Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Financiamento foi fornecido pelo NIDDK, através de DK41315 P01.

Todos os animais utilizados e os protocolos realizados neste estudo estão de acordo com os institutos nacionais de guia da saúde para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de cuidados na Universidade de Nevada, Reno e uso institucional do Animal.
1. geração de ratos KitGCaMP6f
<ol><li>Cruz Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f ratos) e c-Kit+ / Cre-ERT2 (Kit-Cre ratos) para gerar o ICC específicos GCaMP6f expressando animais...

CA2 + imagem de tipos específicos de células em tecidos intactos ou dentro de redes de células, muitas vezes revela padrões complexos de transientes de Ca2 + . Esta atividade requer cuidadosa e detalhada análise e quantificação de capturar o máximo de informação possível sobre os eventos subjacentes e cinética destes eventos. STM e análise PTCL fornecem uma oportunidade para maximizar a quantidade de dados quantitativos, resultantes das gravações deste tipo.
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CA2 + é um mensageiro intracelular onipresente que controla uma grande variedade de processos celulares, tais como músculo contração1,2, metabolismo3, célula proliferação3,4, factores de 5, estimulação da liberação de neurotransmissores no nervo terminais6,7e a ativação da transcrição no núcleo. 7 intracelular Ca2 + sinais muitas vezes tomam a forma de elevações transientes em citosólico Ca2 +, e estas podem ser espontâneos ou decorrentes de estimulação agonista, dependendo do tipo de célula8. Espacial, temporal e intensidade parâmetros intrínsecos ao Ca2 + sinais, tais como frequência, duração, propagação, velocidade e amplitude podem fornecer as informações biológicas necessárias para sinalização intracelular5, 7 , 9. citoplasmática Ca2 + sinais podem resultar do influxo de Ca2 + do espaço extracelular ou via Ca2 + lançamento do retículo endoplasmático (ER) através de canais de Ca2 + lançamento como receptores de ryanodine (RyRs) e receptores de inositol-tri-fosfato (IP3Rs)10. RyRs e IP3Rs podem contribuir para a geração de sinais de Ca2 + e a abertura concertada destes canais, o que combinado com vários Ca2 + influxo mecanismos pode resultar em uma miríade de Ca2 + padrões de sinalização que são formados pelos números e abrir a probabilidade de Ca2 + influxo canais, o perfil de expressão deCa 2 + lançamento canais, a proximidade entre o influxo de Ca2 + e canais de liberação e expressão e distribuição de Ca2 + proteínas recaptação e extrusão. CA2 + sinais podem assumir a forma de uniforme, duradouro, oscilações de alta intensidade global que pode durar vários segundos ou até minutos, propagação intracelulares e intercelulares Ca2 + ondas que podem atravessar distâncias intracelulares mais de 100 µm10,11,12,13,14,15,16, ou mais breves, espacialmente localizados eventos tais como Ca2 + sparks e Ca2 + sopros que ocorrem em dezenas de milissegundos prazos e espalhar a menos de 5 µm17,18,19,20.
Microscopia fluorescente tem sido usada amplamente para monitorar Ca2 + sinalização em células isoladas e cultivadas e em tecidos intactos. Tradicionalmente, estas experiências envolveram o uso de Ca2 + indicadores fluorescentes, ratiometric e não-ratiometric corantes como Fura2, Fluo3/4 ou Rhod2, entre outros 21,22,23. Estes indicadores foram projetados para ser permeável para as membranas celulares e depois ficam presos em células pela clivagem de um grupo éster via endógenas esterases. Vinculação de Ca2 + para os indicadores de alta afinidade causou mudanças na fluorescência quando as células e tecidos foram iluminados pelo apropriado comprimentos de onda da luz. O uso de célula permeável Ca2 + indicadores bastante reforçada a nossa compreensão de Ca2 + permitido resolução espacial e quantificação destes sinais que não era possível pela análise do Ca2 + sinais e sinalização em células vivas através de outros meios, tais como a eletrofisiologia. No entanto, o tradicional Ca2 + indicadores têm várias limitações, tais como fotobranqueamento que ocorre ao longo de períodos de gravação estendida24. Enquanto o indicador de Ca2 + novo corantes tais como Cal520/590 têm sinal melhorou muito a índices de ruído e a capacidade de detectar o local Ca2 + sinais25, problemas com o fotobranqueamento permanecem uma preocupação para alguns investigadores 26de27,,28. Fotobranqueamento precipitado também restringe a ampliação, a taxa de aquisição de imagem, e a resolução que pode ser usada para gravações, como o aumento de potência objectivo e taxas mais elevadas de aquisição de imagem exigem aumento de intensidade de luz de excitação que aumenta o fotobranqueamento.
Estas limitações do tradicional Ca2 + indicador corantes são exacerbados durante a gravação de Ca2 + sinais no local, por exemplo quando gravação intracelular Ca2 + sinais de tecidos intactos. Devido aos problemas acima, visualização de Ca2 + sinais em situ usando célula permeável Ca2 + indicadores tem sido limitada a ampliação de baixa potência e reduzidas taxas de captura de imagem, restringindo a capacidade de investigadores para gravar e quantificar o temporal ou espacialmente restrita subcellular Ca2 + sinais. Assim, tem sido difícil de capturar, analisar e apreciar a complexidade espacial e temporal de Ca2 + sinais, que pode ser importante na geração de respostas biológicas desejadas, conforme descrito acima. Análise de Ca2 + sinais de células no local normalmente se baseia em medições de intensidade simples de regiões selecionadas de interesse (ROI) dentro de um campo de visão (FOV). A escolha arbitrária do número, tamanho e posição de ROIs, dependentes do capricho do pesquisador, severamente pode influenciar os resultados obtidos. Assim como a tendência inerente com análise ROI, esta abordagem ignora grande parte da importante sinalização informação contida o FOV, como dinâmico Ca2 + eventos dentro de um arbitrariamente escolhida ROI são selecionados para análise. Além disso, a análise de ROIs falha fornecer informações sobre as características espaciais dos Ca2 + sinais observados. Por exemplo, pode não ser possível distinguir entre um aumento de Ca2 + resultante da propagação de uma onda de Ca2 + e um altamente localizadas Ca2 + liberam o evento de tabulações de Ca2 + sinais dentro de um ROI.
O advento da geneticamente codificado Ca2 + indicadores (GECIs) mudou radicalmente como Ca2 + imagem latente pode ser realizada em situ29,30,31,32,33 . Existem várias vantagens em usar GECIs sobre corantes. O mais importante talvez seja que a expressão de Lino pode ser executada de maneira específica de célula, que reduz a contaminação de fundo indesejados de células não turísticos. Outra vantagem do GECIs sobre indicadores de Ca2 + tradicionais é aquele fotobranqueamento é reduzido (como fluorescência e, consequentemente, fotobranqueamento só ocorre quando as células são ativas), em comparação com espécimes de corante-carregado, particularmente em alta ampliação e altas taxas de imagem capturam34. Assim, imagem latente com GECIs, tais como a série GCaMP de sensores optogenetic, proporciona a investigadores a capacidade de gravar breve, localizadas sub celular Ca2 + sinais em situ e investigar Ca2 + sinalização em células dentro deles ambientes nativos que não tem sido possíveis anteriormente. Para maximizar a recuperação de informações de tais gravações de alta resolução, análise espacial e temporal adequada dos sinais de Ca2 + é necessária. Deve-se notar que, enquanto o GECIs podem oferecer que algumas claras vantagens, estudos recentes têm revelado que Ca2 + imagem latente pode ser realizada com sucesso de grandes populações de diferentes classes neuroquímicas dos neurônios simultaneamente usando convencional CA2 + indicadores que não são geneticamente codificados para o animal,35. Esta abordagem usado post hoc imuno-histoquímica para revelar várias classes diferentes de neurônios disparando em alta frequência em rajadas sincronizadas e evitou o potencial que as modificações genéticas para o animal podem ter interferido com o fisiológico comportamento, o investigador procura entender35,36.
Os protocolos descritos neste trabalho facilitam a análise mais completa e quantificação de Ca2 + sinais gravado a partir de células no local usando uma combinação de mapa spatiotemporal (STM)-com base em análise e análise baseada em partículas. Os protocolos também descrevem como diferentes padrões de Ca2 + sinalização observados em células diferentes populações in situ podem ser analisadas de forma adequada. Para ilustração, o método examinará Ca2 + sinalização em uma população especializada de células no intestino, células intersticiais de Cajal (ICC). ICC são células especializadas no trato gastrointestinal (GI) que apresentam dinâmica intracelular Ca2 + sinalização, como visualizado utilizando camundongos expressando GCaMPs37,38,39,40, 41,,42. Transientes de CA2 + no ICC estão ligados à ativação de Ca2 +-ativado Cl– canais (codificados por Ano1) que são importantes na regulação da excitabilidade do músculo de liso intestinal células (SMCs)43, 44,,45. Assim, o estudo de Ca2 + sinalização em ICC é fundamental para a compreensão da motilidade intestinal. O intestino delgado murino oferece um excelente exemplo para esta demonstração, como existem duas classes de ICC que estão anatomicamente separadas e podem ser visualizadas de forma independente: eu) ICC estão localizados na área entre o músculo liso circular e longitudinal camadas, em torno do Plexo mioentérico (ICC-MY). Estas células servem como as células do marcapasso e geram a atividade elétrica conhecida como ondas lentas46,,47,,48,49; II) ICC também estão localizados entre um plexo rico nos terminais dos neurônios motores (plexo muscular profunda, assim, ICC-DMP). Estas células servem como mediadores das respostas a neurotransmissão motor entérica37,39,40,50. ICC-MY ICC-DMP são morfologicamente distintos e seus Ca2 + sinalização comportamentos radicalmente diferem para realizar suas tarefas específicas. ICC-MY são estreladas em forma e formar uma rede de células interconectadas através de lacuna entroncamentos51,52. CA2 + sinais em ICC-MY manifesto como breves e espacialmente localizados Ca2 + lançamento eventos que ocorrem em vários locais de forma assíncrona, através da rede de ICC-MY como visualizado dentro um FOV (fotografada com um objetivo X 60)38. Estes sinais assíncronos são organizados temporalmente em 1 segundo de clusters que, quando juntos, tabulados, elevar-se a um líquido 1 s celular aumento de Ca2 +. Estes sinais propagam de célula para célula dentro da rede da ICC e, portanto, organizam Ca2 + sinalização, gerados a partir de sites sub celulares, em uma tecido grande Ca2 + onda. Temporal de clustering e soma de Ca2 + sinais em ICC-MY foi denominado Ca2 + aglomerados transitória (CTC)38. CTC ritmicamente ocorre (por exemplo, é bastante semelhantes durações e períodos semelhantes entre CTC) 30 vezes por minuto no mouse. Por outro lado, ICC-DMP são células fusiformes em forma, alguns com processos secundários, que distribuem entre SMCs e processos nervosos varizes e não independentemente formam uma rede51,52. ICC-DMP forma junções com SMCs, no entanto e função dentro deste sincício maior, conhecido como o SIP sincício53. CA2 + sinais ocorrem em vários locais ao longo dos comprimentos de células, mas estes transientes não são arrastados ou temporalmente em cluster, como observado no ICC-MY37. CA2 + sinais no ICC-DMP ocorrem de forma estocástica, com intensidade variável, durações e características espaciais. Os protocolos abaixo, usando o exemplo do Ca2 + sinalização no ICC-MY e ICC-DMP, descrever técnicas para analisar a complexa sinalização em tipos específicos de células no local. Utilizamos o sistema de p Cre-Lox inducible para expressar GCaMP6f exclusivamente no ICC, após provocar a ativação da Cre Recombinase (Cre) conduzido por um promotor específico de ICC (Kit).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

CA2 + imagens de células isoladas ou tipos específicos de células dentro de tecidos intactos, muitas vezes revela padrões complexos de Ca2 + sinalização. Esta atividade requer cuidadosa e detalhada análise e quantificação de capturar o máximo de informação possível sobre os eventos subjacentes. Espacial, temporal e intensidade parâmetros intrínsecos ao Ca2 + sinais, tais como frequência, duração, propagação, velocidade e amplitude podem fornecer algumas informações biológicas necessárias para sinalização intracelular. De alta resolução Ca2 + imagem normalmente resultados na aquisição de grandes arquivos de dados que são demorados para processo em termos de traduzir as informações de imagem em dados quantificáveis e este processo pode ser suscetível a preconceitos e erro humano. Análise de Ca2 + sinais de células no local normalmente se baseia em medições de intensidade simples de arbitrariamente selecionadas regiões de interesse (ROI) dentro de um campo de visão (FOV). Esta abordagem ignora grande parte das informações de sinalização importantes contidas no FOV. Assim, a fim de maximizar a recuperação de informações de tais gravações de alta resolução obtidas com Ca2 +corantes ou optogenetic Ca2 + análise espacial e temporal de imagens, o caso dos sinais de Ca2 + é necessária. Os protocolos descritos neste artigo vou descrever como um alto volume de dados pode ser obtido de Ca2 + imagem gravações para facilitar a mais completa análise e quantificação de Ca2 + sinais gravado a partir de células usando uma combinação de mapa spatiotemporal (STM)-com base em análise e análise baseada em partículas. Os protocolos também descrevem como diferentes padrões de Ca2 + sinalização observados em células diferentes populações in situ podem ser analisadas de forma adequada. Para ilustração, o método examinará Ca2 + sinalização numa população de células no intestino, células intersticiais de Cajal (ICC), usando o GECIs especializada.

Usando ratos Kit-Cre-GCaMP6F (Figura 1), dinâmica Ca2 + sinalização de comportamentos de ICC no trato gastrointestinal podem ser fotografados no local. Com microscopia confocal, imagens de alta resolução de populações específicas de ICC podem ser adquiridas sem contaminar os sinais de outras populações de ICC dentro do mesmo tecido mas em planos anatomicamente distintos do foco (Figura 2A)37...

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Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2 + indicadores geneticamente codificados (GECIs) mudaram radicalmente como in situ Ca2 + imagem é executada. Para maximizar a recuperação de dados de tais gravações, a análise adequada dos sinais de Ca2 + é necessária. Os protocolos neste papel facilitam a quantificação de Ca2 + sinais gravados em situ usando spatiotemporal mapeamento e análise baseada em partículas.

Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca2 + sinalização em Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

A capacidade de adquirir grandes quantidades de dados de experimentos de imagem de cálcio melhorou drasticamente, especialmente com experimentos de imagem tecidual. Nossos protocolos descrevem técnicas de análise apropriadas para quantificar e descrever esses conjuntos de dados. Nossos protocolos geram uma gama de valores espaciais, temporais e de intensidade que são intrínsecos à sinalização de cálcio em tecidos inteiros e isso pode ser perdido em análises mais rudimentares.Uma hora antes da transferência de imagem, um intestino delgado colhido de um rato com células intersticiais de Cajal ou ICC que expressam especificamente um indicador de cálcio geneticamente codificado para o estágio de um microscópio confocal de disco giratório. E perfundir continuamente o tecido com 37 graus Celsius Biocarbonato Krebs-Ringer ou solução KRB. Usando uma ampliação de 60 a 100 X localize o plexo mienterico em forma de stellate ICC ou ICC-MY entre as camadas musculares suaves circulares e longitudinais do intestino delgado.Em seguida, localize o plexo muscular profundo em forma de fuso ICC ou ICC-DMP em um único plano entre a camada muscular suave circular e o plexo submucosal e salve os filmes como uma pilha de imagens TIFF. Para criar mapas espátulais ou STMs da atividade de cálcio ICC-DMP abra a pilha de imagens no ImageJ e clique em Imagem, Tipo e 32 bits para modificar a qualidade da imagem. Para criar uma varredura de linha clique com o botão direito do mouse na ferramenta de seleção de linhas e selecione linha segmentada.Usando cliques únicos à esquerda, desenhe uma linha ao longo do acesso médio de um ICC-DMP individual, clicando duas vezes quando toda a célula foi delineada. Selecione Imagem, Pilhas e Reslice. Uma janela pop-up aparecerá.Selecione Girar 90 graus para orientar a varredura de linha da esquerda para a direita para que possa ser calibrada e ler contra o tempo no eixo x com espaço no eixo y e clique em OK. O mapa espacial aparecerá. Para medir com precisão a amplitude dos sinais de cálcio do mapa, selecione a seleção retangular e desenhe uma região de interesse ao redor da área dentro do STM que exibe a área mais uniforme e menos intensa de fluorescência. Clique em Analisar e Histograma para obter um valor médio da intensidade dentro da região de interesse selecionada e clique em Editar, Selecionar Tudo para selecionar todo o STM.Em seguida, clique em Process, Math e Divide e digite o valor médio da intensidade com a região stm selecionada de interesse na caixa pop-up. O STM vai ficar preto. Corrija isso clicando em Imagem, Ajuste, Brilho/Contraste e Auto na janela pop-up.A varredura da linha será agora calibrada para a amplitude com a intensidade da fluorescência expressa como a fluorescência dividida pela fluorescência zero. O STM exibirá o número de quadros na pilha TIFF no eixo x e o número de pixels que representam o comprimento da célula no eixo y. Para quantificar os dados temporais e espaciais dos sinais de cálcio clique em Imagem e Propriedades e insira os valores apropriados para calibrar totalmente o STM para espaço e tempo na janela pop-up.Para analisar os eventos individuais de cálcio clique em Linha Reta e clique e arraste no STM para desenhar uma linha horizontal reta através do centro de um evento de cálcio paralelo ao eixo x. Em seguida, clique em Analisar e Traçar perfil. Uma caixa aparecerá mostrando o perfil da trama do evento de cálcio.Para análise baseada em partículas dos dados de sinalização de cálcio ICC-MY, abra o arquivo de filme em Volumetry e clique com o botão direito do mouse para selecionar O Filtro STK, Diferencie. Clique com o botão direito do mouse novamente para inserir um valor para diferenciar. Pressione Enter e clique à esquerda para iniciar a diferenciação.Para criar partículas, use o botão do mouse do meio para percorrer o filme para selecionar uma seção de 20 a 40 quadros que inclui um período quiescente, seguido pela ocorrência de um cluster transitório de cálcio e 20 a 40 quadros que seguem logo após o cluster. Quando todos os quadros tiverem sido selecionados com o botão direito do mouse na janela do filme para acessar informações de partículas STK OPS Ramp DS e clique para executar uma rotina de análise de partículas que aumenta progressivamente o limiar do máximo para a intensidade mínima. Para garantir uma análise bem sucedida de partículas, certifique-se de incorporar o máximo de não-atividade de cluster transitório pré-cálcio e o máximo de não-atividade de cluster transitório pós-cálcio que puder.Isso ajudará a aumentar a relação sinal-ruído. A análise será exibida graficamente na janela da parcela como enredo de ruído e na janela de traços como três traços de cor com o traço verde representando o número de partículas, o traço vermelho representando o tamanho médio da partícula, e o traço azul representando o limiar de intensidade absoluta. Para equilibrar o gráfico de ruído de partículas pressione H no teclado.Em seguida, pressione a tecla de suporte direito para percorrer esquemas de cores até que o fundo esteja branco com os traços de cor na parte superior. Pressione F no teclado uma vez para trazer uma ferramenta de medição. Em seguida, pressione F uma segunda vez para marcar uma única linha vertical na barra de rolagem da janela de traços na trama no cruzamento onde as parcelas coloridas começam a mudar para o lado direito.Dentro da janela de traços use o botão do mouse do meio para rolar do ponto de inflexão do traço vermelho para a linha vertical branca marcada. Depois de notar a média Y exibida, clique novamente no botão do mouse do meio dentro da janela de traços para desmarcar o traço azul. Na janela do filme clique em C para trazer uma roda colorida e D para ajustar o limiar.Partículas válidas serão agora mostradas em vermelho, e aquelas que saturam serão brancas. Use o botão do mouse esquerdo para rolar até que as áreas brancas sejam removidas e use o botão do mouse médio para ajustar o valor numérico amarelo na roda de cor ao valor médio de Y para atribuir tudo em vermelho como uma partícula transitória de cálcio ativa no ponto de limiar determinado. Para salvar os dados como um arquivo de partículas baseado em coordenadas clique com o botão direito do mouse para acessar o STK 3D, salve a partícula zero e clique à esquerda para salvar o arquivo.Para criar mapas de calor de atividade de partículas abra o arquivo de partículas salvo e clique com o botão direito do mouse na janela do filme para acessar STKops de partículas, StatMap Flag e digitar atribuições de bandeira para analisar. Clique para aplicar a análise e um mapa de calor mostrando as partículas totais para todo o comprimento da gravação com cores diferentes representando a porcentagem de ocorrência ao longo do registro. Clique com o botão direito do mouse para salvar o mapa de calor como um arquivo TIFF.Em seguida, clique com o botão direito do mouse na janela do filme para acessar a medida de partículas, as estatísticas de partículas STK são iguais e digite uma atribuição de bandeira para a análise. Uma série de vestígios serão gerados na janela de rastreamento. A análise stm fornece a capacidade de monitorar e registrar as características espaciais da sinalização de cálcio, como a propagação espacial e a velocidade de propagação.Essas informações podem ser acumuladas para fornecer uma visão bastante completa dos comportamentos de sinalização de cálcio dentro das células em seus ambientes nativos. Por meio da análise de partículas, informações quantitativas sobre a sinalização de cálcio podem ser calculadas medindo a área de partículas e a contagem de partículas, que juntas podem ser usadas para determinar as faixas espaciais de ativação de sinal de cálcio dentro de um campo de visão especificado. A análise de partículas também permite a quantificação aprofundada da sinalização subcelular de cálcio através do exame do local e das probabilidades de disparo de locais de disparo de cálcio.Ao alocar as partículas em diferentes bandeiras com base em suas características temporais, as partículas iniciantes podem ser mapeadas com precisão. E uma riqueza de dados concretos adquiridos sobre o número de locais de iniciação, o tamanho do site em pixels e micrômetros, a probabilidade de cada local de iniciação disparar uma ou várias vezes durante cada aglomerado transitório de cálcio, e a porcentagem de locais de disparo que disparam durante cada ciclo de cluster transitório de cálcio podem ser obtidos. Consistência é a chave para o sucesso neste protocolo.Todos os conjuntos de dados e todos os filmes devem ser tratados exatamente da mesma forma para garantir resultados confiáveis e repetíveis. Isso é especialmente verdade quando se lida com arquivos de partículas. Nossos protocolos permitem uma caracterização profunda da sinalização de cálcio in situ, e uma série de métodos estatísticos, quando usados adequadamente, podem avaliar diferenças entre uma gama de parâmetros espaciais e temporais.Essas técnicas de análise em nosso protocolo permitiram que os pesquisadores fizessem e respondessem perguntas antes não abordadas relacionadas ao ritmo intestinal e à inervação intestinal, bem como ao controle neuronal do trato urinário inferior.

Research

JoVE Journal

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