Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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La financiación fue proporcionada por el NIDDK, a través de DK41315 P01.

Todos los animales utilizados y los protocolos realizados en este estudio estaban de acuerdo con los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de cuidado en la Universidad de Nevada, Reno y uso institucional de Animal.
1. generación de ratones KitGCaMP6f
<ol><li>Cruz Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (ratones GCaMP6f) y c-Kit+ Cre-ERT2 (Kit-Cre ratones) para generar ICC GCaMP6f expresando ani...

CA2 + proyección de imagen de tipos específicos de células dentro de tejidos intactos o dentro de las redes de las células a menudo revela patrones complejos de transitorios de Ca2 + . Esta actividad requiere cuidadosos y profundo análisis y cuantificación para capturar toda la información sobre los eventos subyacentes y la cinética de estos eventos como sea posible. STM y PTCL análisis proporcionan una oportunidad para maximizar la cantidad de datos cuantitativos rindió de grabaciones de ...

CA2 + es un mensajero intracelular ubicuo que controla una amplia gama de procesos celulares, tales como músculo contracción1,2, metabolismo3, celular proliferación3,4, 5, estimulación de liberación de neurotransmisor en el nervio terminales6,7y la activación de la transcripción de factores en el núcleo. 7 Ca intracelular2 + señales muchas veces tomar la forma de elevaciones transitorias en citosólica Ca2 +, y estos pueden ser espontáneos o surgen de la estimulación agonista dependiendo el tipo de célula8. Espacial, temporal y los parámetros de intensidad intrínsecos al Ca2 + señales tales como frecuencia, duración, propagación, velocidad y amplitud pueden proporcionar la información biológica necesaria para la señalización intracelular5, 7 , 9. citoplasmática de Ca2 + señales pueden resultar de la afluencia de Ca2 + desde el espacio extracelular o a través de Ca2 + liberación desde el retículo endoplásmico (ER) a través de canales de Ca2 + lanzamiento como receptores de Ryanodina (RyRs) y receptores de inositol-tri-fosfato (IP3Rs)10. RyRs y IP3Rs pueden contribuir a la generación de señales de Ca2 + y la apertura concertada de estos canales, que combinado con diversos mecanismos de Ca2 + afluencia puede resultar en una miríada de Ca2 + patrones de señalización que son formados por los números y abre la probabilidad de Ca2 + flujo canales, el perfil de la expresión de canales de Ca2 + liberación, la proximidad entre el Ca2 + afluencia y canales de la libertad y expresión y distribución de Ca2 + las proteínas de reabsorción y de la protuberancia. CA2 + señales pueden tomar la forma de uniforme, duradero, las oscilaciones globales de intensidad alta que puede durar varios segundos o incluso minutos, multiplicación intracelulares e intercelulares Ca2 + ondas que pueden cruzar distancias intracelulares más de 100 μm10,11,12,13,14,15,16, o más breve, espacialmente localizados eventos como Ca2 + chispas y Ca2 + soplos que se producen en decenas de milisegundo plazos y menos de 5 μm17,18,19,20.
Microscopía fluorescente se ha utilizado ampliamente para controlar Ca2 + señalización en células aisladas y cultivadas y en los tejidos intactos. Tradicionalmente, estos experimentos incluyeron el uso de fluorescentes Ca2 + indicadores, proporcionales y no proporcionales tintes como Fura2, Fluo3/4 o Rhod2, entre otros 21,22,23. Estos indicadores fueron diseñados para ser permeable a las membranas celulares y luego queda atrapado en las células por el clivaje de un grupo éster mediante esterasas endógenas. Unión del Ca2 + en los indicadores de alta afinidad provocó cambios en la fluorescencia, cuando las células y los tejidos se iluminan por las correspondientes longitudes de onda de la luz. El uso de celular permeable al Ca2 + indicadores mejorado enormemente nuestra comprensión de Ca2 + señalización en las células vivas y permite la resolución espacial y cuantificación de estas señales que no era posible analizando las señales de Ca2 + a través de otros medios, como la electrofisiología. Sin embargo, tradicional Ca2 + indicadores tienen varias limitaciones, como el fotoblanqueo que ocurre durante períodos de grabación extendida24. Mientras que el indicador de Ca2 + nuevos tintes como Cal520/590 tienen mucho mejor señal a proporción de ruido y la capacidad para detectar locales Ca2 + señales25, problemas con el fotoblanqueo pueden todavía sigue siendo una preocupación para algunos investigadores 2627,de,28. Fotoblanqueo precipitada también restringe el aumento, tasa de adquisición de la imagen, y resolución que se puede utilizar para las grabaciones, como aumentar la potencia objetivo y tasas de adquisición de imágenes requieren mayor intensidad de luz de excitación que aumenta el fotoblanqueo.
Estas limitaciones de tradicional Ca2 + indicador de tintes se agravan cuando grabación de Ca2 + señales in situ, por ejemplo cuando grabación intracelular Ca2 + señales de tejidos intactos. Debido a los problemas mencionados, visualización de Ca2 + señales in situ usando celular permeable al Ca2 + indicadores ha sido limitada a aumento de la energía baja y redujo las tasas de captura de la imagen, restricción de la capacidad de los investigadores para registrar y cuantificar el Ca2 + señales subcelulares temporal o espacialmente restringidas. Así, ha sido difícil de capturar, analizar y apreciar la complejidad espacial y temporal de Ca2 + señales, que pueden ser importantes en la generación de respuestas biológicas deseadas, como se indicó anteriormente. Análisis de Ca2 + señales de células in situ por lo general se basa en mediciones de intensidad simple de las regiones de interés (ROI) dentro de un campo de visión (FOV). La opción arbitraria del número, tamaño y posición del ROI, dependiente en el capricho del investigador, severamente puede sesgar los resultados obtenidos. Así como el sesgo inherente con análisis del ROI, este enfoque ignora gran parte de la importante información contenida en el campo de visión, como dinámica Ca2 + eventos dentro de un arbitrariamente elegido de señalización ROI son seleccionados para el análisis. Además, análisis de ROI no proporcionan información sobre las características espaciales de las Ca2 + señales observadas. Por ejemplo, no es posible distinguir entre un aumento de Ca2 + resultante de una propagación de onda de Ca2 + y un altamente localizada Ca2 + liberan evento de tabulaciones de Ca2 + señales dentro de un retorno de la inversión.
El advenimiento de genéticamente codificados Ca2 + indicadores (GECIs) ha cambiado radicalmente como Ca2 + la proyección de imagen puede ser realizado en situ29,30,31,32,33 . Hay varias ventajas al uso de GECIs sobre tintes. El más importante quizás es que la expresión de GECI puede realizarse en una manera específica de la célula, que reduce la contaminación de fondo no deseados de las células no de interés. Otra ventaja de GECIs sobre tradicional Ca2 + indicadores es eso fotoblanqueo se reduce (como fluorescencia y consecuencialmente fotoblanqueo sólo ocurre cuando las células están activas), en comparación con muestras, cargado de tinte, particularmente a alta Ampliación y las altas tasas de imagen capturan34. Así, la proyección de imagen con GECIs, tales como la serie de GCaMP de optogenetic sensores, ofrece a los investigadores la capacidad para registrar breve, localizada celular Ca2 + señales en situ e investigar Ca2 + en células dentro de su ambientes nativos que no han sido posibles anteriormente. Para maximizar la recuperación de la información de tales grabaciones de alta resolución, análisis espacial y temporal adecuado de las señales de Ca2 + se requiere. Cabe señalar que mientras GECIs puede ofrecer que algunas ventajas claras, estudios recientes han revelado que Ca2 + la proyección de imagen puede ser realizada con éxito de grandes poblaciones de diferentes clases neuroquímicas de neuronas simultáneamente con las convencionales CA2 + en los indicadores que no están genéticamente codificados en los animales35. Este enfoque utiliza inmunohistoquímica post-hoc para revelar varias clases diferentes de neuronas disparar en alta frecuencia en explosiones sincronizadas y evita el potencial que las modificaciones genéticas a los animales pueden haber interferido con el fisiológico comportamiento el investigador busca comprender35,36.
Los protocolos descritos en este documento facilitan más completo análisis y cuantificación de Ca2 + señales grabadas desde células in situ usando una combinación de mapa espacio-temporal (STM)-basado en el análisis y el análisis de partículas. Los protocolos también describen cómo diferentes patrones de Ca2 + señalización observada en células diferentes poblaciones in situ pueden ser analizadas adecuadamente. Por ejemplo, el método examinará Ca2 + en una población especializada de células en el intestino, células intersticiales de Cajal (ICC). ICC son las células especializadas en el tracto gastrointestinal (GI) que presentan dinámica intracelular Ca2 + señalización, como visualizar usando los ratones que expresaban GCaMPs37,38,39,40, 41,42. CA2 + transitorios en ICC están vinculados a la activación de Ca2 +-activa Cl– (codificados por Ano1) los canales que son importantes en la regulación de la excitabilidad del músculo liso intestinal células (SMCs)43, 44,45. Así, el estudio de Ca2 + en ICC es fundamental para comprender la motilidad intestinal. El intestino murino ofrece un excelente ejemplo de esta demostración, ya que hay dos clases de ICC que están separadas anatómicamente y pueden visualizarse de forma independiente: i) ICC están situados en la zona entre el músculo liso circular y longitudinal capas, que rodean el plexo mientérico (ICC-mi). Estas células sirven como células marcapasos y generan la actividad eléctrica conocida como ondas lentas46,47,48,49; II) ICC también se encuentran entre un plexo rico en los terminales de las neuronas motoras (plexo muscular profundo, así ICC-DMP). Estas células sirven como mediadores de las respuestas a la neurotransmisión entéricas de motor37,39,40,50. ICC-mi y ICC-DMP son morfológicamente distintos, y sus comportamientos señalización Ca2 + se diferencian radicalmente para realizar sus tareas específicas. ICC-mi son radiados en la forma y forman una red de células interconectadas a través de las ensambladuras de gap51,52. CA2 + señales en ICC-mi manifiesto como breves y localizadas espacialmente Ca2 + lanzamiento eventos que ocurren en los sitios múltiples asincrónicamente a través de la ICC-mi red como visualizado dentro de un campo de visión (imagen con el objetivo X 60)38. Estas señales asíncronas están organizadas temporalmente en 1 segundo racimos que, cuando se tabulan juntos, equivalen a un neto 1 s celular aumento de Ca2 +. Estas señales de propagación célula a célula, dentro de la red de ICC y por lo tanto organizan Ca2 + señalización, generados a partir de sitios web celular, en una tejido amplio Ca2 + onda. Clustering temporal y la sumatoria de Ca2 + señales en ICC-mi se la ha denominado Ca2 + grupos transitorios (CTC)38. CTC se producen rítmicamente (e.g. bastante similares duraciones y periodos similares entre CTC) 30 veces por minuto en el ratón. Por el contrario, ICC-DMP están las células del huso en forma, algunos con procesos secundarios, que distribuyen entre comités y procesos del nervio varices y no independientemente forman una red51,52. ICC-DMP forman uniones comunicantes con comités, sin embargo y dentro este sincitio mayor, conocido como el SIP sincicio53. Señales de CA2 + se producen en múltiples sitios a lo largo de la longitud de las células, pero estas oscilaciones no ocluidos o temporal agrupados, como se observa en el ICC-mi37. CA2 + señales en ICC-DMP se producen de manera estocástica, con variable intensidad, duración y características espaciales. Los protocolos por debajo, usando el ejemplo de Ca2 + en ICC-mi y ICC-DMP, describen técnicas para analizar el complejo de señalización en tipos específicos de células in situ. Utilizamos el sistema Cre-Lox inducible para expresar GCaMP6f exclusivamente en la ICC, después de inducir la activación de Cre-Recombinase (Cre) conducida por un promotor específico de la ICC (Kit).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

CA2 + proyección de imagen de células aisladas o tipos específicos de células dentro de tejidos intactos a menudo revela patrones complejos de Ca2 + señalización. Esta actividad requiere cuidadosos y profundo análisis y cuantificación para capturar toda la información sobre los eventos subyacentes como sea posible. Espacial, temporal y los parámetros de intensidad intrínsecos al Ca2 + señales tales como frecuencia, duración, propagación, velocidad y amplitud pueden proporcionar información biológica necesaria para la señalización intracelular. Alta resolución Ca2 + la proyección de imagen típicamente resultados en la adquisición de grandes archivos de datos que son lentos al proceso en cuanto a la traducción de la información de imagen en datos cuantificables y este proceso puede ser susceptible a sesgo y error humano. Análisis de Ca2 + señales de células in situ por lo general se basa en mediciones de intensidad simple de arbitrariamente las regiones de interés (ROI) dentro de un campo de visión (FOV). Este enfoque ignora gran parte de la información de señalización importante contenida en el FOV. Por lo tanto, para maximizar la recuperación de la información de tales grabaciones de alta resolución obtenidos con tintes de Ca2 +o optogenetic Ca2 + imagen, adecuado análisis espacial y temporal de las señales de Ca2 + se requiere. Los protocolos descritos en este artículo describen cómo se puede obtener un gran volumen de datos de Ca2 + proyección de imagen las grabaciones para facilitar el más completo análisis y cuantificación de Ca2 + señales de las células usando una combinación de mapa espacio-temporal (STM)-basado en el análisis y el análisis de partículas. Los protocolos también describen cómo diferentes patrones de Ca2 + señalización observada en células diferentes poblaciones in situ pueden ser analizadas adecuadamente. Por ejemplo, el método examinará Ca2 + en una población especializada de células en el intestino, células intersticiales de Cajal (ICC), usando GECIs.

Utilizando ratones de Kit-Cre-GCaMP6F (figura 1), dinámica Ca2 + señalización comportamientos de ICC en el tracto gastrointestinal pueden ser reflejadas en situ. Con microscopía confocal, imágenes de alta resolución de poblaciones específicas de ICC pueden ser adquiridos sin contaminar las señales de otras poblaciones de CPI dentro del mismo tejido pero en planos anatómico distintos del foco (figura 2A)<sup cl...

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Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2 + indicadores genético codificados (GECIs) han cambiado radicalmente cómo in situ Ca2 + proyección de imagen se realiza. Para maximizar la recuperación de datos de esas grabaciones, análisis apropiado de señales de Ca2 + se requiere. Los protocolos en este trabajo facilitan la cuantificación de Ca2 + señales grabadas in situ utilizando Cartografía espacio-temporal y el análisis de partículas.

Aplicaciones de la cartografía espacio-temporal y técnicas de análisis de partículas para cuantificar Ca intracelular2 + señalización In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

La capacidad de adquirir grandes cantidades de datos de experimentos de imágenes de calcio ha mejorado drásticamente, especialmente con experimentos de imágenes de tejidos. Nuestros protocolos describen técnicas de análisis adecuadas para cuantificar y describir estos conjuntos de datos. Nuestros protocolos generan una gama de valores espaciales, temporales e intensidad que son intrínsecos a la señalización de calcio en tejidos enteros y esto se puede perder en análisis más rudimentarios.Una hora antes de la transferencia de imágenes un intestino delgado cosechado de un ratón con células intersticiales de Cajal o ICC que expresan específicamente un indicador de calcio genéticamente codificado a la etapa de un microscopio confocal de disco giratorio. Y perfunda continuamente el tejido con 37 grados Celsius Krebs-Ringer bicarbonato o solución KRB. Usando un aumento de 60 a 100 X localice el plexo mientérico ICC o ICC-MY en forma estelar entre las capas musculares lisas circulares y longitudinales del intestino delgado.A continuación, localice el plexo muscular profundo en forma de husillo ICC o ICC-DMP en un solo plano entre la capa muscular lisa circular y el plexo submucoso y guarde las películas como una pila de imágenes TIFF. Para crear mapas espaciotemporales o SRM de la actividad de calcio ICC-DMP, abra la pila de imágenes en ImageJ y haga clic en Imagen, Tipo y 32 bits para modificar la calidad de la imagen. Para crear un escaneo de línea, haga clic con el botón derecho en la herramienta de selección de líneas y seleccione línea segmentada.Mediante los clics izquierdos individuales, dibuje una línea a lo largo del acceso medio de un ICC-DMP individual, haciendo doble clic cuando se haya esbozado toda la celda. Seleccione Imagen, Pilas y Reslice. Aparecerá una ventana emergente.Seleccione Girar 90 grados para orientar el escaneo de línea de izquierda a derecha para que se pueda calibrar y leer contra el tiempo en el eje X con espacio en el eje Y y haga clic en Aceptar. Aparecerá el mapa espaciotemporal. Para medir con precisión la amplitud de las señales de calcio del mapa, seleccione la selección rectangular y dibuje una región de interés alrededor del área dentro de la STM que muestre el área de fluorescencia más uniforme y menos intensa. Haga clic en Analizar e histograma para obtener un valor medio de la intensidad dentro de la región de interés seleccionada y haga clic en Editar, Selección, Seleccionar todo para seleccionar todo el STM.A continuación, haga clic en Procesar, Matemáticas y dividir e introduzca el valor medio de la intensidad con la región STM seleccionada de interés en el cuadro emergente. El STM se volverá negro. Corrija esto haciendo clic en Imagen, Ajustar, Brillo/Contraste y Automático en la ventana emergente.El escaneo de línea ahora se calibrará para la amplitud con la intensidad de la fluorescencia expresada como la fluorescencia dividida por la fluorescencia cero. El STM mostrará el número de fotogramas en la pila TIFF en el eje X y el número de píxeles que representan la longitud de la celda en el eje Y. Para cuantificar los datos temporales y espaciales de las señales de calcio, haga clic en Imagen y Propiedades e introduzca los valores adecuados para calibrar completamente la STM para el espacio y el tiempo en la ventana emergente.Para analizar los eventos de calcio individuales, haga clic en Línea recta y haga clic y arrastre en la STM para dibujar una línea horizontal recta a través del centro de un evento de calcio paralelo al eje X. A continuación, haga clic en Analizar y trazar perfil. Aparecerá un cuadro que muestra el perfil de la gráfica del evento de calcio.Para el análisis basado en partículas de los datos de señalización de calcio ICC-MY, abra el archivo de película en Volumetry y haga clic con el botón derecho para seleccionar Filtro STK, Diferenciar. Haga clic con el botón derecho del 200o para introducir un valor que diferencie. Pulse Intro y haga clic con el botón izquierdo para iniciar la diferenciación.Para crear partículas, utilice el botón central del ratón para desplazarse por la película para seleccionar una sección de fotogramas de 20 a 40 que incluya un período de reposo, seguido de la aparición de un clúster transitorio de calcio y de 20 a 40 fotogramas que siguen justo después del clúster. Cuando todos los fotogramas se hayan seleccionado, haga clic con el botón derecho en la ventana de la película para acceder a la información de partículas de STK OPS Ramp DS y haga clic para ejecutar una rutina de análisis de partículas que aumente progresivamente el umbral de la intensidad máxima a la mínima. Para garantizar un análisis de partículas exitoso, asegúrese de incorporar tanto no actividad del clúster transitorio precálico y de tanta falta de actividad del clúster transitorio posterior al calcio.Esto ayudará a aumentar la relación señal-ruido. El análisis se mostrará gráficamente en la ventana de trazado como trazado de ruido y en la ventana de trazas como tres trazos de color con el trazo verde que representa el número de partículas, el trazo rojo que representa el tamaño medio de partícula y el trazo azul que representa el umbral de intensidad absoluta. Para equilibrar el histograma, la gráfica de ruido de partículas pulse H en el teclado.A continuación, presione la tecla de corchete derecha para recorrer los esquemas de color hasta que el fondo sea blanco con los trazos de color en la parte superior. Pulse F en el teclado una vez para abrir una herramienta de medición. A continuación, presione F una segunda vez para marcar una sola línea vertical en la barra de desplazamiento de la ventana de trazas en el trazado en la intersección donde los trazados de color comienzan a cambiar al lado derecho.Dentro de la ventana de seguimientos utilice el botón central del ratón para desplazarse desde el punto de inflexión del trazo rojo a la línea vertical blanca marcada. Después de tomar nota del promedio Y mostrado, haga clic de nuevo en el botón central del ratón dentro de la ventana de seguimientos para anular la selección del trazo azul. En la ventana de la película, haga clic en C para abrir una rueda de color y D para ajustar el umbral.Las partículas válidas ahora se mostrarán en rojo, y las que se saturarán serán blancas. Utilice el botón izquierdo del ratón para desplazarse hasta que se eliminen las áreas blancas y utilice el botón central del ratón para ajustar el valor numérico amarillo de la rueda de color al valor medio Y para asignar todo en rojo como una partícula transitoria de calcio activa en el punto de umbral determinado. Para guardar los datos como un archivo de partículas basado en coordenadas, haga clic con el botón derecho del 200 en STK 3D, guarde el cero de partícula y haga clic con el botón izquierdo del 200 al índole para guardar el archivo.Para crear mapas de calor de actividad de partículas, abra el archivo de partículas guardado y haga clic con el botón derecho en la ventana de película para acceder a las partículas STKops, StatMap Flag e introduzca las asignaciones de marca que desea analizar. Haga clic para aplicar el análisis y un mapa de calor que muestre el total de partículas para toda la longitud de grabación con diferentes colores que representan el porcentaje de ocurrencia a lo largo de la grabación. Haga clic con el botón derecho del 200o para guardar el mapa de calor como un archivo TIFF.A continuación, haga clic con el botón derecho en la ventana de la película para acceder a la medida de partículas, las estadísticas de partículas STK son iguales e introduzca una asignación de marca para el análisis. Se generará una serie de seguimientos en la ventana de seguimiento. El análisis STM proporciona la capacidad de monitorear y registrar las características espaciales de la señalización de calcio, como la propagación espacial y la velocidad de propagación.Esta información se puede acumular para proporcionar una visión bastante completa de los comportamientos de señalización de calcio dentro de las células en sus entornos nativos. Mediante el análisis de partículas, la información cuantitativa sobre la señalización de calcio se puede calcular midiendo el área de partículas y el recuento de partículas, que en conjunto se pueden utilizar para determinar los rangos espaciales de activación de la señal de calcio dentro de un campo de visión especificado. El análisis de partículas también permite la cuantificación en profundidad de la señalización subcelular de calcio mediante el examen de la ubicación y las probabilidades de disparo de los sitios de cocción de calcio.Al asignar las partículas en diferentes banderas basadas en sus características temporales, las partículas que inician se pueden mapear con precisión. Y una gran cantidad de datos duros adquiridos en el número de sitios de iniciación, el tamaño del sitio en píxeles y micrómetros, la probabilidad de que cada sitio de iniciación se dispare una o varias veces durante cada grupo transitorio de calcio, y el porcentaje de sitios de disparo que se disparan durante cada ciclo de racimo transitorio de calcio se pueden obtener. La coherencia es la clave del éxito en este protocolo.Todos los conjuntos de datos y todas las películas deben tratarse exactamente igual para garantizar resultados fiables y repetibles. Esto es especialmente cierto cuando se trata de archivos de partículas. Nuestros protocolos permiten una caracterización profunda de la señalización de calcio in situ, y una serie de métodos estadísticos, cuando se utilizan adecuadamente, pueden evaluar las diferencias entre una gama de parámetros espaciales y temporales.Estas técnicas de análisis en nuestro protocolo han permitido a los investigadores hacer y responder preguntas previamente no abordables relacionadas con el ritmo intestinal, y la inervación intestinal, así como el control neuronal del tracto urinario inferior.

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

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Técnicas de Imagen Ca 2 + Señalización en el esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Investigación

Biología

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Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

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Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

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Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

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Medición de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

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Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

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Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

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Análisis automatizado de Dinámica Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en secuencias de imágenes

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

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Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

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Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

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