Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

자금 P01 DK41315 통해 NIDDK에 의해 제공 했다.

사용 하는 모든 동물 및 본이 연구에서 실시 하는 프로토콜 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 헬스 가이드의 국가 기관에 따라 했다. 모든 절차는 기관 동물 사용 관리 네바다, Reno의 대학에 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. KitGCaMP6f 마우스의 세대
<ol><li>Ai95 크로스 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f 마우스)와 c-키트+ Cre ERT2 ICC 특정 GCaMP6f 표현 동물 (마우스 키트-Cre-GCaMP6f)을 생?...

캘리포니아2 + 영상 그대로 조직 또는 세포의 네트워크에서 셀의 특정 종류의 종종 캘리포니아2 + 과도의 복잡 한 패턴을 보여준다. 이 활동에는 신중 하 고 깊이 있는 분석과 정량화 가능한 기본 이벤트와 이러한 이벤트의 활동에 대 한 많은 정보를 필요 합니다. STM과 PTCL 분석 이런이 종류의 녹음에서 나왔고 양적 데이터의 양을 최대화 하는 기회를 제공 합니다.
<p class="jove_conte...

캘리포니아2 + 는 다양 한 근육 수축1,2, 신진 대사3, 셀 확산3,4, 등의 세포 프로세스를 제어 하는 유비 쿼터 스 세포내 메신저 5, 신경 터미널6,7, 신경 전달 물질 방출의 자극과 활성화 전사의 핵에 있는 요인. 7 세포내 캘리포니아2 + 신호 종종 cytosolic 캘리포니아2 +, 과도 고도의 형태를 걸릴 및 이러한 자발적인 수 수 또는 셀 유형8따라 주 작동 근 자극에서 발생 한다. 공간, 시간 및 강도 매개 변수 캘리포니아2 + 신호 주파수, 기간, 전파, 속도, 진폭 등 본질적인 세포내 신호5, 에 필요한 생물 정보를 제공할 수 있습니다. 7 , 9. 세포질 캘리포니아2 + 신호는 캘리포니아2 + 릴리스 채널 ryanodine 수용 체 등을 통해 캘리포니아2 + 또는 캘리포니아2 + 릴리스 바인딩과 그물 (응급실)에서 세포 외 공간에서의 유입에서 발생할 수 있습니다 (RyRs)과 이노 시 톨-트라이-인산 염 수용 체 (IP3Rs)10. RyRs 및 IP3Rs 두 캘리포니아2 + 신호 발생에 기여할 수 있으며 다양 한 Ca2 + 유입 메커니즘 결합이 채널의 공동된 여 캘리포니아2 + 신호 패턴의 무수 한 발생할 수 있습니다. 그 숫자에 의해 형성 및 확률 캘리포니아2 + 유입 채널, 캘리포니아2 + 유입 및 릴리스, 그리고 식 채널과 Ca2의 근접에 캘리포니아2 + 릴리스 채널의 식의 프로필을 열고 + 단백질을 재흡수 및 압출. 캘리포니아2 + 신호 형태의 유니폼, 오래 지속, 강도 높은 글로벌 진동 전파 세포내와 세포 Ca2 + 파 세포내 거리 교차 수 있습니다. 몇 초 또는 분, 마지막 수 있습니다. 걸릴 수 있습니다. 100 µ m10,11,12,13,,1415,16또는 캘리포니아 2 +와 같은 더 간단한, 공간적 지역화 된 이벤트 불꽃 및 캘리포니아2 + 퍼프 미만 5 µ m17,18,,1920확산 수십 밀리초 timescales에 발생 하는.
형광 현미경 검사 법은 모니터링할 Ca2 + 신호 분리 및 배양 세포에 그대로 조직에서 널리 사용 되었습니다. 전통적으로,이 실험 형광 캘리포니아2 + 지표, 비율의 사용 및 비 비율 염료 Fura2, Fluo3/4 등 Rhod2, 다른 사람의 사이에서 21,,2223. 이러한 표시기는 세포 막에 융 화 되 고 다음 생 esterases 통해 에스테 르 그룹의 분열에 의해 세포에 갇혀 될 하도록 설계 되었습니다. 캘리포니아2 + 높은 선호도 지표의 바인딩 세포와 조직 적합 한 파장의 빛에 의해 조명 되었다 형광에 변경 발생 합니다. 세포 투과성 캘리포니아2 + 지표를 사용 하 여 크게 캘리포니아2 + 살아있는 세포에서 신호 및 공간 해상도 Ca2 + 신호 시 금에 의해 불가능 했던이 신호의 정량화를 허용의 우리의 이해를 향상 통해 전기 생리학 등 다른 의미 합니다. 그러나, 전통적인 캘리포니아2 + 지표 확장된 녹음 기간24이상 발생 하는 photobleaching 같은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 새로운 Ca2 + 표시기 염료와 같은 Cal520/590는 크게 향상 된 신호 소음 비율 및 로컬 Ca2 + 신호25를 감지 하는 능력을, 하는 동안 photobleaching 문제 일부 조사 에 대 한 우려가 남아 수 있습니다. 26,,2728. 깎아지른 듯한 photobleaching 또한 확대, 이미지 수집, 속도 제한 및 해상도 증가 객관적인 전력 및 이미지 수집의 요구 대로 녹음에 사용할 수 있는 여기 빛의 강도 증가 하는 photobleaching을 증가합니다.
전통적인 캘리포니아2 + 표시기 염료는 캘리포니아2 + 신호 제자리를 기록할 때 더욱 악화의 이러한 제한, 예를 들어 때 녹음 세포내 캘리포니아2 + 신호 그대로 조직에서. 위의 문제로 인해 한 세포 침투성 캘리포니아2 + 지표를 사용 하 여 제자리에 캘리포니아2 + 신호 낮은 전력 확대에 국한 되었으며 이미지 캡처, 기록 조사 관의 능력 제한의 속도 감소 하 고 일시적으로 또는 공간적으로 제한 된 subcellular 캘리포니아2 + 신호 계량. 따라서, 그것은 어려운 캡처, 분석, 및 캘리포니아2 + 신호, 위에서 설명한 대로 원하는 생물학 응답의 생성에 중요 한 될 수 있는 공간 및 시간 복잡 감사 되었습니다. 캘리포니아2 + 세포 제자리에서 신호 분석 일반적으로 관심 (ROI) 한 시야 (FOV) 내의 선택된 영역에서 간단한 강도 측정에 의존합니다. 수, 크기 및 ROIs, 연구원의 변덕에 의존의 위치 임의 선택 결과 편견 심각 수 있습니다. 고유한 바이어스 ROI 분석, 뿐만 아니라이 이렇게 무시 많은 중요 한 신호 정보는 임의로 선택한 내 동적 캘리포니아2 + 이벤트로는 FOV에 포함 된 투자 수익 분석을 위해 선택 됩니다. 또한, 분석 ROIs의 Ca2 + 신호 관찰의 공간적 특성에 대 한 정보를 제공 하기 위해 실패 합니다. 예, 그것은 가능 하지 않을지도 상승 캘리포니아2 + 는 전파 발생 사이 구별 하 캘리포니아2 + 파와는 매우 지역화 된 Ca2 + 릴리스 캘리포니아2 + 신호는 투자 수익의 도표가에서 이벤트.
유전자 인코딩된 Ca2 + 지표 (GECIs)의 출현은 근본적으로 어떻게 캘리포니아2 + 이미징 수행 현장에29,30,,3132,33 수 변경 . 염료에 GECIs를 사용 하 여 여러 가지 이점이 있다. 가장 중요 한는 아마 GECI의 표현 하지 관심의 세포에서 원치 않는 배경 오염 감소 셀 특정 방식으로 수행할 수 있습니다 이다. 전통적인 캘리포니아2 + 지표 GECIs의 또 다른 장점은입니다 그 photobleaching 감소 (형광 및 consequentially photobleaching만 발생 때 세포는 활성), 특히 높은에서 염료 로드 표본에 비해 이미지의 확대 및 높은34캡처. 따라서, 브리핑, 지역화 된 하위 세포질 캘리포니아2 + 제자리에서 신호 GCaMP 시리즈 optogenetic 센서, 월급 조사 기록 하는 기능 같은 GECIs와 이미징 및 조사 캘리포니아2 + 셀 내에서 신호 들 이전 가능한 되지 않은 환경에 대 한 네이티브입니다. 이러한 고해상도 녹음에서 정보의 복구를 최대화 하기 위해 적절 한 공간 및 시간 분석 Ca2 + 신호는 필요 합니다. 그것은 그 GECIs 일부 취소 이점을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 최근 연구 계시 했다 캘리포니아2 + 이미징 성공적으로 동시에 사용 하 여 기존의 신경의 다른 neurochemical 클래스의 큰 인구에서 수행할 수 있습니다 주목 해야한다 캘리포니아2 + 지표 유전자 동물35로 인코딩된 하지. 이 이렇게는 동기화 된 버스트, 높은 주파수에서 발생 하는 신경의 여러 다른 클래스 공개 포스트 hoc immunohistochemistry를 사용 하 고 동물에 유전 수정 수 있다 방해 하는 생리 적 잠재력을 피했습니다 행동 조사35,36을 이해 하고자 한다.
더 완전 한 분석을 촉진 하는이 문서에서 설명 하는 프로토콜 및 캘리포니아2 + 의 정량화 신호 세포 spatiotemporal 지도 (STM)의 조합을 사용 하 여 현장에서 기록-분석 및 입자 기반 분석을 기반으로. 프로토콜은 또한의 캘리포니아2 + 인구 현장에서 적절 하 게 분석 될 수 있다 다른 셀에서 관찰 된 신호 어떻게 다른 패턴을 설명 합니다. 이해를 돕기 위해 메서드를 검사 합니다 Ca2 + 중간 셀 Cajal (ICC)의 작은 창 자에서 셀의 특수 인구에 신호. ICC는 전시 동적 세포내 캘리포니아2 + 신호, GCaMPs38,,3739,40, 표현 하는 마우스를 사용 하 여 시각화 하는 위장 (GI) 지역에 전문된 셀 41,42. 캘리포니아2 + 과도 ICC에 캘리포니아2 +의 활성화로 연결-활성화 Cl- 장 평활 근 세포 (SMCs)43의 흥분을 조절에 중요 한 채널 ( Ano1인코딩) 44,45. 따라서, 캘리포니아2 + ICC에 시그널링의 연구 창 자 운동 성 이해에 기본적 이다. 해부학 분리 되 고 독립적으로 구상 될 수 있다 ICC의 두 클래스는 murine 소장이이 데모에 대 한 훌륭한 예를 제공 합니다: 난) ICC 원형 및 경도 평활 근 사이의 영역에 있는 레이어, myenteric 총을 둘러싼 (ICC 내). 이러한 셀 맥 박 조정기 세포 역할 및 느린 파도46,47,,4849;로 알려진 전기 활동 생성 ii) ICC 모터 신경 (깊은 근육 신경 총, 따라서 ICC DMP)의 터미널에 풍부한 총 들도 있습니다. 이 세포는 장 모터 neurotransmission37,39,,4050응답의 중재자 역할을 합니다. ICC-내 ICC DMP 형태학 상으로 다른, 그리고 그들의 캘리포니아2 + 신호 동작 차이가 근본적으로 그들의 특정 작업을 수행. ICC-내 방사상 모양에서 그리고 간격 접속점51,52를 통해 상호 연결 된 세포의 네트워크를 형성. 캘리포니아2 + ICC 내 매니페스트에 짧고 공간 지역화 된 Ca2 + 출시 이벤트로 FOV (60 X 목적으로 몇 군데)38내 시각으로 ICC 내 네트워크를 통해 비동기적으로 여러 사이트에서 발생 하는 신호. 이러한 비동기 신호는 일시적으로 구성 되며 1 초는 클러스터 때 함께 표로, 금액 순 1 s 세포 증가 캘리포니아2 +. 이러한 신호 ICC 네트워크 내에서 셀을 셀을 전파 하 고 따라서 구성 Ca2 + 신호, 조직 넓은 캘리포니아2 + 파로 하위 휴대 전화 사이트에서 생성 된. 일시적인 클러스터링 및 캘리포니아2 + 의 변론에 신호를 ICC 내 불렸다 Ca2 + 과도 클러스터 (CTCs)38. CTCs 발생 리듬 (예: 매우 비슷한 기간과 유사한 기간 CTCs 사이) 마우스에서 분당 30 회. 반대로, ICC DMP 스핀 들 모양의 세포, 보조 프로세스, SMCs와 정 신경 프로세스 간의 배포 하 고 독립적으로 하지 않는 일부 네트워크51,52형성. 그러나 ICC-DMP와 SMCs, 간격 접속점 형성, 그리고 SIP syncytium53로 알려진이 큰 syncytium 내에서 작동. 캘리포니아2 + 신호 셀의 길이 따라 여러 사이트에서 발생 하지만 이러한 과도 개입 하거나 일시적으로 클러스터, ICC 내37에서 관찰 하지. 캘리포니아2 + 신호 ICC DMP에 변수 강도, 기간 및 공간 특성 확률적 방식으로 발생합니다. 캘리포니아2 + ICC 내에 신호의 예제를 사용 하 여 아래 프로토콜 및 ICC-DMP, 특정 유형의 셀 현장에서 복잡 한 신호를 분석 하는 기법을 설명. 우리는 Cre Recombinase (Cre) ICC 특정 발기인 (키트)에 의해 구동의 활성화를 유도 한 후 ICC에 독점적으로 GCaMP6f을 표현 하는 유도할 수 있는 Cre Lox p 시스템 활용.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

캘리포니아2 + 이미징 격리 된 셀 또는 그대로 조직 내의 세포의 특정 종류의 종종 캘리포니아2 + 신호의 복잡 한 패턴을 보여준다. 이 활동에는 신중 하 고 깊이 있는 분석과 정량화 가능한 기본 이벤트에 대 한 많은 정보를 필요 합니다. 공간, 시간 및 강도 매개 변수 캘리포니아2 + 신호 주파수, 기간, 전파, 속도 진폭 등 본질적인 세포내 신호 전달에 필요한 몇 가지 생물 학적 정보를 제공할 수 있습니다. 고해상도 캘리포니아2 + 시간이 걸릴 정량 데이터 이미징 정보 번역의 관점에서 프로세스 및이 프로세스는 큰 데이터 파일의 인수에 결과 일반적으로 이미징 인간의 오류와 편견에 감염 될 수 있습니다. 캘리포니아2 + 세포 제자리에서 신호 분석 일반적으로 시야 (FOV) 내의 관심 (ROI)의 임의로 선택한 영역에서 간단한 강도 측정에 의존합니다. 이 이렇게 많은 FOV에 포함 된 중요 한 신호 정보를 무시 합니다. 따라서, 캘리포니아2 +염료 또는 optogenetic Ca2 + 얻은 같은 고해상도 녹음에서 정보의 복구를 최대화 하기 위해 이미징, 적절 한 공간 및 시간 분석 Ca2 + 신호는 필요 합니다. 이 문서에 설명 된 프로토콜 어떻게 대용량 데이터의 더 완전 한 분석 및 캘리포니아2 + 신호의 조합을 사용 하 여 셀에서 기록의 정량화를 촉진 하기 위하여 캘리포니아2 + 영상 녹음에서 얻어질 수 있다 설명 spatiotemporal 지도 (STM)-분석 및 입자 기반 분석을 기반으로. 프로토콜은 또한의 캘리포니아2 + 인구 현장에서 적절 하 게 분석 될 수 있다 다른 셀에서 관찰 된 신호 어떻게 다른 패턴을 설명 합니다. 이해를 돕기 위해 메서드를 검사 합니다 Ca2 + 중간 셀의 Cajal (ICC), GECIs를 사용 하 여 작은 창 자에 있는 세포의 특수 인구에 신호.

키트-Cre-GCaMP6F 마우스 (그림 1), 동적 캘리포니아2 + 위장에 ICC의 행동 현장에서 몇 군데 수 신호를 사용 하 여. Confocal 현미경 검사 법, ICC의 특정 인구의 고해상도 이미지는 같은 조직 내의 하지만 초점 (그림 2A)37 의 해부학 다른 비행기에 ICC의 다른 인구에서 신호를 오염 없이 취득 될 수 있다 , ...

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Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

유전자 인코딩된 Ca2 + 지표 (GECIs) 근본적으로 어떻게 현장에서 캘리포니아2 + 이미징 수행 달라졌다. 이러한 녹음에서 데이터 복구를 최대화 하기 위해 캘리포니아2 + 신호의 적절 한 분석이 필요 합니다. 이 종이에 프로토콜 캘리포니아2 + 신호를 원래의 spatiotemporal 매핑 및 입자 기반 분석을 사용 하 여 기록의 정량화를 촉진 한다.

세포내 캘리포니아2 + 제자리에서 신호 계량 Spatio 시간적 매핑 및 입자 분석 기법에의 응용

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

칼슘 이미징 실험에서 대량의 데이터를 수집할 수 있는 능력은 특히 조직 이미징 실험으로 크게 개선되었습니다. 당사의 프로토콜은 이러한 데이터 집합을 정량화하고 설명하는 적절한 분석 기술을 설명합니다. 당사의 프로토콜은 전체 조직에서 칼슘 신호에 내재된 공간, 시간적 및 강도 값의 범위를 생성하며 이는 보다 기본적인 기반 분석에서 손실될 수 있습니다.이미징 전송 1 시간 전에 Cajal 또는 ICC의 간질 세포가있는 마우스에서 수확 한 소장은 특히 회전 디스크 공초점 현미경의 단계로 유전적으로 인코딩 된 칼슘 지표를 표현합니다. 그리고 지속적으로 37섭씨 크렙스 링거 중탄산염 또는 KRB 용액으로 조직을 침투한다. 60 받는 사람은 X 배율로 작은 장의 원형과 세로의 매끄러운 근육 층 사이에 스텔레이트 모양의 myenteric 신경총 ICC 또는 ICC-MY를 찾습니다.그런 다음 원형 부드러운 근육 층과 부점진 신경총 사이의 단일 평면에서 스핀들 모양의 깊은 근육 신경총 ICC 또는 ICC-DMP를 찾아 TIFF 이미지의 스택으로 영화를 저장합니다. ICC-DMP 칼슘 활동의 현면 맵 또는 STM을 생성하려면 ImageJ에서 이미지 스택을 열고 이미지, 유형 및 32비트를 클릭하여 이미지 품질을 수정합니다. 라인 스캔을 만들려면 선 선택 도구를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 분할된 선을 선택합니다.왼쪽 단일 클릭을 사용하여 개별 ICC-DMP의 중간 액세스를 따라 선을 그리며 전체 셀이 윤곽을 그리면 두 번 클릭합니다. 이미지, 스택 및 다시 슬라이스를 선택합니다. 팝업 창이 나타납니다.90도 회전을 선택하여 라인 스캔을 왼쪽에서 오른쪽으로 방향을 지정하여 y축의 공간이 있는 x축에서 시간에 대해 보정하고 읽을 수 있도록 확인을 클릭합니다. 현면지도가 나타납니다. 지도에서 칼슘 신호의 진폭을 정확하게 측정하려면 직사각형 선택을 선택하고 가장 균일하고 가장 강렬한 형광 영역을 표시하는 STM 내 영역 주변의 관심 영역을 그립니다. 분석 및 히스토그램을 클릭하여 선택한 관심 지역 내강도의 평균 값을 얻고 편집, 선택, 전체 STM을 선택하려면 모두 를 클릭합니다.다음으로, 프로세스, 수학 및 분할을 클릭하고 팝업 상자에 관심있는 선택한 STM 영역과 강도의 평균 값을 입력합니다. STM은 검은색으로 바뀝니다. 팝업 창에서 이미지, 조정, 밝기/대비 및 자동을 클릭하여 이 수정합니다.선 스캔은 이제 형광의 강도가 제로 형광으로 나누어진 형광의 강도로 진폭을 보정한다. STM은 x축의 TIFF 스택의 프레임 수와 y축의 셀 길이를 나타내는 픽셀 수를 표시합니다. 칼슘 신호로부터 시간적 및 공간 데이터를 정량화하려면 이미지 및 속성을 클릭하고 적절한 값을 입력하여 팝업 창에서 의 공간과 시간에 대해 STM을 완전히 보정합니다.개별 칼슘 이벤트를 분석하려면 직선을 클릭하고 STM을 클릭하고 드래그하여 x축과 평행한 칼슘 이벤트의 중심을 통해 직선 수평 선을 그립니다. 그런 다음 프로파일 분석 및 플롯을 클릭합니다. 칼슘 이벤트의 플롯 프로파일을 보여주는 상자가 나타납니다.ICC-MY 칼슘 신호 데이터의 입자 기반 분석을 위해 볼륨트리에서 영화 파일을 열고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하여 STK 필터를 선택합니다. 다시 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 차별화할 값을 입력합니다. Enter를 누르고 왼쪽 단추를 클릭하여 차별화를 시작합니다.입자를 만들려면 중간 마우스 버튼을 사용하여 영화를 스크롤하여 정지 기간을 포함하는 20~ 40프레임 섹션을 선택하고, 그 다음에는 칼슘 과도 클러스터와 클러스터 바로 뒤에 따라 20~40프레임이 발생합니다. 모든 프레임이 동영상 창에서 마우스 오른쪽 단추로 선택되면 STK OPS 램프 DS 파티클 정보에 액세스하고 클릭하여 임계값을 최대값에서 최소 강도로 점진적으로 경사시키는 파티클 분석 루틴을 실행합니다. 성공적인 입자 분석을 보장하기 위해, 칼슘 전 과도 클러스터 비 활성, 그리고 가능한 한 많은 칼슘 후 과도 클러스터 비 활성을 통합해야 합니다.이렇게 하면 신호 대 잡음 비율을 높이는 데 도움이 됩니다. 분석은 플롯 창에 노이즈 플롯으로 그래픽으로 표시되고 미신 창에는 입자 수를 나타내는 녹색 추적, 평균 입자 크기를 나타내는 빨간색 추적 및 절대 강도 임계값을 나타내는 파란색 추적이 있는 세 가지 색상 추적으로 표시됩니다. 히스토그램의 균형을 맞추기 위해 키보드의 입자 노이즈 프레스 H의 플롯을 누릅니다.그런 다음 오른쪽 브래킷 키를 눌러 배경이 흰색이 될 때까지 색상 구성표를 순환합니다. 측정 도구를 키우려면 키보드에서 한 번 F를 누릅니다. 그런 다음 F를 두 번째로 눌러 색상 플롯이 오른쪽으로 이동하기 시작하는 교차로의 플롯의 추적 창의 스크롤 막대에 하나의 세로 선을 표시합니다.추적 창 내에서 중간 마우스 버튼을 사용하여 빨간색 추적의 변곡점에서 표시된 흰색 세로 선으로 스크롤합니다. 표시된 Y 평균을 기록한 후 추적 창 내부의 중간 마우스 버튼을 다시 클릭하여 파란색 추적을 선택 해제합니다. 동영상 창에서 C를 클릭하여 색상 휠을 만들고 D를 클릭하여 임계값을 조정합니다.이제 유효한 파티클이 빨간색으로 표시되고 포화 입자가 흰색으로 표시됩니다. 왼쪽 마우스 버튼을 사용하여 흰색 영역이 제거될 때까지 스크롤하고 중간 마우스 버튼을 사용하여 색상 휠의 노란색 숫자 값을 Y 평균 값으로 조정하여 결정된 임계값지점에서 활성 칼슘 과도 입자로 빨간색으로 모든 것을 할당합니다. STK 3D에 액세스하려면 좌표 기반 파티클 파일로 데이터를 저장하려면 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 파티클 0을 저장하고 왼쪽 단추를 클릭하여 파일을 저장합니다.파티클 활동 열맵을 만들려면 저장된 파티클 파일을 열고 영화 창에서 마우스 오른쪽 단추를 클릭하여 파티클 STKops, StatMap 플래그에 액세스하고 플래그 할당을 입력하여 분석합니다. 기록 전체의 백분율 발생을 나타내는 다른 색상으로 기록의 전체 길이에 대한 총 입자를 보여주는 분석 및 열 맵을 적용하려면 클릭합니다. 마우스 오른쪽 단추를 클릭하여 열맵을 TIFF 파일로 저장합니다.그런 다음 동영상 창을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 파티클 측정값에 액세스하고 파티클 통계 STK가 같으며 분석에 대한 플래그 할당을 입력합니다. 추적 창에서 일련의 추적이 생성됩니다. STM 분석은 공간 확산 및 전파 속도와 같은 칼슘 신호의 공간 특성을 모니터링하고 기록하는 기능을 제공합니다.이 정보는 그들의 네이티브 환경에서 세포 내의 칼슘 신호 행동의 다소 완전한 보기를 제공하기 위하여 축적될 수 있습니다. 입자 분석을 이용하여 칼슘 신호에 대한 정량적 정보는 입자 영역과 입자 수를 측정하여 계산할 수 있으며, 이는 지정된 시야 내에서 칼슘 신호 활성화의 공간 범위를 결정하는 데 함께 사용될 수 있다. 입자 분석은 또한 칼슘 발사 부위의 위치 및 발사 확률의 검사를 통해 세포 전세포 칼슘 신호의 심층적인 정량화를 허용합니다.파티클을 측두특성에 따라 다른 플래그에 할당하면 파티클을 정확하게 매핑할 수 있습니다. 그리고 개시 부위의 수에 대해 획득된 풍부한 하드 데이터, 픽셀 및 마이크로미터의 사이트의 크기, 각 칼슘 과도 클러스터 동안 각 개시 부위의 발생 확률, 각 칼슘 과도 클러스터 주기 동안 발생하는 발사 부위의 비율을 얻을 수 있다. 일관성은 이 프로토콜의 성공의 열쇠입니다.모든 데이터 세트와 모든 동영상은 신뢰할 수 있고 반복 가능한 결과를 보장하기 위해 정확히 동일한 처리되어야 합니다. 이는 파티클 파일을 처리할 때 특히 그렇습니다. 당사의 프로토콜은 앉아서 칼슘 신호의 깊은 특성화를 허용하고, 적절하게 사용될 때 다양한 통계적 방법을 통해 공간 및 측두압 의 범위 간의 차이를 평가할 수 있습니다.우리의 프로토콜에 있는 이 분석 기술은 연구원이 장 페이스 메이킹및 장 내분및 더 낮은 요로의 신경 통제와 관련있는 이전에 다루기 어려운 질문을 하고 대답하는 것을 허용했습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

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이미징 CA의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

연구

생물학

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

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혈관 CA의 시각화 2 + Paracrine 유래 ROS에 의해 트리거된 신호

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

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자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

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세포 내 칼슘 측정<sup&gt; 2 +</sup개의 기술하여 인간 정자에서&gt; 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

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형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

동적 칼슘의 자동 분석<sup&gt; 2 +</sup이미지 시퀀스에서&gt; 신호

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

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세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...