Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Midler ble gitt av NIDDK, via P01 DK41315.

Alle dyr som brukes og protokollene i denne studien var i samsvar med den nasjonale institutter for helse Guide og bruk av forsøksdyr. Alle prosedyrer ble godkjent av institusjonelle dyr bruk og omsorg komiteen på University of Nevada, Reno.
1. generasjon KitGCaMP6f mus
<ol><li>Krysse Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f mus) og c-Kit/ grobunn-ERT2 (Kit-grobunn mus) til å generere ICC bestemte GCaMP6f uttrykke dyr (Kit-Cre-GCaMP6f mus). Merk: GCaMP6f ble brukt på ...

Ca2 + avbilding av bestemte typer celler i intakt vev eller innen nettverk av celler ofte avslører komplekse mønstre av Ca2 + transienter. Denne aktiviteten krever forsiktig og Dyptgående analyser og kvantifisering å fange så mye informasjon om underliggende hendelser og kinetics av disse hendelsene som mulig. STM og PTCL analyse gir mulighet for å maksimere mengden av kvantitative data gitt opptak av denne typen.
Smalt, spindel-formet morfologi av ICC-DMP gjør dem...

Ca2 + er en allestedsnærværende intracellulær budbringer som styrer en rekke cellulære prosesser, for eksempel muskel sammentrekning1,2, stoffskifte3, celle spredning3,4, 5, stimulering av nevrotransmitter utgivelsen på nerve terminaler6,7, og aktivering av transkripsjon faktorer i kjernen. 7 intracellulær Ca2 + signaler ofte tar form av forbigående høyder i cytosolic Ca2 +, og dette kan være spontan eller oppstå Agonistiske stimulering avhengig av den celle type8. Spatial, timelige og intensitet parametere iboende til Ca2 + signaler som frekvens, varighet, overføring, hastighet og amplituden kan gi biologiske informasjon kreves for intracellulær signal5, 7 , 9. cytoplasmatiske Ca2 + signaler kan resultere av Ca2 + fra ekstracellulære plass eller via Ca2 + utgivelse fra det endoplasmatiske retikulum (ER) via Ca2 + utgivelsen kanaler som ryanodine reseptorer (RyRs) og inositol-tri-fosfat reseptorer (IP3Rs)10. RyRs og IP3Rs kan både bidra til generasjon av Ca2 + signaler og felles åpningen av disse kanalene, som kombinert med ulike Ca2 + tilstrømningen mekanismer kan resultere i en myriade av Ca2 + signalisere mønstre som er formet av tallene og åpne sannsynligheten av Ca2 + tilstrømningen kanaler, profilen for expression av Ca2 + utgivelsen kanaler, nærhet mellom Ca2 + tilstrømningen og utgivelsen kanaler, og uttrykket og distribusjon av Ca2 + reopptak og ekstrudering proteiner. Ca2 + signaler kan ta form av uniform, langvarig, høy intensitet globale svingninger som kan vare i flere sekunder eller minutter, spre intracellulær og intercellulære Ca2 + bølger som kan krysse intracellulær avstander over 100 µm10,11,12,13,14,15,16eller flere kort, romlig lokalisert hendelser som Ca2 + gnister og Ca2 + puffs som oppstår på titalls millisekund tidsrammer og spre mindre enn 5 µm17,18,19,20.
Fluorescerende mikroskopi er blitt anvendt vidt å overvåke Ca2 + signalisere isolert og kultivert celler og intakt vev. Tradisjonelt disse eksperimentene omfattet bruk av fluorescerende Ca2 + indikatorer, ratiometric og ikke-ratiometric fargestoffer som Fura2, Fluo3/4 eller Rhod2, blant annet 21,22,23. Disse indikatorene ble utformet permeable til celle membraner og deretter bli fanget i celler i spalting av en ester gruppe via endogene esterases. Binding av Ca2 + til høy affinitet indikatorer forårsaket endringer i fluorescens når celler og vev ble opplyst av aktuelle bølgelengder av lys. Bruk av cellen permeable Ca2 + indikatorer forbedret kraftig vår forståelse av Ca2 + signalering i levende celler og tillatt romlig oppløsning og måling av disse signalene som ikke var mulig ved assaying Ca2 + signaler på andre måter, for eksempel elektrofysiologi. Tradisjonelle Ca2 + indikatorer har imidlertid flere begrensninger, som photobleaching som skjer over utvidet opptak perioder24. Mens nyere Ca2 + indikator fargestoffer som Cal520/590 har kraftig forbedret signal til støy forhold og muligheten til å oppdage lokale Ca2 + signaler25, kan problemer med photobleaching fortsatt et problem for noen etterforskere 26,27,28. Stupbratte photobleaching begrenser også forstørrelsen, antall bildeopptak, og oppløsning som kan brukes for opptak, som økt objektive makt og høyere priser på bildeopptak krever økt eksitasjon lysintensiteten som øker photobleaching.
Disse begrensningene av tradisjonelle Ca2 + indikator fargestoffer er forverret ved registrering av Ca2 + signaler på stedet, for eksempel når innspillingen intracellulær Ca2 + signaler fra intakt vev. På grunn av problemene ovenfor, visualisering av Ca2 + signaler i situ med cellen permeable Ca2 + indikatorer har vært begrenset til strømsparingsmodus forstørrelse og reduserte priser for bildebehandling, begrenser evnen til etterforskerne å registrere og kvantifisere timelig eller romlig begrenset subcellular Ca2 + signaler. Derfor har det vært vanskelig å fange, analysere og verdsette romlige og tidsmessige kompleksiteten av Ca2 + signaler, som kan være viktig for generering av biologiske responser er ønsket, som beskrevet ovenfor. Analyse av Ca2 + signaler fra celler i situ er vanligvis avhengig av enkel intensitet målinger fra utvalgte regioner av interesse (ROI) i en synsfelt (FOV). Tilfeldig valg av antall, størrelse og plassering av ROIs, avhengig av innfall av forskeren, kan alvorlig bias resultatene. Og iboende skjevheter med avkastningsanalyse, ignorerer denne tilnærmingen mye av viktig signalnettverk informasjonen i FOV, som dynamisk Ca2 + hendelser i opptil Avkastningen er valgt for analyse. Videre unnlater analyse av ROIs å gi informasjon om romlige karakteristikkene av Ca2 + signalene observert. For eksempel kan det ikke være mulig for å skille mellom en økning i Ca2 + som følge av en overføring av Ca2 + bølge og en sterkt lokalisert Ca2 + release event fra tabeller av Ca2 + signaler i en avkastning.
Ankomsten av genetisk kodet Ca2 + indikatorer (GECIs) har radikalt forandret hvordan Ca2 + bildebehandling kan være utført i situ29,30,31,32,33 . Det er flere fordeler med å bruke GECIs over fargestoffer. Den viktigste kanskje er at uttrykk for GECI kan utføres på en celle bestemt måte, noe som reduserer uønsket bakgrunn forurensning fra cellene ikke av interesse. En annen fordel med GECIs over tradisjonelle Ca2 + indikatorer er at photobleaching reduseres (som fluorescens og consequentially photobleaching oppstår bare når celler er aktive), sammenlignet med fargestoff lastet prøver, spesielt på høy forstørrelse og høye image fange34. Dermed tenkelig med GECIs, som en GCaMP rekke optogenetic sensorer, gir etterforskerne evnen å fortegnelse korte, lokalisert sub mobilnettet Ca2 + signaler i situ og undersøke Ca2 + signalering i celler i deres innfødte miljøer som ikke er mulig tidligere. For å maksimere utvinningen av informasjon fra slike høyoppløselig opptak, kreves det riktige romlige og tidsmessige analyse av Ca2 + signaler. Det bør bemerkes at mens GECIs kan tilby noen klare fordeler, studier har nylig avdekket at Ca2 + bildebehandling kan utføres vellykket fra store populasjoner av ulike nevrokjemiske klasser av neurons samtidig ved hjelp av konvensjonelle Ca2 + indikatorer som ikke er genetisk kodet inn i dyr35. Denne tilnærmingen brukes post hoc immunohistochemistry for å avsløre flere forskjellige klasser av neurons skyting på høy frekvens i synkroniserte støt, og unngikk potensialet som genetiske modifikasjoner til dyret kan ha forstyrret den fysiologiske virkemåten etterforskeren søker å forstå35,36.
Protokollene i notatet rette mer fullstendig analyse og kvantifisering av Ca2 + signaler innspilt fra celler i situ med en kombinasjon av spatiotemporal kart (STM)-basert analyse og partikkel-basert analyse. Protokollene beskriver også hvordan ulike mønstre av Ca2 + signalering observert i ulike celle populasjoner i situ kan analyseres riktig. For illustrasjon, vil metoden undersøke Ca2 + signalisere i en spesialisert populasjon av celler i tynntarmen, interstitielle cellene av Cajal (ICC). ICC er spesialiserte celler i fordøyelsessystemet (GI) som viser dynamisk intracellulær Ca2 + signalnettverk, som visualisert ved hjelp av mus uttrykke GCaMPs37,38,39,40, 41,42. Ca2 + transienter i ICC er knyttet til aktivering av Ca2 +-aktivert Cl- kanaler (kodet av Ano1) som er viktige i å regulere excitability av intestinal glatt muskel celler (SMCs)43, 44,45. Dermed er studiet av Ca2 + signalering i ICC grunnleggende for å forstå intestinal motilitet. Murine tynntarmen tilbyr et utmerket eksempel for denne demonstrasjonen, som det er to klasser av ICC som skilles anatomisk og kan visualiseres uavhengig: jeg) ICC ligger i området mellom den sirkulære og langsgående glatt muskelen lag, rundt myenteric plexus (ICC-min). Disse cellene som Pacemakerceller og generere den elektriske aktiviteten kjent som langsom bølger46,47,48,49; II) ICC ligger også blant en plexus rike i terminalene på motor neurons (dyp muskel plexus, dermed ICC-DMP). Disse cellene tjene som meglere svar til enteric motor neurotransmission37,39,40,50. ICC-min ICC-DMP morphologically distinkte og er Ca2 + signalnettverk virkemåtene som er vesentlig for å utføre sine oppgaver. ICC-min er stellate i form og danner et nettverk av sammenhengende celler via gapet veikryss51,52. Ca2 + signaler i ICC-min manifest som kort og romlig lokalisert Ca2 + utgivelsen hendelser på flere områder asynkront gjennom ICC-min nettverket som visualisert innenfor en FOV (fotografert med en 60 X-målet)38. Disse asynkrone signalene er timelig organisert i 1 sekund klynger som, når ordnet sammen, utgjør en netto 1 s mobilnettet økning i Ca2 +. Disse signalene overføres celle til celle i ICC nettverket og derfor organisere Ca2 + signalering, generert fra sub mobilnettet steder, i en vev bredt Ca2 + bølge. Timelige klynger og summering av Ca2 + signaler i ICC-min har blitt kalt Ca2 + forbigående klynger (CTCs)38. CTCs oppstå rytmisk (f.eks ganske like varigheter og lignende periodene mellom CTCs) 30 ganger per minutt i musen. Derimot ICC-DMP spindel formet celler, noen med sekundære prosesser, som distribuerer mellom SMCs og varicose nerve prosesser og ikke uavhengig danner et nettverk51,52. ICC-DMP skjemaet gapet veikryss SMCs, men og funksjon i denne større syncytium, kalles SIP syncytium53. Ca2 + signaler oppstår på flere områder langs lengden på cellene, men disse transienter ikke entrained eller timelig gruppert, som observert i ICC-min37. Ca2 + signaler i ICC-DMP forekommer i en Stokastisk måte, med varierende intensitet, varighet og romlig egenskaper. Protokollene nedenfor, bruker eksemplet med Ca2 + signalering i ICC-min og ICC-DMP, beskriver teknikker for å analysere komplekse signalering i bestemte typer celler i situ. Vi utnyttet induserbart grobunn-Lox p systemet for å uttrykke GCaMP6f i ICC, etter inducing aktivering av grobunn-Recombinase (grobunn) drevet av en ICC bestemt arrangøren (Kit).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

Ca2 + imaging isolert celleområde eller bestemte typer celler i intakt vev ofte avslører komplekse mønstre av Ca2 + signalering. Denne aktiviteten krever forsiktig og Dyptgående analyser og kvantifisering å fange så mye informasjon om den underliggende hendelser som mulig. Spatial, timelige og intensitet parametere iboende til Ca2 + signaler som frekvens, varighet, overføring, hastighet og amplitude kan gi noen biologiske informasjon kreves for intracellulær signalisere. Høyoppløselig Ca2 + imaging vanligvis resulterer i kjøp av store datafiler som er tidkrevende prosessen i forhold til oversette tenkelig informasjonen i kvantifiserbare data, og denne prosessen kan være utsatt for menneskelig feil og bias. Analyse av Ca2 + signaler fra celler i situ er vanligvis avhengig av enkel intensitet målinger for tilfeldig utvalgte regioner av interesse (ROI) i en synsfelt (FOV). Denne metoden ignorerer mye viktig signalnettverk informasjonen i FOV. Derfor, for å maksimere utvinningen av informasjon fra slike høyoppløselig opptak med Ca2 +fargestoffer eller optogenetic Ca2 + tenkelig, passende romlige og tidsmessige analyse av Ca2 + signaler er nødvendig. Protokollene som beskrevet i denne artikkelen vil beskrive hvordan en stor mengde data kan hentes fra Ca2 + tenkelig opptak til rette mer fullstendig analyse og måling av Ca2 + signaler innspilt fra celler ved hjelp av en kombinasjon av spatiotemporal kart (STM)-basert analyse og partikkel-basert analyse. Protokollene beskriver også hvordan ulike mønstre av Ca2 + signalering observert i ulike celle populasjoner i situ kan analyseres riktig. For illustrasjon, vil metoden undersøke Ca2 + signalering i en spesialisert populasjon av celler i tynntarmen, interstitielle cellene av Cajal (ICC), ved hjelp av GECIs.

Bruke Kit-Cre-GCaMP6F mus (figur 1), dynamiske Ca2 + signalering atferd av ICC i fordøyelsessystemet kan avbildes i situ. Med AC confocal mikroskopi, kan høyoppløselige bilder av spesifikke populasjoner av ICC skaffes uten forurensende signaler fra andre populasjoner av ICC i samme vev men i anatomisk forskjellige nivåer av fokus (figur 2A)37 , 39 ,</s...

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetisk kodet Ca2 + indikatorer (GECIs) har radikalt forandret hvordan i situ Ca2 + imaging utføres. For å maksimere data utvinning fra slike innspillinger, kreves det riktige analyse av Ca2 + signaler. Protokollene i denne utredningen lette kvantifisering av Ca2 + signaler registrert i situ spatiotemporal kartlegging og partikkel-baserte analyser.

Programmer Spatio-temporale kartlegging og partikkel analyseteknikker for å kvantifisere intracellulær Ca2 + signalering i Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Kapasiteten til å skaffe seg store mengder data fra kalsiumavbildningseksperimenter har blitt drastisk forbedret, spesielt med vevsbildeeksperimenter. Protokollene våre beskriver passende analyseteknikker for å kvantifisere og beskrive disse datasettene. Våre protokoller genererer en rekke romlige, timelige og intensitetsverdier som er iboende til kalsiumsignalering i hele vev, og dette kan gå tapt i mer rudimentær-basert analyse.En time før bildebehandling overføre en tynntarm høstet fra en mus med interstitielle celler av Cajal eller ICC som spesifikt uttrykker en genetisk kodet kalsiumindikator til scenen av en spinnende disk confocal mikroskop. Og kontinuerlig perfuse vevet med 37 grader Celsius Krebs-Ringer bikarbonat eller KRB løsning. Ved hjelp av en 60 til 100 X forstørrelse finne stellate-formet myenteric plexus ICC eller ICC-MY mellom sirkulære og langsgående glatte muskellag i tynntarmen.Deretter finner du spindelformet dyp muskuløs plexus ICC eller ICC-DMP i et enkelt plan mellom det sirkulære glatte muskellaget og submukosal plexus og lagre filmene som en stabel med TIFF-bilder. Hvis du vil opprette spatiotemporale kart eller STMs av ICC-DMP kalsiumaktivitet, åpne bildestakken i ImageJ, og klikk Bilde, Type og 32-biters for å endre bildekvaliteten. For å opprette en linje skanning høyreklikk på linjevalgverktøyet og velg segmentert linje.Ved hjelp av enkle venstreklikk tegner du en linje langs midttilgangen til en individuell ICC-DMP, dobbeltklikker når hele cellen er skissert. Velg Bilde, Stabler og Viderelisenser. Et popup-vindu vises.Velg Roter 90 grader for å orientere linjeskanningen fra venstre mot høyre, slik at den kan kalibreres og leses mot tiden på x-aksen med plass på y-aksen og klikke OK. Det spatiotemporale kartet vises. Hvis du vil måle amplituden til kalsiumsignalene fra kartet nøyaktig, velger du rektangulært utvalg og tegner et interesseområde rundt området innenfor STM som viser det mest ensartede og minst intense fluorescensområdet. Klikk Analyser og Histogram for å få en gjennomsnittsverdi for intensiteten i det valgte interesseområdet, og klikk Rediger, Valg, Velg alle for å velge hele STM.Deretter klikker du Prosess, Matematikk og Del og angir gjennomsnittsverdien for intensiteten med det valgte STM-området av interesse i popup-boksen. STM blir svart. Korriger dette ved å klikke på Bilde, Juster, Lysstyrke/kontrast og Auto i popup-vinduet.Linjeskanningen vil nå bli kalibrert for amplituden med intensiteten av fluorescensen uttrykt som fluorescensen delt av null fluorescens. STM viser antall rammer i TIFF-stakken på x-aksen og antall piksler som representerer lengden på cellen på y-aksen. For å kvantifisere de timelige og romlige dataene fra kalsiumsignalene, klikk på Bilde og egenskaper og skriv inn de riktige verdiene for å kalibrere STM for plass og tid i popup-vinduet.Hvis du vil analysere de enkelte kalsiumhendelsene, klikker du Rett linje og klikker og drar på STM for å tegne en rett horisontal linje gjennom midten av en kalsiumhendelse parallelt med x-aksen. Klikk deretter Analyser og Plottprofil. En boks vises som viser plottprofilen til kalsiumhendelsen.For partikkelbasert analyse av ICC-MY kalsiumsignaldata, åpne filmfilen i Volumetry og høyreklikk for å velge STK Filter, Differensier. Høyreklikk på nytt for å skrive inn en verdi for å skille. Trykk Enter og venstreklikk for å starte differensieringen.Hvis du vil opprette partikler, bruker du den midterste museknappen til å bla gjennom filmen til å velge en 20 til 40 rammedel som inneholder en quiescent periode, etterfulgt av forekomsten av en kalsiumtransient klynge og 20 til 40 rammer som følger rett etter klyngen. Når alle rammene er valgt høyreklikk i filmvinduet for å få tilgang til STK OPS Ramp DS partikkelinfo og klikk for å kjøre en partikkelanalyse rutine som gradvis ramper terskelen fra maksimum til minimum intensitet. For å sikre en vellykket partikkelanalyse må du sørge for at du innlemmer så mye pre-kalsiumtransient klynge ikke-aktivitet, og så mye post-kalsium forbigående klynge ikke-aktivitet som du kan.Dette vil bidra til å øke signal-til-støy-forholdet. Analysen vises grafisk i plottvinduet som støyplott og i sporvinduet som tre fargespor med det grønne sporet som representerer antall partikler, det røde sporet som representerer den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen og det blå sporet som representerer den absolutte intensitetsterskelen. For å histogrammet balansere plottet av partikkelstøy trykk H på tastaturet.Trykk deretter på høyre braketttast for å bla gjennom fargevalg til bakgrunnen er hvit med fargesporene på toppen. Trykk F på tastaturet én gang for å få opp et måleverktøy. Trykk deretter F en gang til for å merke en enkelt loddrett linje i rullefeltet i sporvinduet på plottet i krysset der de fargede plottene begynner å skifte til høyre.I sporvinduet bruker du den midterste museknappen til å bla fra bøyningspunktet for den røde sporingen til den merkede hvite loddrette linjen. Når du har merket deg det viste Y-gjennomsnittet, klikker du på den midterste museknappen igjen inne i sporvinduet for å fjerne merket for den blå sporingen. Klikk C i filmvinduet for å få opp et fargehjul, og D for å justere terskelen.Gyldige partikler vil nå bli vist i rødt, og de som metter vil være hvite. Bruk venstre museknapp til å bla til de hvite områdene er fjernet, og bruk den midterste museknappen til å justere den gule numeriske verdien i fargehjulet til Y-gjennomsnittsverdien for å tilordne alt i rødt som en aktiv kalsiumtransient partikkel ved det bestemte terskelpunktet. Hvis du vil lagre dataene som en koordin-basert partikkelfil, høyreklikker du for å få tilgang til STK 3D, lagre partikkel null og venstreklikk for å lagre filen.For å lage partikkelaktivitet varmekart åpne den lagrede partikkelfilen og høyreklikk i filmvinduet for å få tilgang til partikkel STKops, StatMap Flag og skriv inn flaggtilordninger for å analysere. Klikk for å bruke analysen og et varmekart som viser de totale partiklene for hele opptakslengden med forskjellige farger som representerer prosentforekomsten gjennom hele opptaket. Høyreklikk for å lagre varmekartet som en TIFF-fil.Høyreklikk deretter i filmvinduet for å få tilgang til partikkelmål, partikkelstatistikk STK er lik, og skriv inn en flaggtilordning for analysen. En rekke spor genereres i sporingsvinduet. STM-analyse gir muligheten til å overvåke og registrere de romlige egenskapene til kalsiumsignalering, for eksempel romlig spredning og forplantningshastighet.Denne informasjonen kan være samlet for å gi en ganske fullstendig visning av kalsiumsignaleringsatferd i celler i sine opprinnelige miljøer. Ved hjelp av partikkelanalyse kan kvantitativ informasjon om kalsiumsignalering beregnes ved å måle partikkelområdet og partikkeltellingen, som til sammen kan brukes til å bestemme de romlige områdene for kalsiumsignalaktivering innenfor et spesifisert synsfelt. Partikkelanalyse tillater også inngående kvantifisering av subcellulær kalsiumsignalering gjennom undersøkelse av plasseringen og avfyring av sannsynlighetene for kalsiumavfyringssteder.Ved å tildele partiklene i forskjellige flagg basert på deres timelige egenskaper, kan de initierende partiklene kartlegges nøyaktig. Og et vell av harde data ervervet på antall initieringssteder, størrelsen på nettstedet i piksler og mikrometer, sannsynligheten for at hvert initieringssted skyter enten en eller flere ganger under hver kalsiumtransient klynge, og prosentandelen av avfyringssteder som brann under hver kalsiumtransient klyngesyklus kan oppnås. Konsistens er nøkkelen til suksess i denne protokollen.Alle datasett og alle filmer må behandles nøyaktig det samme for å sikre pålitelige, repeterbare resultater. Dette gjelder spesielt når du arbeider med partikkelfiler. Våre protokoller tillater en dyp karakterisering av kalsiumsignalering in situ, og en rekke statistiske metoder, når de brukes riktig, kan vurdere forskjeller mellom en rekke romlige og timelige parametere.Disse analyseteknikkene i vår protokoll har gjort det mulig for forskere å stille og svare på tidligere utiladresserbare spørsmål knyttet til intestinal pacemaking, og tarminsolasjon, samt nevronal kontroll av nedre urinveier.

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualisering av Vaskulær Ca 2 + Signaling Utløst av parakrine Avledet ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Fysisk Kartlegging av kromosomer som bruker Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of epitelial-mesenchymale signaleringsprotokoll Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Måling Intracellulær Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Endring i Menneskelig Sperm bruker Fire Teknikker: Konvensjonell fluorometri, Stoppet Flow fluorometri, flowcytometrisystemer og Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse av mRNA molekyler med fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automatisert analyse av Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaler i bildesekvenser

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

To-foton avbildning av intracellulær Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Håndtering og nitrogenoksid produksjon i endotel og glatte muskelceller av en isolert Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optisk Kartlegging av Intra-sarkoplasmatisk retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Og transmembranpotensiale i Langendorff-perfusert Rabbit Hjerte

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-partikkel Analyse for Super-oppløsning Mikroskopi med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...