY および ICC DMP は形態的に異なる Ca2 +シグナル伝達行動は、特定のタスクを達成するために根本的に異なります。ICC 私形状、ギャップ接合51,52を介して相互に連結された細胞のネットワークを形成します。Ca2 +簡単な空間的にローカライズされた Ca2 +リリース イベントとして FOV (60 X 目的とイメージ)38内可視化として ICC マイネットワークを非同期的に複数のサイトで発生している ICC 私のマニフェストで信号します。これらの非同期信号を一時的に編成されます 1 秒クラスターを一緒に集計、時量の Ca2 +純 1 s 細胞上昇に。これらの信号は、ICC ネットワーク内で細胞を伝播し、したがって整理 Ca2 +シグナリング、組織ワイド Ca2 +ウェーブにサブ携帯サイトから生成されます。時空間クラスタ リングと Ca2 +の総和に ICC マイと呼ばれている Ca2 +非定常クラスター (CTCs)38信号します。Ctc は発生マウスで毎分 30 回、リズミカルに (例えばかなり類似している期間と Ctc の間の同じような期間) を使用します。逆に、ICC DMP が紡錘形細胞、平滑筋細胞と静脈瘤の神経プロセスの間に配布していない独立して、セカンダリ プロセスをいくつかのネットワーク51,52形式します。ICC DMP 平滑筋細胞がギャップ結合を形成し、SIP シンシチウム53として知られている、この大きいシンシチウム内で機能します。Ca2 +シグナルが細胞の長さに沿って複数のサイトで発生するが、これらの過渡電圧がない同調または一時的にクラスター化されている ICC マイ37で観測されました。ICC DMP における Ca2 +シグナルは、変数強度、継続時間と空間の特性と、確率的に発生します。以下、Ca2 +シグナル ICC マイの例を使用してプロトコルと ICC の DMP は、その場で細胞の特定の種類の複雑な信号を分析する手法を説明します。私たちは、Cre リコンビナーゼ (Cre) ICC 特定プロモーター (キット) 主導の活性化を誘導した後、ICC の排他的 GCaMP6f を表現する誘導 Cre Lox p システムを利用しました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

Ca2 +イメージング隔離されたセルまたはそのままティッシュ内の細胞の特定の種類の多くの場合では、Ca2 +シグナルの複雑なパターンを明らかにします。この活動は、慎重かつ詳細な分析と定量化可能な基になるイベントについて多くの情報をキャプチャするために必要です。空間、時間の強度パラメーター Ca2 +信号振幅、速度伝搬時間周波数などに本質的な細胞内シグナル伝達に必要ないくつかの生物学的情報があります。高解像度 Ca2 +イメージング通常結果、定量データに画像情報を翻訳という点でプロセスと、このプロセスに時間がかかる大規模なデータファイルのヒューマン エラーとバイアスに敏感にすることができます。原細胞からの Ca2 +シグナルの解析は通常視野 (FOV) 内の利益 (率 ROI) の任意に選ばれた地域から簡単な強度の測定に依存しています。このアプローチは、FOV に含まれている重要な信号情報の多くを無視します。したがって、Ca2 +染料または光 Ca2 +を用いるそのような高解像度の録音からの情報の回復を最大化するためには、イメージング、適切な Ca2 +シグナルの時空解析が必要です。このペーパーで説明されているプロトコルより完全な分析の組み合わせを使用してセルから記録された Ca2 +信号の定量化を容易にする Ca2 +イメージング録音からの大量のデータの取得方法について説明します。時空間マップ (STM)-ベースの解析と粒子ベースの分析。プロトコルは、Ca2 +異なる細胞集団の場を適切に分析できる観測信号のどのように異なるパターンもについて説明します。たとえば、メソッドを検討する Ca2 +シグナル、小腸細胞間質細胞カハール (ICC)、GECIs を使用しての特殊な人口。

キット Cre GCaMP6F マウス (図 1)、動的な Ca2 +シグナル胃腸に ICC の挙動その場で視覚化されるを使用しています。共焦点顕微鏡を用いた ICC の特定の人口の高精細画像は、フォーカス (図 2 a)37の明確な解剖学的平面は同じ組織内で ICC の他の集団からの信号を汚染することがなく得ることができます?...

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Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

遺伝子にエンコードされた Ca2 +インジケーター (GECIs) がどのようにその場で Ca2 +イメージングの実行と根本的に変更されました。そのような録音からのデータ回復を最大限に Ca2 +シグナルの適切な分析が必要です。本プロトコルは、Ca2 +シグナルの時空間マッピングと粒子ベースの分析を使用してその場で記録の定量化を促進します。

その場で細胞内 Ca2 +シグナル伝達を定量化する時空マッピングと粒子分析技術の応用

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

特に組織イメージング実験では、カルシウムイメージング実験から大量のデータを取得する能力が大幅に向上しました。このプロトコルは、これらのデータセットを定量化して記述するための適切な分析手法を記述しています。私たちのプロトコルは、組織全体のカルシウムシグナル伝達に固有の空間値、時間値、強度値の範囲を生成し、これはより初歩的な分析で失われる可能性があります。イメージングの1時間前に、カハルまたはICCの間質細胞を持つマウスから採取した小腸を、遺伝子組み換えカルシウム指標をスピニングディスク共焦点顕微鏡の段階に特異的に発現させる。そして継続的に摂氏37度のクレブスリンガー重炭酸塩またはKRB溶液で組織を浸透させる。60〜100 X倍率を使用して、小腸の円形および縦平滑筋層の間に星状の心腸叢ICCまたはICC-MYを配置する。次に、円形の平滑筋層と粘膜下神経叢の間の単一平面内のスピンドル形の深部筋叢ICCまたはICC-DMPを見つけ、TIFF画像のスタックとしてムービーを保存します。ICC-DMPカルシウムアクティビティの時間的マップまたはSTMを作成するには、ImageJで画像スタックを開き、[画像]、[タイプ]、[32ビット]をクリックして画質を変更します。ライン スキャンを作成するには、ライン選択ツールを右クリックし、セグメント化された線分を選択します。左クリックを 1 回使用すると、個々の ICC-DMP の中に線が引き込まれます。[イメージ、スタック、再スライス]を選択します。ポップアップ ウィンドウが表示されます。ライン スキャンの方向を左から右に向ける場合は、[90 度回転] を選択して、ライン スキャンの位置を左から右に調整し、X 軸の時間と時間を合わせて読み取り、y 軸上のスペースを持つ時間に合わせて読み取り、[OK] をクリックします。時空間マップが表示されます。マップからカルシウム信号の振幅を正確に測定するには、長方形の選択を選択し、蛍光の最も均一で最も強い領域を表示するSTM内の領域の周りに関心のある領域を描画します。[解析とヒストグラム]をクリックして、選択した対象領域内の強度の平均値を取得し、[編集]、[選択]、[すべて選択]をクリックして STM 全体を選択します。次に、[処理]、[数学]、および [除算] をクリックし、選択した STM 領域を含む強度の平均値をポップアップ ボックスに入力します。STM は黒に変わります。ポップアップウィンドウで[画像]、[調整]、[明るさ/コントラスト]、[自動]をクリックして、これを修正します。線スキャンは、蛍光をゼロで割った蛍光の強度で振幅に合わせて調整されます。STM は、TIFF スタック内のフレーム数を x 軸に、y 軸のセルの長さを表すピクセル数を表示します。カルシウム信号から時間データと空間データを定量化するには、[画像とプロパティ]をクリックし、適切な値を入力して、スペースと時間のSTMをポップアップウィンドウで完全に調整します。個々のカルシウムイベントを分析するには、[直線]をクリックし、STM上をクリックしてドラッグして、X軸に平行なカルシウムイベントの中心を通って直線の水平線を描きます。次に、[プロファイルの分析とプロット]をクリックします。カルシウムイベントのプロットプロファイルを示すボックスが表示されます。ICC-MYカルシウムシグナリングデータの粒子ベースの解析では、ムービーファイルをボリューム測定で開き、右クリックしてSTKフィルタを選択し、差別化します。もう一度右クリックして、区別する値を入力します。[Enter]を押して左クリックし、差別化を開始します。パーティクルを作成するには、マウスの中央ボタンを使用してムービーをスクロールし、静止期間を含む 20 ~ 40 フレームのセクションを選択し、続いてカルシウム過渡クラスターとクラスターの直後に続く 20 ~ 40 フレームを選択します。すべてのフレームが選択されている場合、ムービーウィンドウで右クリックして STK OPS ランプ DS パーティクル情報にアクセスし、最大強度から最小強度までしきい値を段階的にランプするパーティクル解析ルーチンを実行します。パーティクル分析を成功させるには、非活動性のカルシウム過少前クラスターをできるだけ多く組み込み、カルシウム後過渡クラスターをできるだけ多く組み込むことを確認してください。これは、信号対雑音比を高めるのに役立ちます。解析は、ノイズのプロットとしてプロットウィンドウにグラフィック表示され、粒子の数を表す緑色のトレース、平均粒子サイズを表す赤いトレース、絶対強度しきい値を表す青いトレースを持つ 3 つのカラートレースとしてトレースウィンドウに表示されます。ヒストグラムのバランスを取るために、キーボードのHを押して、パーティクルノイズのプロットを調整します。次に、右角かっこキーを押して、背景が白色になるまで配色を切り替えます。キーボードの F キーを 1 回押して、測定ツールを起動します。次に F キーを 2 回押して、色付きプロットが右側にシフトし始める交差点のプロットのトレース ウィンドウのスクロール バーの 1 本の垂直線をマークします。トレース ウィンドウ内で、マウスの中ボタンを使用して、赤いトレースの変曲点からマークされた白い垂直線までスクロールします。表示された Y 平均を確認した後、トレース ウィンドウ内でマウスの中央ボタンをもう一度クリックして、青いトレースの選択を解除します。ムービーウィンドウで C をクリックしてカラーホイールを表示し、D をクリックしてしきい値を調整します。有効なパーティクルは赤色で表示され、飽和したパーティクルは白色になります。マウスの左ボタンを使用して白い領域が削除されるまでスクロールし、中央マウスボタンを使用してカラーホイールの黄色の数値を Y 平均値に調整し、決定されたしきい値点でアクティブなカルシウム過渡粒子として赤ですべてを割り当てます。データを座標ベースのパーティクル ファイルとして保存するには、右クリックして STK 3D にアクセスし、パーティクル 0 を保存し、左クリックしてファイルを保存します。パーティクル アクティビティ ヒート マップを作成するには、保存したパーティクル ファイルを開き、ムービー ウィンドウを右クリックしてパーティクル STKops、StatMap フラグにアクセスし、分析するフラグの割り当てを入力します。クリックすると、分析と、記録全体の発生率を表す異なる色で記録全体の全長のパーティクルの合計が示されるヒート マップが適用されます。右クリックしてヒート マップを TIFF ファイルとして保存します。次に、ムービーウィンドウを右クリックして、パーティクルメジャーにアクセスし、パーティクルの統計 STK が等しく、解析のフラグ割り当てを入力します。トレース ウィンドウに一連のトレースが生成されます。STM 解析では、空間広がりや伝搬速度など、カルシウム信号の空間特性を監視および記録できます。この情報を蓄積して、ネイティブ環境内の細胞内のカルシウムシグナル行動をかなり完全に把握することができます。粒子分析を用いて、カルシウムシグナルに関する定量的情報を粒子面積と粒子数を測定することによって計算することができ、これを併用して、指定された視野内でカルシウム信号活性化の空間範囲を決定することができる。粒子分析はまた、カルシウム焼成部位の位置および発火確率の検討を通じて細胞下カルシウムシグナル伝達の詳細な定量を可能にする。パーティクルを時間特性に基づいて異なるフラグに割り当てることで、パーティクルのイニシエーションを正確にマッピングできます。そして、開始部位の数に関して取得された豊富なハードデータ、ピクセルおよびマイクロメートル単位のサイトのサイズ、各カルシウム過渡クラスター中に各開始部位が1回または複数回発射される確率、および各カルシウム過渡クラスターサイクル中に発射する発射部位の割合が得られる。このプロトコルで成功するための鍵は一貫性です。すべてのデータセットとすべてのムービーは、信頼性が高く再現可能な結果を確実にするために、まったく同じ扱いを受ける必要があります。これは、パーティクル ファイルを扱う場合に特に当てはまります。当社のプロトコルは、その場でのカルシウムシグナル伝達の深い特徴付けを可能にし、適切に使用すると、様々な統計的方法を使用することで、空間的パラメータと時間パラメータの範囲の違いを評価することができます。私たちのプロトコルのこれらの分析技術は、研究者が腸のペース作り、腸の内臓、ならびに下部尿路の神経制御に関する以前に対処できなかった質問を尋ね、答えることを可能にしました。

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

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