Name: applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Finansman P01 DK41315 via NIDDK tarafından sağlandı.

Bütün hayvanlar kullanılan ve bu çalışmada yürütülen iletişim kuralları uyarınca Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları... Tüm yordamları kurumsal hayvan kullanımı ve bakımı Komitesi, University of Nevada, Reno tarafından kabul edildi.
1. nesil KitGCaMP6f fareler
<ol><li>Ai95 cross (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f fareler) ve c-Kit+/ Cre-ERT2 (Kit-Cre fareler ICC belirli GCaMP6f ifade hayvanlar (Kit-Cre-GCaMP6f fareler) oluştur...

Kez CA2 + görüntüleme olan belirli hücreleri sağlam dokularda veya ağları hücre içerisinde Ca2 + geçişler karmaşık desenler ortaya koymaktadır. Bu etkinlik dikkatli ve ayrıntılı analizler ve temelindeki olayları ve bu olayların kinetik hakkında mümkün olduğunca fazla bilgi yakalamak için miktar gerektirir. STM ve PTCL analiz bu tür kayıtları vermiştir nicel veri miktarını en üst düzeye çıkarmak için bir fırsat sağlar.
Dar, iğ şeklind...

CA2 + hücresel süreçler, kas kasılması1,2, metabolizma3, hücre proliferasyonu3,4, gibi geniş bir kontrol eden her yerde birden bulunan hücre içi haberci bir 5, sinir terminallerine6,7' nörotransmitter piyasaya uyarılması ve harekete geçirmek-in transkripsiyon faktörleri çekirdeğinde. 7 intrasellüler Ca2 + kez geçici yükselmeler sitozolik Ca2 +' biçiminde ve bunlar kendiliğinden veya agonist stimülasyon bağlı olarak hücre türü8kaynaklanan sinyalleri. Spatial, zamansal ve yoğunluk parametreleri içsel Ca2 + sinyalleri sıklığı, süresi, yayma, hız ve genlik gibi hücre içi sinyal verme5için, gerekli biyolojik bilgi verebilir misiniz 7 , 9. sitoplazmik Ca2 + sinyalleri neden olur akını Ca2 + hücre dışı uzaydan veya Ca2 + sürümü endoplazmik retikulum (ER) ile gelen Ca2 + yayın kanalları gibi ryanodine reseptörleri üzerinden (RyRs) ve inositol-tri-fosfat reseptörleri (IP3Rs)10. RyRs ve IP3Rs hem de Ca2 + sinyalleri nesile katkıda bulunabilir ve çeşitli Ca2 + akını mekanizmaları ile birlikte bu kanallar uyumlu açılış desenleri sinyalizasyon Ca2 + içinde sayısız yol açabilir Bu rakamlara göre şekillenir ve olasılık ifade profil Ca2 + akını ve yayın kanalları ve ifade ve Ca2 dağılımı arasındaki yakınlık Ca2 + Kanal yayın, Ca2 + kanal akın, açık + geri alım ve ekstrüzyon proteinler. CA2 + sinyalleri uzun ömürlü, Üniforma, birkaç saniye veya dakika bile, hücre içi mesafeler çapraz olabilir hücre içi ve hücreler arası Ca2 + dalgalarının yayılmasını sürebilir yüksek yoğunluklu küresel salınımlarını şeklinde olabilir 100'den fazla µm10,11,12,13,14,15,16veya daha fazla Ca2 + gibi dağınık şekilde yerelleştirilmiş olaylar kısa kıvılcım ve milisaniyelik zaman çizelgelerine onlarca üzerinde ortaya ve 5'ten µm17,18,19,20yaymak Ca2 + puffs.
Floresan mikroskopi izole ve kültürlü hücreleri ve sağlam dokulara sinyalizasyon Ca2 + izlemek için yaygın olarak kullanılmış. Geleneksel olarak, bu deneyler floresan Ca2 + göstergeleri, ratiometric kullanımı dahil ve sigara ratiometric gibi Fura2, Fluo3/4 ya da Rhod2, diğerleri arasında 21,22,23boyuyor. Bu göstergeler hücre membran geçirgen ve sonra hücrelerde endojen esterazlar üzerinden bir ester grubu bölünme tarafından tuzak haline için dizayn edilmiştir. Hücre ve dokulara uygun dalga boylarında ışık tarafından aydınlatılmış Ca2 + yüksek afinite göstergeleri için bağlama değişiklikleri floresans içinde neden oldu. Geçirgen Ca göstergeleri2 + hücre kullanımı oldukça bizim anlayış yaşayan hücreleri sinyal ve uzaysal çözünürlük ve Ca2 + sinyalleri raporlaması tarafından mümkün değildi miktar bu sinyallerin izin Ca2 + gelişmiş Elektrofizyoloji gibi diğer yollarla. Ancak, geleneksel Ca2 + göstergeleri genişletilmiş kayıt dönemleri24üzerinde oluşan photobleaching gibi bazı sınırlamaları vardır. Cal520/590 gibi büyük ölçüde geliştirilmiş sinyal noise oranları ve yerel Ca2 + sinyalleri25algılama yeteneğini daha yeni Ca2 + göstergesi Boyayıcılar, photobleaching ile ilgili sorunlar hala bazı araştırmacılar için bir endişe kalır 26,27,28. Sarp photobleaching da büyütme oranı resim alma, kısıtlar ve artan nesnel güç ve resim alma daha yüksek oranda gerektiği, kayıtları için kullanılabilecek çözünürlük uyarma ıșık yoğunluğu artmış bu photobleaching artırır.
Bu sınırlamaları geleneksel Ca2 + göstergesi boyalar Ca2 + sinyalleri in situ olarak kaydederken şiddetlenir, örneğin ne zaman kayıt intrasellüler Ca2 + sağlam dokulardan sinyalleri. Yukarıdaki sorunları nedeniyle görselleştirme sinyallerin Ca2 + hücre geçirgen Ca2 + göstergeler kullanarak in situ düşük güç büyütme için sınırlı edilmiş ve görüntü yakalama, müfettişler kaydetmek için yetenek zorlayıcı indirdi ve geçici veya dağınık şekilde sınırlı hücre altı Ca2 + sinyalleri ölçmek. Böylece, yakalama, analiz ve yukarıda belirtildiği gibi istenen biyolojik yanıt, üretimi önemli olabilir Ca2 + sinyalleri, kayma ve temporal karmaşıklığı takdir etmek zor oldu. Ca2 + sinyalleri hücrelerden yerinde analizi genellikle faiz (ROI) görüş (FOV) bir alan içinde seçilen bölgelerinden basit yoğunluk ölçümleri kullanır. Sayısı, boyutu ve konumunu ROIs, araştırmacı, kapris bağımlı rasgele seçimi ciddi bir şekilde elde edilen sonuçları önyargı. Yatırım getirisi analizi ile doğal önyargı yanı sıra bu yaklaşım çok önemli dikkate almaz FOV, dinamik Ca2 + olayları bir keyfi olarak seçilen içinde bulunan bilgi sinyal ROI seçilir analiz için. Ayrıca, ROIs Analizi gözlenen Ca2 + sinyalleri mekansal özellikleri hakkında bilgi sağlamak başarısız olur. Örneğin, mümkün olmayabilir bir artış bir yayılmasını kaynaklanan Ca2 + ayırt etmek için Ca2 + sinyal bir yatırım getirisi içinde hesaplamalar olayından Ca2 + dalga ve bir çok yerelleştirilmiş Ca2 + serbest.
Genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri (turk) gelişiyle kökten nasıl Ca2 + görüntüleme gerçekleştirilen in situ29,30,31,32,33 olabilir değişti . Turk boyalar üzerinde kullanarak birkaç avantajı vardır. En önemli belki de GECI ifade hücreleri istenmeyen arka plan kirlenme değil ilgi azaltan bir hücre belirli bir şekilde, gerçekleştirilebilir olduğunu. O photobleaching azalır geleneksel Ca2 + göstergeleri turk başka bir avantajı olduğunu (floresan ve dolayısıyla photobleaching sadece gerçekleştiği sırada ne zaman hücreleri aktif), özellikle de yüksek boya yüklü örnekleri ile karşılaştırıldığında büyütme ve görüntü yüksek oranda34yakalayın. Böylece, optogenetic sensörler, GCaMP dizi tanıyor gibi müfettişler kaydetmek için yetenek Turk ile görüntüleme ve kısa, yerelleştirilmiş alt hücresel Ca2 + in situ sinyalleri içindeki hücreleri sinyal Ca2 + araştırmak onların daha önce mümkün olmamıştır doğal ortamlar. Böyle yüksek çözünürlüklü kayıtlarından bilgi kurtarılması en üst düzeye çıkarmak için Ca2 + sinyalleri uygun kayma ve zamansal analizi gereklidir. Turk bazı avantajları açık sunabilir iken, son yıllarda yapılan çalışmalarda Ca2 + görüntüleme başarıyla aynı anda geleneksel kullanarak nöronların farklı nörokimyasal sınıfların büyük nüfus gerçekleştirilmesi indirdik ki unutulmamalıdır Hayvan35genetik olarak kodlanmış değil Ca2 + göstergeleri. Bu yaklaşım öğleden hoc immünhistokimya yüksek frekans eşitlenmiş öbek halinde ateş nöronların birden çok farklı sınıflar ortaya çıkarmak için kullanılan ve hayvan genetik değişiklikler fizyolojik ile müdahale potansiyel kaçınılması 35,36anlamak için davranış araştırmacı çalışmaktadır.
Bu makalede özetlenen protokolleri daha kapsamlı çözümlemesini kolaylaştıran ve Ca2 + miktar sinyalleri kaydedilen hücrelerden yerinde kronolojik zamanmekansal harita (STM) bir birleşimini kullanarak-tabanlı analiz ve parçacık tabanlı analiz. İletişim kuralları ayrıca nüfus yerinde uygun şekilde çözümlenebilir farklı hücresinde gözlenen sinyal Ca2 + ne kadar farklı desenler açıklar. Gösterim amacıyla, yöntem hücrelerde ince bağırsak, interstisyel hücreleri Cajal (ICC) özel bir nüfus içinde sinyal Ca2 + muayene edecektir. ICC sinyal, dinamik intrasellüler Ca2 + sergi fareler GCaMPs37,38,39,40ifade kullanarak görüntülenir gibi özel hücreler gastrointestinal (GI) sistem içinde vardır, 41,42. CA2 + geçişler ICC içinde harekete geçirmek-in Ca2 +için bağlı-Cl- bağırsak düz kas hücreleri (SMCs)43, uyarılabilirlik düzenlenmesinde önemlidir ( Ano1tarafından kodlanmış) kanalları aktive 44,45. Böylece, ICC içinde sinyal Ca2 + bağırsak hareketliliği anlamak için temel bir çalışmadır. ICC anatomik olarak ayrılmış ve bağımsız olarak görüntülenmiştir iki sınıf olarak fare bağırsağı bu gösteri için mükemmel bir örnek sunar: Ben) ICC dairesel ve boyuna düz kas arasındaki bölgede yer alan katmanları, myenteric pleksus çevreleyen (ICC MY). Bu hücreler kalp pili hücreleri olarak hizmet ve yavaş dalgalar46,47,48,49bilinen elektrik etkinliği oluşturduğunu; II) ICC ayrıca bir pleksus motor nöronlar (derin kas pleksus, böylece ICC DMP) terminalleri içinde zengin arasında yer vardır. Bu hücreler enterik motor neurotransmission37,39,40,50tepkilerin arabulucu olarak hizmet vermektedir. ICC MY ICC DMP morfolojik ayrı ve Ca2 + sinyal davranışları onların belirli görevleri yerine getirmek için kökten farklıdır. ICC MY şeklinde yildiz seklinde ve birbirine bağlı hücre boşluğu kavşak51,52üzerinden bir ağ oluştururlar. CA2 + zaman uyumsuz olarak görüntülenmeyecektir FOV (60 X amacı ile görüntüsü)38içinde olarak ICC benim ağ üzerinden birden çok site oluşan kısa ve dağınık şekilde yerelleştirilmiş Ca2 + yayın olaylar olarak ICC MY bildiriminde sinyalleri. Bu zaman uyumsuz sinyalleri geçici düzenlenmiştir 1 saniye kümeleri, net 1 s hücresel artış Ca2 +birlikte tablo zaman tutar. Bu sinyaller hücre hücre ICC ağ içinde yayar ve bu nedenle sinyal, alt hücresel sitelerden bir doku geniş Ca2 + dalga oluşturulan Ca2 + düzenlemek. Zamansal kümeleme ve Ca2 + özetlemesi sinyalleri içinde ICC MY Ca2 + geçici kümeleri (CTCs)38olarak adlandırdığı. CTCs ritmik 30 dakikada kez fare (örneğin oldukça aynı süreye ve CTCs arasında benzer dönemleri) oluşur. Diğer taraftan, ICC DMP şeklinde iğ hücreleri, bazı SMCs ve varisli sinir işlemler arasında dağıtmak ve bağımsız olarak ikincil süreçleri ile bir ağ51,52oluştururlar. ICC DMP formu boşluğu kavşak ile SMCs, ancak ve işlev SIP syncytium53bilinen bu büyük syncytium içinde. Hücreleri uzunlukları boyunca birden çok site CA2 + sinyalleri oluşur, ancak bu geçişler değil entrained veya geçici kümelenmiş, ICC MY37içinde gözlemlediği gibi. CA2 + sinyalleri ICC DMP içinde değişken yoğunluklarını, süreleri ve mekansal özellikleri ile Stokastik bir şekilde meydana gelir. ICC-MY içinde sinyal Ca2 + örneği kullanarak aşağıda iletişim kuralları ve ICC-DMP, hücreler in situ olarak belirli türde karmaşık sinyal analiz teknikleri açıklar. Biz indüklenebilir Cre-Lox p Sistem aktivasyonu Cre-Recombinase (Cre) bir ICC belirli düzenleyici (Kit) tarafından tahrik inducing sonra ICC, içinde sadece GCaMP6f ifade etmek için kullanılmaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.5a</td>
			<td>Image J software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetry</td>
			<td>GWH</td>
			<td>Volumetry 8Gd</td>
			<td>Custom made analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>NDC 10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6F mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit-Cre mice</td>
			<td>Gifted From Dr. Dieter Saur</td>
			<td>c-Kit+/Cre-ERT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular ca2+ signaling in situ

Kez CA2 + görüntüleme izole hücre veya hücreleri sağlam dokularda belirli türleri Ca2 + sinyal karmaşık desenler ortaya koymaktadır. Bu etkinlik dikkatli ve ayrıntılı analizler ve temelindeki olayları hakkında mümkün olduğunca fazla bilgi yakalamak için miktar gerektirir. Spatial, zamansal ve yoğunluk parametreleri içsel Ca2 + sinyalleri sıklığı, süresi, yayma, hız ve genlik gibi hücre içi sinyal için gerekli bazı biyolojik bilgi sağlayabilir. Genellikle zaman ölçülebilir veri görüntüleme bilgileri çeviri açısından süreci ve bu sürecin alıcı veri dosyaları edinimi sonuçlarında Imaging yüksek çözünürlüklü Ca2 + insan hatası ve önyargı duyarlı olabilir. Ca2 + sinyalleri hücrelerden yerinde analizi genellikle faiz (ROI) görüş (FOV) bir alan içinde keyfi olarak seçilen bölgelerinden basit yoğunluk ölçümleri kullanır. Bu yaklaşım çok FOV içinde yer alan önemli sinyal bilgilerin dikkate almaz. Böylece, Ca2 +boya veya optogenetic Ca2 + ile elde edilen yüksek çözünürlüklü böyle kayıtlarından bilgi kurtarma maksimize etmek için görüntüleme, uygun kayma ve zamansal Analizi Ca2 + sinyalleri gereklidir. Bu makalede özetlenen protokolleri nasıl veri büyük miktarda daha kapsamlı analiz ve miktar bir birleşimini kullanarak hücrelerinden kaydedilen Ca2 + sinyal kolaylaştırmak için Ca2 + görüntü kayıtlarından elde edilebilir anlatacağım zamanmekansal harita (STM)-tabanlı analiz ve parçacık tabanlı analiz. İletişim kuralları ayrıca nüfus yerinde uygun şekilde çözümlenebilir farklı hücresinde gözlenen sinyal Ca2 + ne kadar farklı desenler açıklar. Gösterim amacıyla, yöntem hücrelerde ince bağırsak, interstisyel hücreleri turk kullanarak, Cajal (ICC), özel bir nüfus içinde sinyal Ca2 + muayene edecektir.

Kit-Cre-GCaMP6F fareler (Şekil 1), gastrointestinal sistem ICC davranışlarını yerinde yansıma sinyali dinamik Ca2 + kullanarak. Confocal mikroskobu ile ICC belirli nüfusun yüksek çözünürlüklü görüntüler aynı doku içinde ancak odak (Şekil 2A)37 anatomik olarak farklı uçaklarda ICC diğer nüfus gelen sinyalleri bulaşıcı olmadan elde edilebilir , <sup class="xre...

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ at JoVE.com

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri (turk) nasıl yerinde Ca2 + görüntüleme gerçekleştirilir kökten değişti. Veri kurtarma gibi kayıtları en üst düzeye çıkarmak için Ca2 + sinyal uygun analiz gereklidir. Bu kağıt Protokoller'de Ca sinyalleri2 + yerinde kronolojik zamanmekansal haritalama ve analiz parçacık tabanlı kullanarak kaydedilen miktar kolaylaştırmak.

Kendisinin geçici eşleme ve parçacık analiz teknikleri intrasellüler Ca sinyal2 + in Situ ölçmek için uygulamaları

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Kalsiyum görüntüleme deneylerinden büyük miktarda veri elde etme kapasitesi, özellikle doku görüntüleme deneyleriyle büyük ölçüde artmıştır. Protokollerimiz, bu veri kümelerini ölçmek ve tanımlamak için uygun analiz tekniklerini açıklar. Protokollerimiz tüm dokularda kalsiyum sinyaline özgü bir dizi mekansal, zamansal ve yoğunluk değerleri üretir ve bu daha ilkel tabanlı analizlerde kaybedilebilir.Görüntülemeden bir saat önce, cajal veya ICC'nin interstisyel hücreleri olan ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatını dönen disk konfokal mikroskobu aşamasına ifade eden bir fareden alınan ince bağırsağı aktarır. Ve sürekli 37 derece Santigrat Krebs-Ringer bikarbonat veya KRB çözeltisi ile doku perfüzyon. 60-100 X büyütme kullanarak ince bağırsağın dairesel ve uzunlamasına düz kas katmanları arasında stellat şekilli mienterik pleksus ICC veya ICC-MY bulun.Daha sonra dairesel düz kas tabakası ve submukozal pleksus arasında tek bir düzlemde mil şeklinde derin kas pleksus ICC veya ICC-DMP bulmak ve TIFF görüntüleri bir yığın olarak film kaydetmek. ICC-DMP kalsiyum aktivitesinin spatiotemporal haritaları veya STM'leri oluşturmak için ImageJ'deki görüntü yığınını açın ve görüntü kalitesini değiştirmek için Resim, Tür ve 32 bit'i tıklatın. Satır tarası oluşturmak için satır seçim aracına sağ tıklayın ve parçalı satırı seçin.Tek sol tıklamalar kullanarak, tüm hücre ana hatları ana hatları yla belirtildiğinde çift tıklatarak, tek bir ICC-DMP'nin orta erişimi boyunca bir çizgi çizin. Resim, Yığınlar ve Yeniden Dilimle'yi seçin. Açılır pencere görüntülenir.Çizgi tonu'nu soldan sağa yönlendirmek için 90 derece döndür'ü seçin, böylece kalibrasyon yapılabilir ve x ekseninde zamana karşı okunabilir ve y ekseninde boşluk tutamaz ve Tamam'ı tıklatın. Spatiotemporal harita görünecektir. Haritadaki kalsiyum sinyallerinin genliğini doğru bir şekilde ölçmek için dikdörtgen seçimi seçin ve STM içinde en düzgün ve en yoğun floresan alanını gösteren alanın etrafına ilgi alanı çizin. Seçili ilgi alanı içindeki yoğunluğun ortalama değerini elde etmek için Analiz ve Histogram'ı tıklatın ve tüm STM'yi seçmek için Tümünü Seç'i tıklatın.Ardından, İşlem, Matematik ve Bölme'yi tıklatın ve açılan kutuda ilgi çekici seçilen STM bölgesiyle yoğunluğun ortalama değerini girin. STM siyaha dönecek. Açılan pencerede Resim, Ayarla, Parlaklık/Kontrast ve Otomatik'i tıklatarak bunu düzeltin.Hat tonu şimdi floresan sıfır floresan tarafından bölünmüş olarak ifade edilen floresan yoğunluğu ile genlik için kalibre edilecektir. STM, X ekseninde TIFF yığınındaki kare sayısını ve y ekseninde hücrenin uzunluğunu gösteren piksel sayısını görüntüler. Kalsiyum sinyallerinden gelen zamansal ve uzamsal verileri ölçmek için Resim ve Özellikler'i tıklatın ve açılan pencerede STM'yi uzay ve zaman için tam olarak kalibre etmek için uygun değerleri girin.Bireysel kalsiyum olaylarını analiz etmek için Düz Çizgi'yi tıklatın ve x eksenine paralel bir kalsiyum olayının merkezinden düz yatay bir çizgi çizmek için STM'yi tıklatın ve sürükleyin. Ardından Analiz et ve Profili Oluştur'u tıklatın. Kalsiyum olayının çizim profilini gösteren bir kutu görüntülenir.ICC-MY kalsiyum sinyal verilerinin parçacık tabanlı analizi için, film dosyasını Volumetry'de açın ve STK Filtresi, Farklılaştırma'yı seçmek için sağ tıklayın. Ayırt etmek için bir değer giriş yapmak için tekrar sağ tıklatın. Farklılaşmayı başlatmak için Enter tuşuna basın ve sol tıklatın.Parçacıklar oluşturmak için, filmde gezinmek için orta fare düğmesini kullanarak, bir ikilik periyot içeren 20-40 karelik bir bölüm seçin, ardından bir kalsiyum geçici küme ve kümeden hemen sonra takip eden 20 ila 40 kare oluşumunu izleyin. Tüm kareler stk OPS Rampa DS parçacık bilgilerine erişmek için film penceresinde sağ tıklandığında ve eşiği en üst ten minimum yoğunluğa kademeli olarak rampalayan bir parçacık analizi yordamını çalıştırmak için tıklatın. Başarılı bir parçacık analizi sağlamak için, mümkün olduğunca çok ön-kalsiyum geçici küme non-aktivite ve çok post-kalsiyum geçici küme non-aktivite dahil emin olun.Bu sinyal-gürültü oranını artırmak için yardımcı olacaktır. Analiz, gürültü nün çizimi olarak çizim penceresinde grafik olarak ve parçacık sayısını temsil eden yeşil iz, ortalama parçacık boyutunu temsil eden kırmızı iz ve mutlak yoğunluk eşiğini temsil eden mavi iz ile üç renk izi olarak izleme penceresinde görüntülenir. Histogram için parçacık gürültü nün çizimini klavyedeki H tuşuna basın.Ardından, arka plan beyaz olana ve üstteki renk izleri olana kadar renk şemaları arasında geçiş yapmak için sağ ayraç tuşuna basın. Bir ölçüm aracı getirmek için klavyedeki F tuşuna bir kez basın. Ardından, renkli çizimlerin sağ tarafa kaymaya başladığı kavşaktaki çizim deki izleme penceresinin kaydırma çubuğundaki tek bir dikey çizgiyi işaretlemek için ikinci kez F tuşuna basın.İzler penceresi içinde işaretli beyaz dikey çizgi kırmızı izleme nin dönüm noktasından kaydırmak için orta fare düğmesini kullanın. Görüntülenen Y ortalamasını kaydettikten sonra, mavi izlemeyi seçmek için izleme penceresinin içindeki orta fare düğmesini yeniden tıklatın. Film penceresinde renk çarkını getirmek için C'yi ve eşiği ayarlamak için D'yi tıklatın.Geçerli parçacıklar şimdi kırmızı renkte gösterilecektir ve doygunluk yapanlar beyaz olacaktır. Beyaz alanlar kaldırılana kadar kaydırmak için sol fare düğmesini kullanın ve renk çarkındaki sarı sayısal değeri y ortalama değerine ayarlamak için orta fare düğmesini kullanarak her şeyi belirlenen eşik noktasında aktif kalsiyum geçici parçacık olarak kırmızı olarak atayın. Verileri koordinat tabanlı parçacık dosyası olarak kaydetmek için STK 3D'ye erişmek için sağ tıklatın, parçacık sıfırı kaydedin ve dosyayı kaydetmek için sol tıklatın.Parçacık etkinliği ısı haritaları oluşturmak için kaydedilen parçacık dosyasını açın ve parçacık STKops, StatMap Bayrak erişmek ve analiz etmek için bayrak atamaları girmek için film penceresinde sağ tıklayın. Analiz ve kayıt boyunca yüzde oluşumu nu temsil eden farklı renklerle kayıt tüm uzunluğu için toplam parçacıkları gösteren bir ısı haritası uygulamak için tıklatın. Isı haritasını TIFF dosyası olarak kaydetmek için sağ tıklatın.Ardından parçacık ölçüsüne erişmek için film penceresinde sağ tıklatın, parçacık istatistikleri STK eşittir ve çözümleme için bir bayrak ataması girin. İzleme penceresinde bir dizi izleme oluşturulur. STM analizi, kalsiyum sinyalinin uzamsal yayılma ve yayılma hızı gibi uzamsal özelliklerini izleme ve kaydetme olanağı sağlar.Bu bilgiler, kendi ortamlarında hücreler deki kalsiyum sinyaldavranışlarının tam bir görünümünü sağlamak için toplanabilir. Parçacık analizi kullanılarak, kalsiyum sinyali ile ilgili nicel bilgiler parçacık alanı ve parçacık sayısı ölçülerek hesaplanabilir ve bu bilgiler, belirli bir görüş alanı içinde kalsiyum sinyali aktivasyonunun uzamsal aralıklarını belirlemek için birlikte kullanılabilir. Parçacık analizi aynı zamanda yerin incelenmesi ve kalsiyum ateşleme bölgelerinin ateşleme olasılıkları ile hücre altı kalsiyum sinyallerinin derinlemesine ölçülmesine olanak sağlar.Parçacıkları zamansal özelliklerine göre farklı bayraklara ayırarak, başlatan parçacıklar doğru bir şekilde eşlenebilir. Ve inisiyasyon sitelerinin sayısı, piksel ve mikrometre olarak sitenin boyutu, her bir kalsiyum geçici küme sırasında bir veya birden çok kez ateş her başlatma sitesi olasılığı ve her kalsiyum geçici küme döngüsü sırasında ateş ateş siteleri yüzdesi elde edilebilir sabit veri zenginliği elde edilebilir. Tutarlılık bu protokolde başarının anahtarıdır.Güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tüm veri kümeleri ve tüm filmler aynı şekilde ele alınmalıdır. Bu özellikle parçacık dosyaları ile ilgili doğrudur. Protokollerimiz kalsiyum sinyalinin yerinde derin bir karakterizasyonuna olanak sağlar ve uygun kullanıldığında bir dizi istatistiksel yöntem, çeşitli mekansal ve zamansal parametreler arasındaki farklılıkları değerlendirebilir.Protokolümüzdeki bu analiz teknikleri, araştırmacıların bağırsak pacemaking ve bağırsak innervasyonu ile ilgili daha önce ele alınamayan soruların yanı sıra alt üriner sistemin nöronal kontrolünü sormalarına ve yanıtlamalarına olanak sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Görüntüleme Ca Teknikleri 2 + İnsan Sperm sinyal

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Hücre içi Ca Ölçme<sup&gt; 2 +</supDört Teknikleri ile İnsan rm&gt; Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup&gt; 2 +</supGörüntü Dizilerinde&gt; Sinyaller

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...