Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Finansieringen tillhandahölls av NIDDK, via P01 DK41315.

Alla djur som används och de protokoll som utförs i denna studie var i enlighet med den nationella institut för hälsa Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Alla förfaranden godkändes av institutionella djur användning och eftervård kommittén på vid University of Nevada, Reno.
1. generering av KitGCaMP6f möss
<ol><li>Cross Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f möss) och c-Kit+/ Cre-ERT2 (Kit-Cre möss) för att generera ICC specifika GCaMP6f uttrycker djur (Kit-...

Ca2 + avbildning av specifika typer av celler inom intakta vävnader eller inom nätverk av celler ofta avslöjar komplexa mönster av Ca2 + transienter. Denna aktivitet kräver noggrann och djupgående analyser och kvantifiering att fånga så mycket information om bakomliggande händelser och kinetik av dessa händelser som möjligt. STM och PTCL analys ger en möjlighet att maximera mängden kvantitativa uppgifter som framkommit från inspelningar av den här typen.
Sm...

Ca2 + är en allestädes närvarande intracellulära budbärare som styr ett brett utbud av cellulära processer, såsom muskel kontraktion1,2, metabolism3, cell spridning3,4, 5, stimulering av neurotransmitterfrigöraren nerv terminaler6,7, och aktivering av transkription faktorer i kärnan. 7 intracellulära Ca2 + signaler ofta ske i form av övergående förhöjningar i cytosoliskt Ca2 +, och dessa kan vara spontan eller uppkommer agonist stimulering beroende på det cell typ8. Spatial, tidsmässiga och intensitet parametrar inneboende till Ca2 + signaler såsom frekvens, varaktighet, förökning, hastighet och amplitud kan ge den biologiska information som krävs för Intracellulär signalering5, 7 , 9. cytoplasmiska Ca2 + signaler kan resultera från inflödet av Ca2 + från extracellulära eller via Ca2 + release från endoplasmatiska retiklet (ER) via Ca2 + release kanaler såsom ryanodine receptorer (RyRs) och inositol-tri-fosfat receptorer (IP3Rs)10. RyRs och IP-3Rs kan både bidra till generation av Ca2 + signaler och samordnade öppnandet av dessa kanaler, som i kombination med olika Ca2 + tillströmning mekanismer kan resultera i en myriad av Ca2 + signalering mönster som formas av siffrorna och öppna sannolikheten Ca2 + tillströmning kanaler, uttryck profilen Ca2 + release kanaler, närheten mellan Ca2 + tillströmning och release kanaler, och uttryck och distribution av Ca2 + återupptaget och extrudering proteiner. Ca2 + signaler kan ta form av enhetliga, långvarig, hög intensitet globala svängningar som kan pågå i flera sekunder eller ens minuter, förökningsmaterial intracellulära och intercellulära Ca2 + vågor som kan korsa intracellulära avstånd över 100 µm10,11,12,13,14,15,16, eller mer kort, rumsligt lokaliserad händelser såsom Ca2 + gnistor och Ca2 + puffar som inträffar på tiotals millisekund tidsskalor och sprida mindre än 5 µm17,18,19,20.
Fluorescerande mikroskopi har använts allmänt att övervaka Ca2 + signalering i isolerade och odlade celler och i intakta vävnader. Traditionellt dessa experiment involverade fluorescerande Ca2 + indikatorer, proportionerlig och icke-proportionerlig färgämnen som Fura2, Fluo3/4 eller Rhod2, bland annat 21,22,23. Dessa indikatorer avsedda att vara genomsläppliga för cellmembranen och sedan fastna i celler genom klyvning av en estergrupp via endogena esteraser. Bindningen av Ca2 + till hög affinitet indikatorer orsakade förändringar i fluorescens när celler och vävnader var upplyst av lämpliga våglängder av ljus. Användningen av cell genomsläpplig Ca2 + indikatorer förbättras avsevärt vår förståelse av Ca2 + signalering i levande celler och tillåtna rumslig upplösning och kvantifiering av dessa signaler som inte var möjligt av testmetoder Ca2 + signaler annat sätt, till exempel elektrofysiologi. Traditionella Ca2 + indikatorer har dock flera begränsningar, såsom fotoblekning som uppstår över utökade inspelning perioder24. Medan nyare Ca2 + indikator färgämnen som Cal520/590 har kraftigt förbättrat signal-brus nyckeltal och förmågan att upptäcka lokala Ca2 + signaler25kan frågor med fotoblekning fortfarande förbli en angelägenhet för vissa utredare 26,27,28. Brant fotoblekning också begränsar förstoringen, grad av bilden, och upplösning som kan användas för inspelningar, ökad objektiv effekt och högre bild förvärv kräver ökad excitation ljusintensiteten som ökar fotoblekning.
Dessa begränsningar av traditionella Ca2 + indikator färgämnen förvärras när inspelning Ca2 + signaler på plats, till exempel när inspelning intracellulära Ca2 + signaler från intakta vävnader. På grund av problemen ovan, visualisering av Ca2 + signaler i situ använder cell genomsläpplig Ca2 + indikatorer har begränsats till låg förstoring och reducerade Bildinsamling, begränsa möjligheten för utredarna att registrera och kvantifiera temporally eller rumsligt begränsade subcellulär Ca2 + signaler. Således har det varit svårt att fånga, analysera och uppskattar den rumsliga och tidsmässiga komplexiteten av Ca2 + signaler, vilket kan vara viktigt i generation av önskad biologiska svar, enligt ovan. Analys av Ca2 + signaler från celler jordbaserad är vanligtvis beroende av enkel intensitet mätningar från utvalda områden av intresse (ROI) inom ett synfält (FOV). Godtyckliga val av antal, storlek och placering av ROIs, beroende på ett infall av forskaren kan allvarligt bias resultaten. Samt inneboende bias med ROI-analys, ignorerar detta tillvägagångssätt mycket av de viktiga signalering informationen i FOV, som dynamiska Ca2 + händelser inom ett godtyckligt valt ROI väljs för analys. Vidare underlåter analys av ROIs att tillhandahålla information om rumsliga egenskaper av de Ca2 + signaler som observerats. Exempelvis kan det inte vara möjligt för att skilja mellan en ökning av Ca2 + följd en föröknings Ca2 + våg och en starkt lokaliserad Ca2 + släppa händelsen från tabelluppställning av Ca2 + signaler inom ett ROI.
Tillkomsten av genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs) har radikalt förändrat hur Ca2 + imaging kan vara utförda i situ29,30,31,32,33 . I området i närheten finns det flera fördelar med att använda GECIs över färgämnen. Det viktigaste är kanske att uttryck för GECI kan utföras på ett särskilt sätt för cellen, vilket minskar oönskade bakgrundshalter från celler inte av intresse. En annan fördel med GECIs över traditionella Ca2 + indikatorer är att fotoblekning minskas (fluorescens och följdriktigt fotoblekning bara uppstår när celler är aktiv), jämfört med dye-loaded exemplar, särskilt vid höga förstoring och hög bild fånga34. Således imaging med GECIs, såsom GCaMP serien av optogenetic sensorer, ger utredarna förmågan att spela kort, lokaliserade sub cellulära Ca2 + signaler i situ och undersöka Ca2 + signalering i celler inom deras inhemska miljöer som inte har varit möjligt tidigare. För att maximera återvinning av information från sådana högupplösta inspelningar, krävs lämpliga rumsliga och tidsmässiga analys av Ca2 + signaler. Det bör noteras att medan GECIs kan erbjuda några tydliga fördelar, senare studier visat att Ca2 + avbildning kan utföras framgångsrikt från stora populationer av olika neurokemiska klasser av nervceller samtidigt använder konventionella Ca2 + indikatorer som inte är genetiskt kodade till djur35. Detta tillvägagångssätt används post hoc-immunohistokemi för att avslöja flera olika klasser av neuroner avfyras på hög frekvens i synkroniserade skurar, och undvek den potential som genetiska modifieringar att djuret kan ha stört fysiologiska beteende utredaren försöker förstå35,36.
De protokoll som beskrivs i detta dokument underlätta mer komplett analys och kvantifiering av Ca2 + signaler inspelade från celler på plats med en kombination av spatiotemporal karta (STM)-baserad analys och partikel-baserad analys. Protokoll som beskriver också hur olika mönster av Ca2 + signalering observerade i olika cell populationer jordbaserad kan analyseras på rätt sätt. För illustration undersöker metoden Ca2 + -signalering i en specialiserad population av celler i tunntarmen, interstitiella celler av Cajal (ICC). ICC är specialiserade celler i den gastrointestinala (GI) tarmkanalen som uppvisar dynamiska intracellulära Ca2 + signalering, som visualiseras med möss som uttrycker GCaMPs37,38,39,40, 41,42. Ca2 + transienter i ICC är kopplade till aktivering av Ca2 +-aktiverade Cl– kanaler (kodad av Ano1) som är viktiga i regleringen av retbarhet av tarmens muskulatur celler (SMCs)43, 44,45. Studien av Ca2 + signalering i ICC är alltså grundläggande att förstå tarmens motilitet. Murina tunntarmen erbjuder ett utmärkt exempel för denna demonstration, som det finns två klasser av ICC som är anatomiskt separerade och kan visualiseras självständigt: jag) ICC ligger i området mellan den cirkulära och längsgående glatta muskulaturen lager, kring den myenteric plexus (ICC-min). Dessa celler fungera som pacemaker celler och generera den elektriska aktiviteten som kallas långsamma vågor46,47,48,49; (II) ICC ligger också bland en plexus som är rik på terminalerna av motoriska nervceller (djupt muskulös plexus, således ICC-DMP). Dessa celler fungera som medlare av Svaren till enteriska motor neurotransmission37,39,40,50. ICC-min ICC-DMP skiljer sig morfologiskt och sina Ca2 + signalering beteenden skiljer sig radikalt för att utföra sina specifika uppgifter. ICC-min är stjärnformade i form och bildar ett nätverk av sammankopplade celler via gap junctions51,52. Ca2 + signaler i ICC-min manifest som kort och rumsligt lokaliserad Ca2 + release händelser som inträffar på flera platser asynkront via ICC-MY network som visualiseras i en FOV (avbildas med ett 60 X-objektiv)38. Dessa asynkron signaler är organiserade temporally i 1 sekund kluster som, när i tabellform tillsammans, uppgå till en netto 1 s cellulära ökning Ca2 +. Dessa signaler propagera cell till cell inom ICC nätverket och därför organisera Ca2 + signalering, genereras från sub cellulära webbplatser, till en vävnad brett Ca2 + våg. Tidsmässiga klustring och summering av Ca2 + signaler i ICC-MY har kallats Ca2 + övergående kluster (CTCs)38. CTCs uppstå rytmiskt (t.ex. ganska liknande varaktigheter och liknande perioder mellan CTCs) 30 gånger per minut i musen. Omvänt, ICC-DMP är spindeln formade celler, några med sekundära processer, som distribuerar mellan SMCs och åderbråck nerv processer och inte självständigt bildar ett nätverk51,52. ICC-DMP form gap-junctions med SMCs, dock och funktion inom detta större syncytium, känd som SIP syncytium53. Ca2 + signaler förekommer på flera platser längs längderna av celler, men dessa transienter inte fångas upp eller temporally klustrade, som observerats i ICC-min37. Ca2 + signaler i ICC-DMP uppstå på en stokastisk sätt, med varierande intensitet, varaktighet och rumsliga egenskaper. Protokollen nedan, i exemplet med Ca2 + signalering i ICC-MY och ICC-DMP, beskriver tekniker för att analysera komplexa signalering i specifika typer av celler på plats. Vi utnyttjade inducerbara Cre-Lox p-systemet för att uttrycka GCaMP6f uteslutande i ICC, efter att förmå aktivering av Cre-Recombinase (Cre) drivs av en ICC specifika promotorn (Kit).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

Ca2 + avbildning av isolerade celler eller specifika typer av celler inom intakta vävnader ofta avslöjar komplexa mönster av Ca2 + signalering. Denna aktivitet kräver noggrann och djupgående analyser och kvantifiering att fånga så mycket information som möjligt om de bakomliggande händelserna. Spatial, tidsmässiga och intensitet parametrar inneboende till Ca2 + signaler såsom frekvens, varaktighet, förökning, hastighet och amplitud kan ge några biologiska information som krävs för Intracellulär signalering. Högupplösta Ca2 + imaging vanligtvis resultat i förvärvet av stora datafiler som är tidskrävande att process när det gäller att översätta imaging informationen till mätbara uppgifter och denna process kan vara mottagliga för mänskliga fel och fördomar. Analys av Ca2 + signaler från celler jordbaserad är vanligtvis beroende av enkel intensitet mätningar från godtyckligt valda områden av intresse (ROI) inom ett synfält (FOV). Denna strategi ignorerar mycket av viktiga signalering informationen i FOV. Således, för att maximera återvinning av information från sådana högupplösta inspelningar som erhållits med Ca2 +färgämnen eller optogenetic Ca2 + bildskapande, lämpliga rumsliga och tidsmässiga analys av Ca2 + signaler krävs. De protokoll som beskrivs i denna uppsats kommer att beskriva hur en hög volym av data kan erhållas från Ca2 + imaging inspelningar att underlätta mer komplett analys och kvantifiering av Ca2 + signaler inspelade från celler som använder en kombination av spatiotemporal karta (STM)-baserad analys och partikel-baserad analys. Protokoll som beskriver också hur olika mönster av Ca2 + signalering observerade i olika cell populationer jordbaserad kan analyseras på rätt sätt. För illustration undersöker metoden Ca2 + -signalering i en specialiserad population av celler i tunntarmen, interstitiella celler av Cajal (ICC), med hjälp av GECIs.

Använda Kit-Cre-GCaMP6F möss (figur 1), dynamisk Ca2 + signalering beteenden av ICC i mag-tarmkanalen kan avbildas på plats. Med konfokalmikroskopi, kan högupplösta bilder av specifika populationer av ICC förvärvas utan att förorena signaler från andra populationer av ICC inom samma vävnaden men i anatomiskt distinkta plan i fokus (figur 2A)37 , 39 <s...

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs) har radikalt förändrat hur jordbaserad Ca2 + imaging utförs. För att maximera dataåterställning från sådana inspelningar, krävs lämplig analys av Ca2 + signaler. Protokollen i denna uppsats underlätta kvantifiering av Ca2 + signaler inspelad på plats med hjälp av spatiotemporal kartering och partikel-baserad analys.

Tillämpningar av plats och tid kartläggning och partikel analystekniker för att kvantifiera intracellulära Ca2 + signalering In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Kapaciteten att förvärva stora mängder data från kalcium imaging experiment har drastiskt förbättrats, särskilt med vävnad imaging experiment. Våra protokoll beskriver lämpliga analystekniker för att kvantifiera och beskriva dessa datamängder. Våra protokoll genererar en rad rumsliga, tidsmässiga och intensitetsvärden som är inneboende i kalciumsignalering i hela vävnader och detta kan gå förlorat i mer rudimentär-baserad analys.En timme före bildåtergivningen överföra en tunntarmen skördas från en mus med interstitial celler av Cajal eller ICC som specifikt uttrycka en genetiskt kodad kalcium indikator till scenen i en snurrande disk confocal mikroskop. Och kontinuerligt genomsyra vävnaden med 37 grader Celsius Krebs-Ringer bikarbonat eller KRB lösning. Med hjälp av en 60 till 100 X förstoring lokalisera stellate-formade myenteric plexus ICC eller ICC-MY mellan cirkulära och längsgående glatt muskulatur skikt av tunntarmen.Sedan lokalisera spindelformade djupa muskulös plexus ICC eller ICC-DMP i ett enda plan mellan cirkulära glatt muskulatur skikt och submucosal plexus och spara filmerna som en bunt TIFF bilder. För att skapa spatiotemporal kartor eller STMs av ICC-DMP kalciumaktiviteten öppna bilden stacken i ImageJ, och klicka på Bild, Skriv och 32-bitars för att ändra bildkvaliteten. För att skapa en linje scan högerklicka på linjemarkeringsverktyget och välj segmenterad linje.Med hjälp av enstaka vänsterklick drar du en linje längs mitten av en enskild ICC-DMP:s mittklick, dubbelklickar du när hela cellen har skisserat. Välj Bild, Stackar och Reslice. Ett popup-fönster kommer att visas.Välj Rotera 90 grader om du vill orientera linjegenomsökningen från vänster till höger så att den kan kalibreras och läsas mot tiden på x-axeln med utrymme på y-axeln och klicka på OK. Den spatiotemporala kartan kommer att visas. För att exakt mäta amplituden av kalciumsignalerna från kartan, välj rektangulärt urval och rita en region av intresse runt området inom STM som visar det mest enhetliga och minst intensiva området av fluorescens. Klicka på Analysera och Histogram för att få fram ett medelvärde för intensiteten för intensiteten inom den valda intresseregionen och klicka på Redigera, Markering, Markera alla för att markera hela STM.Därefter klickar du på Process, Matematik och Dividera och anger medelvärdet för intensiteten med den valda STM-regionen av intresse i popup-rutan. STM kommer att bli svart. Rätta detta genom att klicka på Bild, Justera, Ljusstyrka/Kontrast i popup-fönstret.Linjeskanningen kommer nu att kalibreras för amplituden med fluorescensens intensitet uttryckt som fluorescensen dividerad med nollfluorescensen. STM kommer att visa antalet bildrutor i TIFF-stacken på x-axeln och antalet pixlar som representerar cellens längd på y-axeln. För att kvantifiera de tidsmässiga och rumsliga data från kalciumsignalerna klicka på Bild och Egenskaper och ange lämpliga värden för att fullständigt kalibrera STM för tid och rum i popup-fönstret.För att analysera de enskilda kalciumhändelserna klicka på Rak linje och klicka och dra på STM:en för att rita en rak horisontell linje genom mitten av en kalciumhändelse som är parallell med x-axeln. Klicka sedan på Analysera och Plot Profile. En ruta kommer att visas som visar plottningsprofilen för kalciumhändelsen.För partikelbaserad analys av ICC-MY-kalciumsignaleringsdata öppnar du filmfilen i Volumetry och högerklickar för att välja STK-filter, Differentiera. Högerklicka igen om du vill mata in ett värde för att skilja. Tryck på Retur och vänsterklick för att initiera differentieringen.Om du vill skapa partiklar använder du den mellersta musknappen för att bläddra igenom filmen för att välja ett 20 till 40-bildruteavsnitt som innehåller en quiescent-period, följt av förekomsten av ett kalciumtransientkluster och 20 till 40 bildrutor som följer direkt efter klustret. När alla av bildrutor har valts högerklicka i filmen fönstret för att komma åt STK OPS Ramp DS partikel info och klicka för att köra en rutin partikelanalys som successivt ramper tröskeln från den maximala till den minsta intensitet. För att säkerställa en lyckad partikelanalys, se till att du införliva så mycket pre-kalcium övergående kluster icke-aktivitet, och så mycket post-kalcium övergående kluster icke-aktivitet som du kan.Detta kommer att bidra till att öka signal-brus-förhållandet. Analysen kommer att visas grafiskt i plotfönstret som färgrit av buller och i fönstret traces som tre färgspår med den gröna spår som representerar antalet partiklar, den röda spår som representerar den genomsnittliga partikelstorleken och den blå spår som representerar den absoluta intensiteten tröskeln. Att histogram balansera tomten av partikelbrus tryck H på tangentbordet.Tryck sedan på den högra fästestangenten för att cykla igenom färgscheman tills bakgrunden är vit med färgspåren ovanpå. Tryck på F på tangentbordet en gång för att få fram ett mätverktyg. Tryck sedan på F en andra gång för att markera en enda vertikal linje i rullningslisten i traces-fönstret på tomten vid korsningen där de färgade tomterna börjar skifta till höger sida.Inom traces fönstret använda den mellersta musknappen för att bläddra från böjningspunkten för den röda spårningen till den markerade vita vertikala linjen. Efter att ha noterat det visade Y-medelvärdet klickar du på den mellersta musknappen igen inuti spårningsfönstret för att avmarkera den blå spårningen. I filmfönstret klicka på C för att få upp en färg hjul, och D för att justera tröskeln.Giltiga partiklar kommer nu att visas i rött, och de som mätta kommer att vara vit. Använd vänster musknapp för att bläddra tills de vita områdena tas bort och använd den mellersta musknappen för att justera det gula numeriska värdet i färghjulet till Y-medelvärdet för att tilldela allt i rött som en aktiv kalciumtransient partikel vid den bestämda tröskelpunkten. Om du vill spara data som en koordinatbaserad partikelfil högerklickar du för att komma åt STK 3D, sparar du partikeln noll och vänsterklick för att spara filen.För att skapa kartor partikel aktivitet värme öppna den sparade partikelfilen och högerklicka i filmen fönstret för att komma åt partikel STKops, StatMap Flagga och ange flagg uppdrag att analysera. Klicka för att tillämpa analysen och en värmekarta som visar de totala partiklarna för hela inspelningens längd med olika färger som representerar procentförekomsten under hela inspelningen. Högerklicka om du vill spara värmekartan som en TIFF-fil.Högerklicka sedan i filmfönstret för att komma åt partikelmått, partikelstatistik STK är lika med och ange en flaggtilldelning för analysen. En serie spår kommer att genereras i spårningsfönstret. STM-analys ger möjlighet att övervaka och registrera de rumsliga egenskaperna hos kalciumsignalering, såsom den rumsliga spridningen och förökningshastigheten.Denna information kan samlas för att ge en ganska fullständig bild av kalcium signalering beteenden inom celler i sina inhemska miljöer. Med hjälp av partikelanalys kan kvantitativ information om kalciumsignalering beräknas genom mätning av partikelområdet och partikelräkningen, som tillsammans kan användas för att bestämma de rumsliga intervallen för kalciumsignalaktivering inom ett angivet synfält. Partikelanalys möjliggör också en djupgående kvantifiering av subcellulär kalciumsignalering genom undersökning av platsen och bränning sannolikheter för kalcium bränning platser.Genom att fördela partiklarna i olika flaggor baserat på deras tidsmässiga egenskaper kan de initierande partiklarna mappas exakt. Och en mängd hårda data som förvärvats om antalet initieringsplatser, storleken på webbplatsen i pixlar och mikrometer, sannolikheten för varje inledande plats bränning antingen en gång eller flera gånger under varje kalcium övergående kluster, och andelen bränning platser som eld under varje kalcium övergående kluster cykel kan erhållas. Konsekvens är nyckeln till framgång i det här protokollet.Alla datamängder och alla filmer måste behandlas exakt likadant för att säkerställa tillförlitliga, repeterbara resultat. Detta gäller särskilt när man hanterar partikelfiler. Våra protokoll tillåter en djup karakterisering av kalcium signalering in situ, och en rad statistiska metoder, när de används på lämpligt sätt, kan bedöma skillnader mellan ett intervall av rumsliga och tidsmässiga parametrar.Dessa analystekniker i vårt protokoll har gjort det möjligt för forskare att fråga och svara på tidigare oadresserbara frågor om intestinal pacemaking, och intestinal innervation, samt neuronal kontroll av de nedre urinvägarna.

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Tekniker för Imaging Ca 2 + Signalering i mänskliga spermier

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualisering av Vascular Ca 2 + Signalering Triggade av parakrina Härledda ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Hög kapacitet fysisk Kartläggning av kromosomer med hjälp av automatiserad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snabb genetisk analys av Epithelial-mesenkymala Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Mätning intracellulär Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Förändringar i mänskliga spermier med fyra tekniker: Konventionell fluorometri Stoppad Flow fluorometri, flödescytometri och Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automatiserad analys av dynamiska Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaler i bildsekvenser

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Två-foton Imaging av intracellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Hantering och kväveoxidproduktion i Endothelial och glatta muskelceller av en isolerad råttaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optisk Kartläggning av Intra-sarkoplasmatiska retiklet Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Och transmembranpotentialen i Langendorff-perfusion Kanin hjärta

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...