Name: intra-cardiac side-firing light catheter for monitoring cellular metabolism using transmural absorbance spectroscopy of perfused mammalian hearts
Uploaded: 2019-05-12T13:30:00
Duration: 8 min 51 s
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这项工作得到了NHLBI校内计划(项目+ZIA HL00460131)的全力支持。

所有动物协议均获得国家心肺和血液研究所动物护理和使用委员会的批准,并按照《动物护理和福利法》(USC 2142 + 13)中所述的准则执行。
1. 分离的渗透心脏系统和渗透
注:此准备与以前的出版物23非常相似。
<ol><li>使 4 升改性克雷布斯-亨塞利特渗透液组成(在 mmol/L) 137.0 纳Cl, 5.4 KCl, 1.8CaCl 2, 0.5 MgCl2,1.0 Na2HPO4,10.0 葡萄糖, 1.0 乳酸, 和 10.0 HEPES.</li>
	<li>pH 在 37°C 时与 NaOH 和 HCl 的渗透液为 7.4。</li>
	<li>通过 1 μm 孔膜过滤渗透。</li>
	<li>通过运行和排空净化水,冲洗注入心脏系统的所有管和腔室。</li>
	<li>将渗透液转移到水箱中,并用 100% O2与气泡进行氧气,同时使用加热循环水浴将温度保持在 37°C。</li>
	<li>添加 2 个 12 μm 孔膜过滤器,并在 Langendorff 模式下循环时,使用渗透器为系统注发。</li>
	<li>将管紧放在主动脉管上方的管上,并调整螺钉,使主动脉流量降至约 10 mL/min。</li>
</ol>2. 兔心切除和灌注
<ol><li>心脏切除<ol>
<li>通过1.5 mL的肌内注射氯胺酮/乙丙丙胺混合物(10:1)麻醉新西兰雄性白兔(约3公斤)。</li>
		<li>大约10-15分钟后,通过吸入施用3%异苯二苯,获得完整的麻醉效果。</li>
		<li>通过脚趾捏合确认适当的麻醉深度,然后在边缘耳静脉中放置一条线,用于后续药物的给药。</li>
		<li>注射1,500单位(或1.5 mL的1,000单位/mL)的肝素,让循环3分钟。</li>
		<li>仔细检查适当的麻醉深度,然后用KCl的6 mEq(或3 mL 2 mEq/mL)安乐死。</li>
		<li>迅速打开胸部,找到心脏的顶点和主塔。通过尽可能远离心脏的主动脉切除心脏,并尽可能切离肺部的肺静脉。 注:在此早期阶段的肺切除与以前的出版物23不同,但对准备没有影响。</li>
		<li>将心脏放在一个小烧杯中的渗透液(与步骤 1.3 相同),放在一桶冰中,以便从手术到灌注。</li>
	</ol>
</li>
	<li>心脏罐<ol>
<li>牢固地固定和系好主动脉,确保主动脉内不包含任何气泡。</li>
		<li>在 70 mmHg 灌注压力下启动流量,拆下主动脉上的管夹,并在手术和血管管网的剩余时间内保持此压力。</li>
		<li>将肺动脉与主动脉和其他血管分开,并分离静脉和肺静脉。去除脂肪和结缔组织仍然存在。</li>
		<li>对肺动脉进行加乃加,以测量冠状鼻利命流速和氧张力。</li>
		<li>在准备过程中,从心脏中丢弃初始流(约10分钟),以消除血液和手术碎片。过了这个时期,再循环渗透。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 侧燃光纤放置
<ol><li>将光纤导管连接到高功率光纤耦合 LED 白光源,以帮助可视化,并在心脏中提供光谱光。</li>
	<li>切左心房的一个小附属物,通过斜面阀将导管插入左心室,然后旋转它,实现左侧心室无光壁的照明。</li>
	<li>将拾取光纤直接放置在离心脏约 1 厘米的左心室最大照明区域正对面。</li>
	<li>将拾取光纤的另一端连接到快速扫描光谱仪。</li>
</ol>4. 光学光谱
<ol><li>关闭实验区的灯光,以获得完全的黑暗。</li>
	<li>启动自定义程序,集成光谱仪驱动器,以执行数据采集和传输光的实时分析。 注: 光谱采集和分析程序的合并版本的可执行版本作为补充编码文件提供。源代码可按要求提供给作者。</li>
	<li>浏览所有提示,选择用于透光心脏光谱采集模式的选项。在下一页上,指示是否正在进行辅助数据收集。最后,输入采集参数,包括色相参考光谱和要保存的数据的位置。</li>
	<li>输入带宽为 490*630 nm。</li>
	<li>输入 2 Hz 的采样率(即 2 个采样/秒)。</li>
	<li>收集暗电流或零光光谱,通过关闭光源来校正背景信号电平。</li>
	<li>单击以选择要在拟合例程中使用的色度参照。</li>
	<li>在"获取数据"页中,调整导管和拾取光纤的位置,以最大化软件上显示的透射光,并特别注意 500 nm 区域的信号振幅,其中含氧肌红蛋白应观察吸收。</li>
	<li>确保传输的光线未使探测器在 600 nm 区域饱和。</li>
	<li>通过关闭导管照明并确认现在未检测到光线,确保外部光源不会对收集的频谱作出贡献。</li>
	<li>单击"保存光谱"按钮启动数据收集。</li>
	<li>单击"设置为控制"可查看从未来光谱到当前"控制"光谱的差异吸收度光谱。</li>
	<li>根据需要执行任何生理扰动。<ol>
<li>协议1:氰化物对心脏性能和色度吸收的影响<ol>
<li>停止从心脏灌注中循环液体。</li>
			<li>使用注射器泵,在流入心脏时,以不同速率将氰化物(pH 7 时为 2.5 至 75 mM)注入渗透剂,在主动脉管前达到所需的氰化物浓度(0.025 至 1 mM,根据主动脉流速计算),同时将渗透剂注入心脏监测心脏功能和光学特性。</li>
			<li>当对冠状动脉流动和心率的影响以及通过心壁的光学传输处于稳定状态时,停止氰化物注射器泵。</li>
		</ol>
</li>
		<li>协议2:缺血/缺氧<ol>
<li>停止氰化物输注。</li>
			<li>5 分钟后,将冒泡气体从 100% 氧气切换到 100% 氮气,以去除系统中的氧气。</li>
			<li>约 10 分钟后,停止流动以模拟总缺血/缺氧情况。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 光谱数据分析
<ol><li>在注入的心脏分析模式下运行程序。</li>
	<li>选择适当的光谱仪。</li>
	<li>输入数据文件路径和参考光谱文件,并选择导管光源,该光源加载导管光源的预保存光谱。</li>
	<li>选择"读取 Bin数据"。</li>
	<li>选择设置最小波长和最长。</li>
	<li>输入数据分析的带宽为 490*630 nm。</li>
	<li>选择返回主菜单。</li>
	<li>选择"读取参考"。</li>
	<li>确认要在分析中使用参考光谱。</li>
	<li>选择返回主菜单。</li>
	<li>在主菜单中选择时间点。</li>
	<li>选择 T0 时间点作为控件,并将范围设置为 100 磅。</li>
	<li>选择 T1 时间点作为 100 点范围内的实验周期。</li>
	<li>观察平均 Abs. 频谱选项卡中的原始差分谱。</li>
	<li>选择"计算拟合系数",然后单击"拟合系数"选项卡以观察参考光谱拟合的时间过程。</li>
	<li>返回到主菜单并选择"计算差分 Abs"。</li>
	<li>在所有位置选择 T0 和 #T1。观察"差分谱"窗口中的拟合频谱和参考权重窗口中的拟合元件。</li>
	<li>重复此过程以比较实验中的其他时间点。</li>
	<li>返回到主菜单。</li>
	<li>通过键入所需名称并选择"保存数据"以与其他程序进行进一步分析,在电子表格报表中保存数据和分析。 注:如果未键入名称,则报告将保存与输入文件相同的名称。报表保存在一个名为Excel 分析文件的文件夹中,该文件夹与原始输入文件位于同一文件夹中。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Arai, A. E., Kasserra, C. E., Territo, P. R., Gandjbakhche, A. H., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+oxygenation+in+vivo:+optical+spectroscopy+of+cytoplasmic+myoglobin+and+mitochondrial+cytochromes.">Myocardial oxygenation in vivo: optical spectroscopy of cytoplasmic myoglobin and mitochondrial cytochromes.</a> American Journal of Physiology. 277, 683-697 (1999).</li><li>Epstein, F. H., Balaban, R. S., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+state+of+cytochrome+aa3+in+isolated+perfused+rat+kidney.">Redox state of cytochrome aa3 in isolated perfused rat kidney.</a> American Journal of Physiology. 243 (4), 356-363 (1982).</li><li>Hassinen, I. E., Hiltunen, J. K., Takala, T. E. 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W., Kupriyanov, V. V., Marshall, R., Fralix, T. A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+oxygenation+in+the+isolated+working+rabbit+heart+as+a+function+of+work.">Myocardial oxygenation in the isolated working rabbit heart as a function of work.</a> American Journal of Physiology. 262, 255-267 (1992).</li><li>Arakaki, L. S., Burns, D. H., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+myoglobin+oxygen+saturation+by+optical+spectroscopy+measured+in+blood-perfused+rat+muscle.">Accurate myoglobin oxygen saturation by optical spectroscopy measured in blood-perfused rat muscle.</a> Applied Spectroscopy. 61 (9), 978-985 (2007).</li><li>Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoglobin+oxygen+affinity+in+aquatic+and+terrestrial+birds+and+mammals.">Myoglobin oxygen affinity in aquatic and terrestrial birds and mammals.</a> The Journal of Experimental Biology. 218, 2180-2189 (2015).</li><li>Wright, T. J., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoglobin+extraction+from+mammalian+skeletal+muscle+and+oxygen+affinity+determination+under+physiological+conditions.">Myoglobin extraction from mammalian skeletal muscle and oxygen affinity determination under physiological conditions.</a> Protein Expression and Purification. 107, 50-55 (2015).</li><li>Shibata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+oxygen+affinity+and+autoxidation+of+myoglobin.">Relationship between oxygen affinity and autoxidation of myoglobin.</a> Inorganic Chemistry. 51 (21), 11955-11960 (2012).</li><li>Kim, N., Ripple, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+spectroscopy+in+turbid+media+using+an+integrating+sphere:+mitochondrial+chromophore+analysis+during+metabolic+transitions.">Optical spectroscopy in turbid media using an integrating sphere: mitochondrial chromophore analysis during metabolic transitions.</a> Analytical Biochemistry. 439 (2), 161-172 (2013).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+mapping+of+the+Langendorff-perfused+rabbit+heart.">Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Coburn, R. F., Grubb, B., Aronson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyanide+on+oxygen+tension-dependent+mechanical+tension+in+rabbit+aorta.">Effect of cyanide on oxygen tension-dependent mechanical tension in rabbit aorta.</a> Circulation Research. 44 (3), 368-378 (1979).</li><li>Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoglobin+oxygen+dissociation+by+multiwavelength+spectroscopy.">Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy.</a> Journal of Applied Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).</li><li>Femnou, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracardiac+light+catheter+for+rapid+scanning+transmural+absorbance+spectroscopy+of+perfused+myocardium:+measurement+of+myoglobin+oxygenation+and+mitochondria+redox+state.">Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).</li><li>Giles, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+Arteriole+Constriction+Compromises+Cytosolic+and+Mitochondrial+Oxygen+Delivery+in+the+Isolated+Saline-Perfused+Heart.">Paradoxical Arteriole Constriction Compromises Cytosolic and Mitochondrial Oxygen Delivery in the Isolated Saline-Perfused Heart.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory. , (2018).</li><li>Matthews, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+31P-NMR+study+of+some+metabolic+and+functional+effects+of+the+inotropic+agents+epinephrine+and+ouabain,+and+the+ionophore+R02-+2985+(X537A)+in+the+isolated,+perfused+rat+heart.">A 31P-NMR study of some metabolic and functional effects of the inotropic agents epinephrine and ouabain, and the ionophore R02- 2985 (X537A) in the isolated, perfused rat heart.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 720, 163-171 (1982).</li><li>Lewandowski, E. D., Damico, L. A., White, L. T., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+responses+to+induced+lactate+oxidation:+NMR+analysis+of+metabolic+equilibria.">Cardiac responses to induced lactate oxidation: NMR analysis of metabolic equilibria.</a> American Journal of Physiology. 269, 160-168 (1995).</li><li>Lewandowski, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplet+structure+of+13C+NMR+signal+from+glutamate+and+direct+detection+of+tricarboxylic+acid+(TCA)+cycle+intermediates.">Multiplet structure of 13C NMR signal from glutamate and direct detection of tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 35 (2), 149-154 (1996).</li><li>Ball, D. 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未声明任何利益冲突。

孤立的逆行或工作渗透心脏制剂是心脏生理学研究以及心脏技术和药物的临床前研究的支柱。其使用的关键是制备方便,功能特性强,对实验参数的控制,以及测量跳动心脏的许多功能参数的能力。光学吸收光谱提供对组织氧合以及线粒体代谢活动的洞察。光学光谱学主要在反射模式下的隔离透射心脏研究中进行,由于运动和光散射并发症,这些研究很难解释。
我们引进了心室壁透射光学光谱(VWTOS),为监测心脏组织代谢色球提供了可靠的方法。在以前的出版物中,我们演示了连接到同轴电缆20尖端的 LED 可制造独特的心内侧射光源,可用于 VWTOS 注入心脏。侧射是指垂直于导管长轴的光的投影,是照亮心室自由壁的理想选择。LED 导管足够小,不会影响心脏功能,但需要在实验室进行专门制造。目前的研究提出了使用500微米商业侧射导管,可以耦合到任何与光纤兼容的光源。这些侧射光学导管是为垂直于光纤长轴的激光消融而开发的。当然,我们使用的光功率比光消融所需的低得多。较小的纤维可用于较小的制剂,如注入小鼠心脏27。该光纤系统在心脏色球吸收(450–630 nm)的波长范围内通过心脏壁提供足够的照明。使用心脏外侧的拾取光纤,可以用出色的时间和光谱分辨率监测肌红蛋白和线粒体细胞色素的吸收率(见图5)。 与 VWTOS 的 LED 导管方法不同,侧燃光纤方法具有多种优势,包括导管的横截面轮廓更小,可最大限度地减少导管对心脏的影响,更灵活地减少对心脏瓣膜的影响,心室性能,没有可在盐水渗透中短路的电气连接,最后是使用外部光源的导管,增加了 VWTOS 光源选择的灵活性。
由于心脏的吸光性强于490nm以下,因此很难在410-445nm区域或340nm处产生关于细胞色素的索雷带的信息。因此,在 450 nm 处,FAD 的宽吸收率是观察到的最低频率吸收率,尽管未对该色光的整个吸收峰值进行采样。使用VWTOS,信号噪声比非常高,因为整个壁的采样与表面反射光谱,通常使用的20,只有采样心脏表面与大量的散射问题。VWTOS采样整个心脏壁更类似于核磁共振光谱(NMRS)测量的许多心脏代谢物,如31P检测到三磷酸腺苷和肌酸磷酸28,13C检测标记代谢物29,30包括超极化标签31,32和1H检测代谢物33。由于 VWTOS 可以使用非磁性器件进行,因此可以同时进行 NMR 和 VWTOS 是完全可行的。VWTOS不限于内源色谱,可用于监测光学探针对pH、Ca2+和等离子膜电位的吸收。
我们使用 2 Hz(即 2 个采样/秒),为噪声提供出色的单频谱信号。虽然可以达到更高的采样率,允许心脏周期分析,以前的研究已经表明,没有节拍击败染色体吸收的变化,所以没有努力有选择地收集光作为心脏周期的功能做了34。由于 VWTOS 几何形状,光的检测对组织运动的依赖程度低于反射方法,因为消除了复杂的表面散射事件。我们发现,剧烈运动会破坏这些措施,但实时光谱分析快速揭示出与组织色度过渡不一致的光谱过渡。同样,只有当心脏严重远离收集纤维时,才会发生这种情况,从而大大减少收集的透射光量。
VWTOS 数据使用基于心脏色谱光谱和光源光谱的参考库(如前面描述的20、22、27 ) 进行全光谱拟合例程分析。 35与简单的线性最小二乘方法。这种光谱拟合程序弥补了重叠的吸光度谱,不依赖于"等位"波长。这种全谱分析消除了与常见的双光束(即两个波长)分析1,3,6相关的伪影,这已被证明是有问题的20。全光谱分析的附加优势是从残差中生成拟合优,在双光束协议中是不可用的。
在这项研究中,我们重点研究了氰化物对心脏光学特性的影响。当氰化物阻止细胞色素氧化酶时,它抑制耗氧量,并从根本上导致所有细胞色素的净减少,因为电子在细胞色素链中备份。然而,膜电位显然仍然很高,因为与细胞色素c13相比,bL和bH中的氧化还原变化非常小。随着氧气消耗的停止,组织中的氧张力应接近渗透液,我们注意到含氧肌红蛋白与氰化物的早期增加,这与盐水灌注心脏,即使在逆行灌注中,也符合这一概念。模式,没有完全氧化肌红蛋白在细胞醇19,20,21,36。将氰化物对含氧肌红蛋白的最大影响与缺血所得的完全脱氧光谱进行比较后发现,肌红蛋白的氧合率仅为88%左右,与以前的研究一致。
在这项研究中,必须注意氰化物对肌红蛋白氧合和细胞色素减少的影响是暂时性的。令人惊讶的是,在观察到心脏细胞色素氧化还原状态发生巨大变化之前,首先观察到氰化物对冠状动脉和肌红蛋白的影响。早期明显增加的流量表明,在观察到心脏细胞的代谢效应之前,可能对动脉平滑肌24、37产生影响。流量的增加,可能与适度的氰化物诱导呼吸减少,可能导致氧气输送增加引起的立即增加的含氧肌红蛋白。随着氰化物抑制扩散到肌细胞,冠状动脉流动进一步增加(参见图5a中标出的区域3),可能受众多代谢因子38的驱动。氰化物对流动的早期影响很大,表明血管平滑肌的代谢可能比肌细胞的代谢更有力地改变血管张力。这些数据支持了一种公认的观念,即肌红蛋白对氧的亲和力比COX低得多,即使在完整的心脏中也是如此,因为肌红蛋白氧合早在线粒体氧化原状态改变之前就发生了(图5)。这种在控制条件下的高脱氧肌红蛋白水平与先前的研究表明,即使在控制条件下,孤立的盐水渗透心脏也可能部分缺氧。 20,21,27,36,强调了监测心脏组织氧合的重要性,当使用这个重要的模型在心脏生理学。
我们在这里介绍在隔离的渗透心脏上进行透射吸收光谱的实验细节。我们已经成功地将这项技术用于从兔子到小鼠的心脏,通过使用一个薄的侧射心脏内光纤。利用最先进的全光谱配合程序,可以轻松提取心脏色谱的复杂光学相互作用,与传统心肌代谢的关键元素同时进行近实时测量功能措施。

光学吸光光谱用于监测完整的器官生物化学是一种广泛使用的方法,由于其内在的、非破坏性的性质1,2,3,4,5 6,7,8,9.肌红蛋白吸收率提供平均细胞氧张力10,11,12的测量。线粒体细胞色素提供有关基质进入水平的信息,细胞色素bL:bH13的膜电位,以及细胞色素氧化酶(COX)向细胞内线粒体输送的氧气) 氧化还原状态14。Glancy等人证明,通过测量线粒体膜电位和代谢率15可以确定每个复合物的活动。因此,使用光学光谱学,无需外源探测或对当前研究系统进行重大修改,即可获得大量信息。本文的目标是提出一种在传统的渗透心脏制剂中收集透射光光谱的可靠方法,唯一的重大修改是在黑暗的环境中进行研究。
反射吸收光谱已成功用于执行透水心脏3、6、16、17、18、19的光学光谱。作为心脏在体内1。反射光谱包括冲击心脏表面的光,收集散落在心脏的光以及漫反射和镜面反射光。因此,该方法中收集的光是多种散射机制以及感兴趣的组织色度吸收的复合体。由于心脏的运动和复杂的表面,心脏表面的光反射特别成问题,改变了穿透深度和纯反射光的量。
通过将光学导管引入左心室腔,允许在左心室自由壁20上收集透射光,解决了上述反射吸收光谱的局限性。在 Tamura 等人的早期侵入性研究中,对此类研究的传输光谱学的好处表示赞赏。关于细胞氧合和线粒体氧化还原状态在各种条件下21。这些初步研究使用特制的导管,尖端带有带电源的LED,通过心肌产生白光的侧射模式。然而,相对较大的LED倾动导管只适用于中型心脏(兔子,豚鼠等),需要定制制造。在目前的研究中,提出了一种使用市售的200微米芯侧燃光纤作为光导的方法。具有 500 微尖端的导管将光线从外部源重定向,而不是尖端的有线 LED,从而提高了系统的多功能性。这种方法允许使用各种外部光源,包括激光器,用于拉曼散射光谱等应用。为了量化这些数据,使用已知参考光谱进行在线全多组分光谱分析,以提高心脏色镜光谱测定的准确性,如前述20、22所述。此分析的源代码将由作者应要求提供。使用这种方法,心脏生物化学和线粒体功能的信息可以同时获得与传统的心脏功能参数,很少或没有影响心脏准备。由于心脏严重依赖线粒体功能和氧气输送,这种技术补充的经典注入心脏系统将大大提高这一重要心脏性能模型的解释和效用。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:643px;" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">BIOPAC data acquisition system</td>
			<td style="width:108px;">BIOPAC</td>
			<td style="width:119px;">MP150</td>
			<td style="width:167px;">Analog to digitial conversion</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">BIOPAC general purpose transducer amplifiers</td>
			<td style="width:108px;">BIOPAC</td>
			<td style="width:119px;">DA100C</td>
			<td>Pressure monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BIOPAC System skin temperature amplifier</td>
			<td style="width:108px;">BIOPAC</td>
			<td style="width:119px;">SKT100B</td>
			<td>temperature monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers</td>
			<td style="width:108px;">Mightex</td>
			<td style="width:119px;">SLC-MA02-U</td>
			<td>External light source power supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Disposable pressure sensors</td>
			<td style="width:108px;">BIOPAC</td>
			<td style="width:119px;">RX104A</td>
			<td>Pressure monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:249px;">Dual Syringe, Infusion Pump</td>
			<td style="width:108px;">KdScientific</td>
			<td style="width:119px;">KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP</td>
			<td>drug injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Flow-through probes</td>
			<td style="width:108px;">Transonic</td>
			<td style="width:119px;">4PXN</td>
			<td>perusate flow monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Glass Syringe</td>
			<td style="width:108px;">FORTUNA Optima</td>
			<td style="width:119px;">30 CC</td>
			<td>Air tight fluid injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">High power fiber-coupled LED white light source</td>
			<td style="width:108px;">Mightex</td>
			<td style="width:119px;">Type-A FCS-0000</td>
			<td>External light source</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:249px;">Perfused heart system</td>
			<td style="width:108px;">Radnoti</td>
			<td style="width:119px;">120101BEZ</td>
			<td style="width:167px;">This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Phase fluorimeter</td>
			<td style="width:108px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:119px;">NeoFox-GT</td>
			<td>oxygen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Pickup fiber optic</td>
			<td style="width:108px;">Thor labs</td>
			<td style="width:119px;">BF20HSMA01</td>
			<td>Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PowerLab unit</td>
			<td style="width:108px;">AD Instruments</td>
			<td style="width:119px;">PowerLab 8/35</td>
			<td>Analog to digitial conversion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Pressure transducers</td>
			<td style="width:108px;">BIOPAC</td>
			<td style="width:119px;">TSD104A</td>
			<td>pressure monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Programming environment</td>
			<td style="width:108px;">LABViEW</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Rapid scanning spectrophotometer</td>
			<td style="width:108px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:119px;">QE65PRO</td>
			<td>Rapid scanning spectrometer for spectral analysis</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:249px;">Side firing fiber optic</td>
			<td style="width:108px;">Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200</td>
			<td style="width:119px;">JTFLH200230500/1.5M&#160;</td>
			<td>side firing fiber optic 200 microns core&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Sodium cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">380970</td>
			<td>Metabolic inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:108px;">BIOPAC</td>
			<td style="width:119px;">TSD102A</td>
			<td>temperature monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tubing flow modules</td>
			<td style="width:108px;">Transonic</td>
			<td style="width:119px;">TS410</td>
			<td>perusate flow monitoring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-cardiac side-firing light catheter for monitoring cellular metabolism using transmural absorbance spectroscopy of perfused mammalian hearts

心肌吸收镜光谱分别通过肌红蛋白和细胞色素吸收提供细胞体和线粒体氧合的无损评估。此外,还可以估计线粒体代谢状态的许多方面,如膜电位和基板进入。为了执行心壁传输光学光谱,一个市售的侧射光纤导管被放置在隔离的渗透心脏的左心室作为光源。穿过心壁的光用外部光纤收集,以近乎实时地对心脏进行光学光谱。传输方法避免了在广泛使用的反射方法中出现的大量表面散射干扰。使用色度参考光谱库对透膜吸收光谱的变化进行解测,同时提供所有已知心脏色镜的定量测量。这种光谱去卷积方法消除了使用适用于重叠吸收光谱的通用双波长方法可能导致的内在误差,并提供了拟合优度定量评估。设计了一个用于数据采集和分析的定制程序,使研究者能够监测实验期间制剂的代谢状态。除了传统的收缩、灌注和基质/氧气提取措施外,标准心脏灌注系统的这些相对简单的添加提供了对心脏壁代谢状态的独特见解。

使用的系统是一个现成的小动物灌注心脏系统,但经过大量修改,用于与兔子心脏。修改主要是为了增加所有油管的孔径,以确保足够的流量传递到兔子心脏。在使用灌注压力时,为了保证原生灌注系统的流速超过心脏附着至少5倍的流量。2⁄12 μm 孔膜过滤器在流体泵和主动脉预加载气泡陷阱室之间平行放置,以清除心脏上的任何碎屑。
从兔子心脏传输的光 图1显示了导管的光谱(图1A)和兔子心脏自由壁透射光的原始光谱(图1B)。这些数据揭示了光谱蓝色区域中光的非常大的衰减,但是从肌红蛋白和线粒体细胞铬的吸收带可以直接在插入件的490至580nm之间观察到。在这些研究中,确保在 490 到 630 nm 区域检测到足够的透射光,以获得有关代谢反应性心脏色谱的信息非常重要。在保存数据之前调整外部和内部光纤的定位,以最大化光强,但不会使探测器在 625 nm 区域饱和。
参考 减少减去心脏中参考色光素的氧化光谱。 图2显示了用于拟合这些研究中收集的差分光谱的参考光谱。这些参考包括肌红蛋白, 细胞色素 aa3 (或细胞色素a 605和细胞色素 a607,取决于扰动类型22),细胞色素a 580,细胞色素 bL,细胞色素 bH,细胞色素 c, 细胞色素 c1, FAD, 入射光的吸收表示(表示 I0,用于解释筛光,即光子通过组织而不被吸收),和一条线 (变化斜率和截距,以考虑散射,如图2所示。有些光谱是嘈杂的,因为纯参考材料的浓度非常低22。
总实验期间参考光谱拟合的时间过程 图 3表示在协议步骤 5.15 中计算的典型实验的时间过程。这包括控制阶段,然后是氰化物注射阶段,然后是氰化物冲洗,然后是脱氧阶段,最后是缺血。随着时间的推移,单个色球(肌红蛋白、细胞色素aa3和细胞色素c)的变化与冠状动脉流动率一起绘制。每个色度的光密度变化是通过乘以线性最小二乘常规和色度代表峰(或上述色度的最大吸收率)获得的拟合系数来估计的。例如,对于肌红蛋白,肌红蛋白参考的拟合系数乘以 580 nm 处肌红蛋白参考光谱的值。请注意,肌红蛋白与氰化物的快速氧合与流量的增加相匹配,但在细胞色素显著减少之前。这种效果通过氰化物的洗涤部分恢复。最后,在缺血中获得细胞色素的完全减少和肌红蛋白的脱氧。这些数据表明,使用这种方法可以很容易地获得有关心脏代谢状态的动态数据。用于差异光谱的光谱位置在此时被标记为:C 基线、CN 氰化物注射、CNW 氰化物冲洗、H N2缺氧(氮在渗透液中冒泡而不是氧气),以及 HI 无流动缺血(无渗透通过心脏)。
氰化物治疗的差异谱与兔心氰化物差谱的控制与拟合。 为了获得差分谱,减去两个绝对光谱。每个绝对光谱都是通过采用许多(通常为100个)光谱的平均值来优化信噪比获得的。图 4A表示控制 (C) 和氰化物 (CN) 治疗的心脏的差分谱。使用图2中概述的参考光谱计算拟合光谱。剩余光谱是从原始数据中减去拟合。相同的方案用于所有后续的光谱演示。图 4B显示了用于拟合图4A的参考光谱的光谱振幅(如图2所示)。随着细胞色素链上的电子流动被氰化物以稳定状态阻挡,大多数细胞色素的吸收率明显增加。此外,随着氰化物消除氧气消耗,含氧肌红蛋白的吸收率增加。图 4C给出了CNW和CN差谱的差分光谱和拟合,揭示了氰化物效应的部分反转。这是通过在协议步骤 5.18 中选择时间点,将 T0 移动到 CNW 和将 T1 移动到时间过程的 CN 区域来实现的。图 4D呈现 HI 和 C 的差异谱,表示细胞醇和线粒体与控制条件完全脱氧和降低的状态。同样,这在协议步骤 5.18 中执行,将 T0 移动到 C,将 T1 移动到 HI。
氰化物对冠状动脉流动和色球效应的初始时间过程 图 5A显示了氰化物效应对组织启动的示例。肌红蛋白、细胞色素605和细胞色素c以及冠状动脉流动的拟合,为单个心脏提供。这些时间课程是在协议步骤 5.15 中为氰化物实验创建的。与基线(位置1)的个体差异如图5B所示。 光谱由时间路线上的相应位置编号(1-4)生成。这是在协议步骤 5.18 中实现的,其中 T0 始终位于位置 1,随后通过将 T1 移动到位置 2、3 和 4 创建不同的光谱 (2⁄4)。有些令人惊讶的是,在细胞色素氧化还原状态发生重大变化之前,流量和肌红蛋白氧合增加。流量变化和色度吸收率的变化是通过从基线的初始变化速率的线性外推来估计的。使用这种方法,并将冠状动脉流量的变化设置为时间为零,肌红蛋白氧合的增加在流量变化后开始1.71分钟~ 0.39分钟,而细胞色素a605和细胞色素c吸收率几乎相同,但在4.24分钟时慢得多*分别为 0.76 分钟和 4.34 分钟 = 0.77 分钟(n = 8)。这些数据表明,氰化物在心肌代谢状态发生重大变化之前,会放松血管张力24。这种效应可能是由于氰化物在达到心脏肌细胞周围的有效剂量之前遇到血管平滑肌造成的。
控制心脏肌红蛋白氧合的估计 使用氰化物数据作为完全脱氧肌红蛋白的肌红蛋白总肌红蛋白总氧合和缺血数据的估计值,我们估计在控制条件下肌红蛋白只有88.2% ± 1.0%(n = 10)含氧,与先前研究20一致,21,25.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58992/58992fig1.jpg"> 图 1:侧射光学导管的光谱。(A)这是通过导管从远程光源发射的光的光谱,该光谱与拾取光纤一起检测到,距离导管约 1 厘米。在此几何图形中,心脏不存在,光源的强度被调谐,以便探测器不会饱和。(B)侧射导管插入左心室,收集并显示来自心脏的透射光。插入显示 400 到 580 nm 区域扩展,揭示了该区域光的复杂传输。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58992/58992fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58992/58992fig2.jpg"> 图 2:用于光谱拟合的心脏色谱的参考光谱。光谱通过多种方法收集 22,并减少 - 氧化(对于细胞色素)和脱氧 + 氧(用于肌红蛋白)。对于I0,图1A中的频谱简单地转换为吸收性术语,以进行参考。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58992/58992fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58992/58992fig3.jpg"> 图 3:流量和光学随时间的变化。每个色度的光密度变化 (μOD) 只是适合单个色度光谱的最大吸收度。最大吸收频率如前所述为20,26。提出的时间过程是一个实验,显示基线,其次是氰化物注射(最大渗透流量为0.10 mM),氰化物冲洗,氮缺氧通过用氮取代氧气进行,然后完成缺血。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58992/58992fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58992/58992fig4.jpg"> 图 4:适合各种条件下的差分光谱。(A)氰化物注射的光谱减去基线。还绘制了从最小平方例程获得的拟合频谱。剩余光谱是原始光谱和拟合光谱之间的差值。(B)用于创建图 4A所示拟合的参考光谱。程序将图 2 中的引用缩放为它们在当前差分谱中的相对贡献。(C)与A相同,但显示冲洗液与氰化物注射的不同光谱。(D)与A相同,但显示缺血与基线的差分谱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58992/58992fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58992/58992fig5.jpg"> 图 5:氰化物输液对选定细胞色素、肌红蛋白和心脏流量的高时间分辨率。(A)心脏流动的时间过程,脱氧血红蛋白,减少细胞色素605,减少细胞色素c.数字是指光谱相对于图5B中的基线的位置。(B) 图 5A中标记的 4 个位置与控制(位置 1)的差分光谱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58992/58992fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

在这里,我们介绍一种方法,在注入的心脏中使用心内光学导管,以执行跨越心壁的吸光光谱。获得的数据提供了关于组织氧张力以及基质利用和膜电位的可靠信息,同时提供这种无所不在的制备中心脏性能测量。

心脏内侧燃光导管,用于监测细胞代谢,使用渗透哺乳动物心脏的透射吸收光谱

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

这一新协议允许研究者监测多种代谢参数，包括细胞和线粒体氧合以及细胞多酸氧化还原状态。同时测量心肌功能的传统测量。该技术的主要优点是简单的无损动态监测线粒体代谢的重要元素在融合的心脏，避免与反射光谱相关的伪影。这些新技术的新技术可能难以插入导管而不损坏阀门和避免房间光线污染。必须插入和调整导管。收集纤维也必须正确定位，以最大化通过左心室自由壁传输的光，这很困难。开始切割左心房附属物的一小块，然后通过手套阀将光纤导管插入左心室。然后旋转它，实现照明左心室自由墙。将拾取光纤的另一端连接到快速扫描光谱仪。将拾取光纤直接放在左心室最大照明区域对面，位于离心脏约一厘米的位置。房间光源应为零。必须调整导管的旋转和拾取光纤的定位，以获得足够的光，而不会使探测器饱和。关掉实验区的灯光，获得完全的黑暗。启动包含光谱仪驱动器的自定义程序，以执行数据采集和传输光的实时分析。浏览所有提示选择选项，用于高融合心脏光谱采集模式。下一页指示是否正在进行辅助数据收集。最后输入采集参数，包括色度参考光谱和要保存的数据的位置。现在输入 490 到 630 纳米的带宽。输入两赫兹的采样率。收集暗电流或零光谱，通过关闭光源来校正背景信号电平。单击以选择要在拟合例例中使用的色度参考。在获取数据页中，调整导管和拾取光纤的位置，以最大化软件上显示的传输光，并特别注意应观察氧化肌红蛋白吸收光的 500 纳米区域的信号振幅。确保传输的光未使探测器在 600 纳米区域饱和。通过关闭导管照明并确认现在未检测到任何光线，确保没有外部光源对收集的频谱造成影响。单击"保存 Spectra"按钮启动数据收集。单击"设置为控制"以查看未来光谱相对于当前控制光谱的差异吸收度光谱。此时，根据需要执行任何生理扰动。例如，要确定氰胺对心脏性能和色度吸收的影响，请停止对香水的再循环，以避免氰化物的回收。使用注射器泵将氰化物以不同的速率注射到大音管前的香水中，以达到流入心脏的香水中所需的氰化物浓度。同时监测心脏功能和光学特性。当冠状动脉流动和心率的影响以及通过心壁的光传输处于稳定状态时，停止氰化物注射器泵。停止氰化物输液五分钟后，将冒泡气体从 100% 氧气切换到 100% 氮气，以从系统中去除氧气。大约 10 分钟后停止流动以模拟完全缺血和缺氧情况。对于光谱数据分析，在注入心脏分析模式下运行程序。选择适当的分析程序。输入数据文件路径和参考光谱文件。选择加载预保存的导管光源的导管光源。选择读取箱数据。然后，选择设置最小值和最长。输入数据分析的带宽为 490 到 630 纳米。选择"返回主菜单"，然后选择"读取参考"。确认要在分析中使用的参考光谱。选择"返回主菜单"，然后在主菜单中选择时间点。现在选择一个时间零时间点作为控件，并设置范围为 100 点。还要选择一个时间点作为实验周期，范围在100点。在"平均吸收度频谱"选项卡中观察原始差分频谱。选择"计算拟合系数"，然后单击"拟合系数"选项卡以观察追溯拟合的时间过程。返回主菜单并选择"计算差异吸收"。选择时间零和时间零和时间零之间的差值。观察不同光谱窗口中的拟合光谱和参考重量窗口中的拟合元件。重复此过程以比较实验中的其他时间点。返回到主菜单。通过键入所需名称并选择"保存数据"以与其他程序进行进一步分析，在电子表格报表中保存数据和分析。这里展示的是导管的光谱和兔子无心壁中透光的原始光谱。这些数据揭示了光谱蓝色区域的光衰减很大。然而，从肌红蛋白和线粒体细胞色素的吸收带可以直接观察到490至580纳米之间的插入。此处显示了对照组和氰化物处理心脏的差异谱。拟合光谱是根据参考光谱计算的。残差谱是原始数据中的拟合的减法。此处显示参考光谱的光谱振幅。当细胞色素链下电子的流动被氰化物以稳定状态阻挡时，观察到大多数细胞色素的吸收度会显著增加。此外，随着氰化物的氧气消耗，含氧肌红蛋白的吸收度增加。氰化物洗涤与氰化物注射的差异光谱揭示了氰化物效应的部分反转。此处显示的是无流缺血状态与控制的差异谱。此光谱表示细胞太阳线粒体的完全脱氧和降低状态，控制条件。我们目前正在研究一氧化氮对心脏代谢的影响。除了上述的色度，我们还可以跟踪其他光学可检测的物种，包括一氧化氮产生的三金红蛋白。此外，导管可以连接到激光，使用拉曼光谱研究脂质代谢。钙心脏代谢也可以通过吸收摄入外源或遗传的钙探针来研究。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

低成本的低温光学显微镜舞台制作相关的光/电子显微镜

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

科研

生物工程

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

多参数的Langendorff灌注兔心脏的光学测绘

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

非接触，无标签使用拉曼光谱研究细胞和细胞外基质的监测

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

质量流式细胞术：协议，每日调整和执行细胞的样品上一个CyTOF的质量流式细胞仪

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

培养哺乳动物细胞使用一次性使用气动生物反应器系统

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

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Bioprinted蜂窝构造的可行性使用三分配器笛卡尔打印机

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

自动化脂双层膜的形成使用聚二甲基硅氧烷薄膜

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

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