Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Финансирование было предоставлено NIDDK, через P01 DK41315.

Все животные и протоколы, в этом исследовании были в соответствии с национальных институтов здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных. Все процедуры были утверждены Комитетом правомерного использования животных и уход на Университет Невады в Рено.</...

CA2 + изображений конкретных типов клеток в пределах нетронутыми тканей или сети клеток часто показывает сложные узоры Ca2 + транзиентов. Эта деятельность требует тщательного и углубленного анализа и количественной оценки, чтобы захватить столько информации об основных событ...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

CA2 + изображений изолированных клеток или определенные типы клеток в неповрежденной ткани часто показывает сложные узоры Ca2 + сигнализации. Эта деятельность требует тщательного и углубленного анализа и количественной оценки, чтобы захватить как можно больше информации об основных событиях как можно скорее. Пространственных, временных и интенсивности параметров присущих Ca2 + сигналов, таких как частота, продолжительность, распространения, скорости и амплитуды может предоставить некоторые биологические информацию, необходимую для внутриклеточной сигнализации. Высоким разрешением Ca2 + обычно визуализации результатов в приобретении данных большого размера файлов, которые отнимают много времени процесса с точки зрения перевода изображений информации в количественные данные, и этот процесс может быть восприимчивым к человеческой ошибки и предвзятости. Анализ Ca2 + сигналов от клеток на месте обычно основывается на простой интенсивности измерения из произвольно выбранных областей интереса (ROI) в поле зрения (FOV). Этот подход игнорирует большую часть важных сигналов информацию, содержащуюся в ПЗ. Таким образом чтобы максимизировать восстановления информации из такого высокого разрешения записи, полученные с Ca2 +красителей или optogenetic Ca2 + требуется изображений, соответствующих пространственных и временных анализ Ca2 + сигналов. Протоколы, изложенных в настоящем документе будет описывать, как можно получить большой объем данных от Ca2 + изображений записи для облегчения более полный анализ и количественная оценка Ca2 + сигналов, записанная из клеток, используя комбинацию пространственно-временных карта (СТМ)-на основе анализа и анализа на основе частиц. Протоколы также описывают как различные модели Ca2 + сигнализации наблюдаемых в различных клеток, которые население на местах могут быть проанализированы надлежащим образом. Для иллюстрации, метод будет проверять Ca2 + сигнализации в специализированных популяции клеток в тонком кишечнике, интерстициальных клеток Кахаля (МУС), с помощью GECIs.

С помощью мыши Kit-Cre-GCaMP6F (рис. 1), динамические Ca2 + сигнализации что поведение ICC в желудочно-кишечном тракте может отражаться на месте. С помощью конфокальной микроскопии изображения с высоким разрешением конкретных популяций МУС могут быть приобр...

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Генетически закодированный Ca2 + показателей (GECIs) радикально изменили как на месте Ca2 + изображения производится. Для максимального восстановления данных от таких записей, необходим соответствующий анализ Ca2 + сигналов. Протоколы в настоящем документе облегчить количественную оценку Ca2 + сигналов, записанная на месте с помощью пространственно-временных сопоставления и анализа на основе частиц.

Приложения пространственно временных карт и методы анализа частиц для количественного определения внутриклеточных Ca2 + сигнализации в Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Способность приобретать большие объемы данных в ходе экспериментов по визуализации кальция значительно улучшилась, особенно в ходе экспериментов по визуализации тканей. Наши протоколы описывают соответствующие методы анализа для количественной оценки и описания этих наборов данных. Наши протоколы генерируют целый ряд пространственных, временных и интенсивности значений, которые присущи сигнализации кальция в целых тканях, и это может быть потеряно в более элементарном анализе.За час до передачи изображения тонкой кишки, собранной из мыши с интерстициальными клетками Cajal или ICC, которые специально выражают генетически закодированный индикатор кальция на стадию вращающегося конфокального микроскопа диска. И непрерывно пронизывают ткани с 37 градусов по Цельсию Кребс-Рингер бикарбонат или KRB раствор. С помощью увеличения от 60 до 100 X найдите stellate-образное миентическое сплетение ICC или ICC-MY между круговыми и продольными гладкими мышечными слоями тонкой кишки.Затем найдите шпиндель-образное глубокое мышечное сплетение ICC или ICC-DMP в одной плоскости между круглым гладким мышечным слоем и подмукозаным сплетением и сохраните фильмы в качестве стопки изображений TIFF. Для создания spatiotemporal карты или STMs активности кальция ICC-DMP открыть стек изображения в ImageJ, и нажмите Изображение, Тип и 32-битный изменить качество изображения. Чтобы создать сканирование строки, нажмите правой кнопкой мыши на инструмент выбора строки и выберите сегментированную линию.Используя одиночные левые щелчки, провести линию вдоль среднего доступа отдельного ICC-DMP, дважды нажав, когда вся ячейка была изложена. Выберите изображение, стеки и reslice. Появится всплывающее окно.Выберите Поверните на 90 градусов, чтобы сориентировать сканирование линии слева направо, чтобы его можно было откалибровать и прочитать со временем на х-оси с пространством на оси и нажмите OK. Появится spatiotemporal карта. Чтобы точно измерить амплитуду сигналов кальция с карты, выберите прямоугольный выбор и нарисуйте область интереса вокруг области в STM, которая отображает наиболее равномерной и наименее интенсивной области флуоресценции. Нажмите Анализ и Гистограмма, чтобы получить среднее значение интенсивности в выбранной области интереса и нажмите Редактировать, Выбор, Выберите все, чтобы выбрать весь STM.Далее нажмите Process, Math and Divide и введите среднее значение интенсивности с выбранной областью STM, представляющим интерес для всплывающего окна. STM почернеет. Исправь это, нажав изображение, настроить, яркость / контрастность, и авто во всплывающем окне.Сканирование линии теперь будет откалиброваться для амплитуды с интенсивностью флуоресценции, выраженной как флуоресценция, разделенная нулевой флуоресценцией. STM будет отображать количество кадров в стеке TIFF на оси x и количество пикселей, представляющих длину ячейки на оси y. Для количественной оценки временных и пространственных данных из сигналов кальция нажмите Изображение и Свойства и введите соответствующие значения, чтобы полностью откалибровать STM для пространства и времени во всплывающем окне.Чтобы проанализировать отдельные события кальция нажмите Прямая линия и нажмите и перетащите на STM, чтобы нарисовать прямую горизонтальную линию через центр кальция событие параллельно x-оси. Затем нажмите Анализ и Участок профиля. Появится коробка, показывающая профиль сюжета события кальция.Для анализа данных сигнализации кальция ICC-MY на основе частиц откройте файл фильма в Volumetry и нажмите правой кнопкой мыши, чтобы выбрать STK Filter, Differentiate. Нажмите правой кнопкой мыши еще раз, чтобы ввести значение, чтобы дифференцировать. Нажмите Введите и левым щелчком мыши, чтобы инициировать дифференциацию.Чтобы создать частицы, используйте среднюю кнопку мыши, чтобы прокрутить фильм, чтобы выбрать от 20 до 40 раздел кадра, который включает в себя период тихие, а затем появление переходного кластера кальция и от 20 до 40 кадров, которые следуют сразу после кластера. Когда все кадры были выбраны правой кнопкой мыши в окне фильма, чтобы получить доступ к информации частиц STK OPS Ramp DS и нажмите, чтобы запустить процедуру анализа частиц, которая постепенно увеличивает порог от максимальной до минимальной интенсивности. Чтобы обеспечить успешный анализ частиц, убедитесь, что вы включаете столько до кальция переходных кластера не-активности, и столько пост-кальция переходных кластера не активности, как вы можете.Это поможет повысить соотношение сигнала к шуму. Анализ будет отображаться графически в окне участка как участок шума и в окне следов, как три цветовых следа с зеленым следом, представляющим количество частиц, красный след, представляющий средний размер частицы, и синий след, представляющий абсолютный порог интенсивности. Для того чтобы гистограмма балансирует график шума частицы нажимает H на клавиатуре.Затем нажмите на правый ключ кронштейна, чтобы цикл через цветовые схемы, пока фон белый со следами цвета на вершине. Нажмите F на клавиатуре один раз, чтобы воспитывать измерительный инструмент. Затем нажмите F во второй раз, чтобы отметить одну вертикальную линию в строке прокрутки окна следов на участке на перекрестке, где цветные участки начинают смещаться в правую сторону.В окне следов используйте среднюю кнопку мыши для прокрутки от точки перегиба красного следа до отмеченной белой вертикальной линии. После записи отображается Y среднем, нажмите среднюю кнопку мыши снова внутри окна следов, чтобы отбирать синий след. В окне фильма нажмите C, чтобы принести цветовое колесо, и D, чтобы настроить порог.Действительные частицы теперь будут показаны красным цветом, а те, которые насыщаются, будут белыми. Используйте левую кнопку мыши, чтобы прокрутить, пока белые области не будут удалены и использовать среднюю кнопку мыши, чтобы настроить желтое числовое значение в колесе цвета к среднему значению Y, чтобы назначить все красным цветом в качестве активной переходной частицы кальция в определяемой пороговой точке. Чтобы сохранить данные в качестве файла частиц на основе координат, нажмите правой кнопкой мыши, чтобы получить доступ к STK 3D, сохраните частицу ноль и левое нажатие, чтобы сохранить файл.Для создания тепловых карт активности частиц откройте сохраненный файл частиц и нажмите правой кнопкой мыши в окне фильма, чтобы получить доступ к частицам STKops, флагу StatMap и ввести задания флага для анализа. Нажмите, чтобы применить анализ и тепловую карту, показывающую общие частицы по всей длине записи с различными цветами, представляющими процентное явление на протяжении всей записи. Нажмите правой кнопкой мыши, чтобы сохранить тепловую карту в качестве файла TIFF.Затем нажмите правой кнопкой мыши в окне фильма, чтобы получить доступ к измерению частиц, статистике частиц STK равно, и введите назначение флага для анализа. В окне трассировки будет создан ряд следов. Анализ STM обеспечивает возможность мониторинга и записи пространственных характеристик сигнализации кальция, таких как пространственное распространение и скорость распространения.Эта информация может быть собрана, чтобы обеспечить довольно полное представление кальция сигнализации поведения в клетках в их родной среде. С помощью анализа частиц количественная информация о сигнализации кальция может быть рассчитана путем измерения площади частицы и количества частиц, которые вместе могут быть использованы для определения пространственных диапазонов активации сигнала кальция в пределах определенного поля зрения. Анализ частиц также позволяет провести углубленную количественную оценку субклеточной сигнализации кальция путем изучения местоположения и вероятности стрельбы по местам обжига кальция.Распределяя частицы на различные флаги в зависимости от их временных характеристик, инициируя частицы могут быть точно отображены. И огромное количество твердых данных, полученных о количестве сайтов посвящения, размер сайта в пикселях и микрометрах, вероятность каждого места инициации стрельбы один или несколько раз во время каждого переходного кластера кальция, и процент огневых площадок, которые стреляют во время каждого переходного цикла кластера кальция могут быть получены. Последовательность является ключом к успеху в этом протоколе.Все наборы данных и все фильмы должны рассматриваться точно так же, чтобы обеспечить надежные, повторяемые результаты. Это особенно верно при работе с файлами частиц. Наши протоколы позволяют получить глубокую характеристику сигнализации кальция на месте, а ряд статистических методов при надлежащем использовании может оценить различия между диапазоном пространственных и временных параметров.Эти методы анализа в нашем протоколе позволили исследователям задать и ответить на ранее нерешенные вопросы, связанные с кишечным темпоотделом и иннервации кишечника, а также нейронного контроля нижних мочевыводящих путей.

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Методы для работы с изображениями Ca 2 + Сигнализация в человеческой спермы

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Визуализация сосудистой Са 2 + Сигнализация Срабатывание паракринной Производные ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Высокая пропускная способность физического картирования хромосом использованием автоматизированных<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Быстрое Генетический анализ эпителиальных мезенхимальных сигнализации во время регенерации волос

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Измерение внутриклеточного Са<sup&gt; 2 +</sup&gt; Изменения в человеческой спермы с помощью четырех методов: Обычные флуорометрии, остановленной струи флуорометрии, проточной цитометрии и односпальная изображений Сотовые

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Автоматизированный анализ динамических Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Сигналы в последовательности изображений

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Двухфотонное изображений внутриклеточного Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Погрузочно-разгрузочные работы и оксид азота производства в эндотелиальных и гладкомышечных клеток изолированной аорты крыс

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Оптический Картирование Intra-саркоплазматического ретикулума Са<sup&gt; 2+</sup&gt; И трансмембранный потенциал в Лангендорфа-перфузии сердца кролика

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...