Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

المؤلف يود أن يشكر جامعة جنوب الدنمارك الوصول المفتوح سياسة المنح.

1. ناقلات التحديد
<ol><li>اختر متجه لإجراء تجارب المتلقين للمعلومات. أي ناقل قابل للتطبيق لهذا الأسلوب PCR الخطوة 2 و 3.</li>
	<li>على أساس الاختيار لناقلات الأمراض، اختر إنزيمات التقييد الملائمة للاستنساخ.</li>
</ol>2-التمهيدي تصميم للموقع توجه الطفرات
<ol><li>تقرر بين أما الخطوة 2 أو 3-الخطوة...

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli.">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter.">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li><li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli:+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA.">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li><li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli.">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

موقع الموجه الطفرات مجموعة واسعة من التطبيقات المختلفة، وهنا، أدرجت نتائج الممثل من المجراة في وتجربة في المختبر كأمثلة على كيفية جعل استنتاجات البيولوجية باستخدام هذه التقنية. وقد الطفرات الموجهة من موقع لفترة طويلة المعيار الذهبي لدراسات تفاعل الحمض النووي الريبي. وتكمن قوة هذه التقن...

الحمض النووي كثيرا ما يشار إلى خطة لخلية حية حيث يتم ترميز جميع الهياكل الخلية في تسلسل الحمض النووي لها. النسخ المتماثل دقيقة وآليات إصلاح الحمض النووي ضمان حدوث معدلات منخفضة جداً فقط من الطفرات، هو أمر ضروري للحفاظ على الوظائف الصحيحة للجينات مشفرة. تغيير تسلسل الحمض النووي يمكن أن يؤثر على الوظائف المتعاقبة على مستويات مختلفة بدءاً من الحمض النووي (الاعتراف بعوامل النسخ والتقييد الإنزيمات)، ثم الجيش الملكي النيبالي (تكامل قاعدة بين زوج وتعديلات الهيكل الثانوي) و/أو البروتين (الأمينية استبدال حمض والحذف والإضافات أو الإطار-التحولات). في حين أن العديد من الطفرات لا تؤثر على وظيفة المورثات إلى حد كبير، يمكن أن يكون بعض طفرات في الحمض النووي آثار ضخمة. وهكذا، الطفرات الموجهة من الموقع أداة قيمة لدراسة أهمية مواقع محددة من الحمض النووي على جميع المستويات.
ويصف هذا البروتوكول نهجاً الطفرات مستهدفة تستخدم لإدخال طفرات محددة. يعتمد البروتوكول على استراتيجيتين PCR مختلفة: 2-خطوة أو بكر 3-الخطوة. بكر 2-الخطوة قابلاً للتطبيق إذا كانت الطفرة المنشودة بالقرب من النهاية 5 'أو نهاية 3' الحمض النووي للفائدة (< 200 زوج قاعدي (bp) من النهاية) وبكر 3-الخطوة قابلاً للتطبيق في جميع الحالات.
في نهج بكر الخطوة 2، كبسولة تفجير 3 مصممة الذي صمم مجموعة واحدة من الإشعال تضخيم الحمض النووي للفائدة (كبسولة تفجير 1 و 3، إلى الأمام وعكس، على التوالي) وكتاب واحد يهدف إلى إدماج الطفرة. الطفرة إدخال التمهيدي (التمهيدي 2) ينبغي أن يكون اتجاه عكس إذا كانت الطفرة القريبة من النهاية 5 'وتوجه إلى الأمام إذا كانت الطفرة بالقرب من النهاية 3'. في الخطوة الأولى في بكر، يسهب التمهيدي 1 + 2 أو 2 + 3 جزء صغيرة قريبة من 5 'نهاية أو 3' نهاية، على التوالي. ثم يتم استخدام ناتج PCR تمهيدي في الخطوة الثانية مع التمهيدي 1 أو 3، مما أدى إلى منتج PCR مع طفرة في الحمض النووي للفائدة (الشكل 1A).
في PCR الخطوة 3، يتم تصميم كبسولة تفجير 4، الذي صمم مجموعة واحدة من الإشعال تضخيم الحمض النووي للفائدة (كبسولة تفجير 1 و 4، إلى الأمام وعكس، على التوالي) ومجموعة واحدة من الإشعال يهدف إلى إدماج طفرات محددة مع تداخل التكامل (2 و 3، عكس والي الأمام، على التوالي). في خطوة واحدة، واثنتان، وتضخيم الإشعال 1 + 2 و 3 + 4 في نهاية 5 'و 3'. في الخطوة الثالثة، منتجات PCR الناتجة من خطوة واحدة واثنين يتم استخدامها كقوالب وتضخيم مع الإشعال 1 + 4. وهكذا، من بكر وناتج الحمض النووي للفائدة مع الطفرة المرجوة (الشكل 1B).
بينما يمكن استخدام الحمض النووي تحور لأي تطبيق المصب، يصف هذا البروتوكول كيفية إعادة دمج الحامض النووي في ناقل استنساخ. استخدام استنساخ متجهات مزايا عديدة مثل سهولة الاستنساخ وتطبيقات تجريبية محددة تبعاً لميزات ناقل. غالباً ما يتم استخدام هذه الميزة لدراسات التفاعل الجيش الملكي النيبالي. أسلوب آخر للحمض النووي الريبي دراسات التفاعل سبر الهيكلية للجيش الملكي النيبالي في المجمع مع آخر الجيش الملكي النيبالي1،2 أو البروتين3،4. ومع ذلك، الهيكلي هو فقط إجراء التدقيق في المختبر حين الطفرات موقع الموجه والاستنساخ اللاحقة تسمح بالتفاعل الدراسات المجراة.
الطفرات موقع الموجه قد استخدمت على نطاق واسع للجيش الملكي النيبالي التفاعل الدراسات كما عرضها هنا. بيد أن الأسلوب الرئيسية بشأن 2 أو 3-خطوة PCR تنطبق على أي قطعة من الحمض النووي وهكذا لا يقتصر على دراسات الحمض النووي الريبي-التفاعل.
لتجسيد هذه التقنية واستخداماتها المحتملة، يتم استخدام الوصف لمناطق هامة لتنظيم بوستترانسكريبشونال مرناً، كسجد، من الإشريكيّة القولونية (كولاي). كولاي، كسجد هو استهداف قبل الصغيرة غير الترميز الجيش الملكي النيبالي، McaS، بالتعاون مع بروتين، هفق، لقمع التعبير البروتين كسجد2،،من45. التقنية تستخدم لإدخال طفرات إلى منطقة قاعدة المزاوجة بين كسجد و McaS، وموقع الربط هفق كسجد. ثم هو استنساخ الحمض النووي التي تم الحصول عليها إلى ناقل مناسب للتجارب اللاحقة. وتشمل التطبيقات المصب تقنية التجارب المجراة في سواء في المختبر. للتوضيح، مثال 1 تتميز المجراة باستخدام تحليل لطخة غربية وتتميز المثال 2 في المختبر باستخدام مقايسة تحول تنقل الغرواني الكهربي (أمسا). وفي كلتا الحالتين الطفرات يتضح كيفية توجيه الموقع يمكن استخدامها بالاقتران مع غيرها من تقنيات جعل استنتاجات البيولوجية حول جينات للفائدة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

موقع الموجه الطفرات تقنية تستخدم لإدخال طفرات محددة في الحمض النووي للتحقيق في التفاعل بين جزيئات الحمض النووي الريبي (سرنا) صغيرة غير الترميز والهدف رسول الكشف (مرناس). وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم الطفرات موقع الموجه لتعيين مواقع ربط بروتين محددة للجيش الملكي النيبالي. ويرد وصف عرضاً بكر على أساس الخطوة 2 والخطوة 3 للطفرات. والنهج ذات الصلة لجميع البروتين-الجيش الملكي النيبالي ودراسات الحمض النووي الريبي الريبي التفاعل. وباختصار، هذه التقنية تعتمد على تصميم كبسولة تفجير mutation(s) المنشودة، ومن خلال الخطوات 2 أو 3 من PCR توليف منتج PCR مع الطفرة. ثم يتم استخدام المنتج PCR للاستنساخ. وهنا، نحن تصف كيفية تنفيذ الطفرات الموجهة الموقع مع كل نهج الخطوة 2 و 3 استحداث الطفرات سرنا و McaS ومرناً، كسجد، للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي-الجيش الملكي النيبالي وتفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي. نقوم بتطبيق هذا الأسلوب للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي التفاعلات؛ هذا الأسلوب غير المنطبقة على جميع الدراسات الطفرات (مثل التفاعلات الحمض النووي عالي البروتين، والأحماض الأمينية بالإضافة/الحذف/استبدال). من الممكن إدخال أي نوع من الطفرة باستثناء القواعد غير طبيعية ولكن هذا الأسلوب لا ينطبق إلا إذا كان يمكن استخدام منتج PCR المصب بالتطبيق (مثل الاستنساخ وقالب لمزيد من PCR).

للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي التفاعلات بشأن تنظيم بوستترانسكريبشونال كسجد، تم اختيار إعداد ناقلات مزدوجة: واحدة للتعبير عن كسجد مرناً وآخر للتعبير عن الصغيرة غير الترميز الجيش الملكي النيبالي، McaS. تم استنساخ كسجد في pBAD33، وبلازميد أرابينوز إيندوسيبل?...

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

الطفرات موقع الموجه لفي المختبر وفي فيفو التجارب المتمثلة بالتفاعلات الحمض النووي الريبي في الإشريكيّة القولونية

موقع الموجه الطفرات أسلوب يستخدم لإدخال طفرات محددة في الحمض الخلوي الصبغي (DNA). هذا البروتوكول توضح كيفية القيام الطفرات الموجهة الموقع مع خطوة 2 والخطوة 3 تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على أساس النهج التي تنطبق على أي جزء من الحمض النووي للفائدة.

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

إن الطفرات الموجهة للموقع مفيدة لدراسة التفاعلات الجزيئية، مثل الحمض النووي الريبي الريبي، وتفاعلات البروتينات الرنا. يصف هذا البروتوكول كيفية تنفيذ الطفرات الموجهة من الموقع مع نهج PCR من خطوتين أو 3 خطوات. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه الطريقة في تنوع الطفرات المختلفة التي يمكن إدراجها، فضلا عن السهولة النسبية والتكلفة للقيام بذلك.للبدء، استخدم قالب الحمض النووي البرية من النوع والأزواج التمهيدية اثنين، واحد، واثنين، ثلاثة، محددة ل2-الخطوة، أو أزواج التمهيدي ثلاثة، واحد، وثلاثة، أربعة، محددة ل PCR 3-خطوة للحصول على منتج PCR واحد. للتحقق من صحة منتجات PCR بواسطة agarose هلام electrophoresis، وجعل هلام agarose 2٪عن طريق حل غرامين من agarose في 100 ملليلتر من 1X TAE العازلة، وذلك باستخدام فرن الميكروويف. يضاف بروميد الإثيديوم بتركيز نهائي 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر.ثم يلقي هلام agarose. عندما تُرسّن، ضعه في وحدة الكهرباء. تحميل سلم الحمض النووي من الحجم المعروف، وعينات PCR مختلطة مع صبغة تحميل الحمض النووي في الآبار.تشغيل العينات في 75 فولت لمدة 45 دقيقة. وتصور العصابات على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية أو مع نظام التصوير هلام. بعد ذلك، قم بتنقية منتج PCR مع عدة استخراج هلام وفقا لبروتوكول المصنعين وقياس تركيز الحمض النووي المنقى مع مقياس الطيفي.ثم تخزين الحمض النووي المنقى في ناقص 20 درجة مئوية في عازلة TE. لبدء الطفرات الموجهة من الموقع مع PCR من خطوتين ، استخدم أولاً قالب الحمض النووي البري ، ثم أزواج التمهيدي اثنين ، واحد واثنين ، اثنين ، لخمس طفرات التمهيدي ، أو أزواج التمهيدي اثنين ، اثنين ، واثنين ، وثلاثة لثلاث طفرات أولية للحصول على منتج PCR الثاني. التحقق من صحة المنتج PCR بواسطة جل electrophoresis، تنقية المنتج PCR، وقياس تركيزها كما هو موضح من قبل.ثم استخدم قالب الحمض النووي من النوع البري والمنتج PCR اثنين كـ التمهيدي ، جنبا إلى جنب مع التمهيدي الثاني ، ثلاثة لخمسة طفرة أولية ، أو التمهيدي الثاني ، واحد لثلاثة طفرة أولية ، للحصول على منتج PCR الثالث. التحقق من صحة المنتج PCR بواسطة جل electrophoresis، تنقية المنتج PCR، وقياس تركيزها كما هو موضح من قبل. ثم تخزين الحمض النووي المنقى في ناقص 20 درجة مئوية في عازلة TE.لبدء الطفرات الموقع المباشر مع PCR 3 خطوة، أولاً استخدام قالب الحمض النووي البرية من النوع والأزواج التمهيدي ثلاثة، واحد، وثلاثة، اثنين للحصول على منتج PCR اثنين. استخدام قالب الحمض النووي من النوع البرية والأزواج التمهيدي ثلاثة وثلاثة وثلاثة، أربعة، للحصول على المنتج PCR ثلاثة. استخدام قالب الحمض النووي من النوع البرية والأزواج التمهيدي ثلاثة وثلاثة وثلاثة وأربعة، للحصول على المنتج PCR ثلاثة.التحقق من صحة المنتج PCR بواسطة جل electrophoresis، تنقية المنتج PCR، وقياس تركيزها كما هو موضح من قبل. وأخيرا استخدام اثنين إلى خمسة نانوغرام من منتجات PCR اثنين وثلاثة كقالب جنبا إلى جنب مع أزواج التمهيدي ثلاثة، واحد وثلاثة، أربعة، للحصول على المنتج PCR أربعة. التحقق من صحة المنتج PCR بواسطة جل electrophoresis، تنقية المنتج PCR، وقياس تركيزها كما هو موضح من قبل.تخزين الحمض النووي المنقى في ناقص 20 درجة مئوية في العازلة TE. في هذه الدراسة، تم استخدام 2 خطوة و 3 خطوات من التاجنينية الموجهة للموقع للتحقيق في تفاعلات الحمض النووي الريبي فيما يتعلق بتنظيم ما بعد النسخ من CsgD. تم تضخيم CsgD من النوع البرية لـ PCR لـ IA منتج PCR ، وتم تضخيم MCAS من النوع البرية لتحقيق منتج PCR IB. وباستخدام استراتيجية PCR من 3 خطوات، تم توليف منتجات PCR IIA و IIIA في أول خطوتين، وIVA في الخطوة الثالثة لإدخال الطفرات في CsgD.وبالمثل، تم إدخال طفرات مجانية موجهة من الموقع في MCAS لتحقيق منتجات PCR IIB و IIIB في أول خطوتين و IVB في الخطوة الثالثة. أظهر تحليل البقعة الغربية أنه في حين أن التعبير عن mcaS من النوع البري يمنع ترجمة CsgD من النوع البري ، فإن الطفرات في إما MCAS أو CsgD تخفف من القمع الملحوظ. ومع ذلك، تحول الطفرات في كل من CsgD وMCAS دون ترجمة CsgD.باستخدام استراتيجية PCR 2 خطوة، منتجات PCR IIC، IID، IIE، IIF، و IIG، تم تصنيعها في الخطوة الأولى، ومنتجات PCR IIIC، IIID، IIIE، IIIF، و IIIG، في الخطوة الثانية لإدخال الطفرات إلى الحمض النووي CsgD بأكمله. وأظهرت نتائج EMSA من HFQ ملزمة لفي المختبر منقولة CsgD من النوع البرية وRNAs متحولة، توليفها باستخدام منتجات PCR IIIC، IIID، IIIE، IIIF، وICG، زيادة قيم KD من الأليلات متحولة. وقد أثبت ذلك أن HFQ يمكن أن يربط بشكل أقل كفاءة مع المسوخ.وعلاوة على ذلك HFQ لديها العديد من المواقع ملزمة على CsgD، وهو ما يتضح من التحولات الثلاثة التي لوحظت للرنا من النوع البرية. ومع ذلك، يتم ملاحظة موقعين فقط ملزمة لمختلف RNAs متحولة. وهكذا فإن نهج الطفرات الموجهة من حيث الموقع يحدد الهياكل الأولية أو الثانوية لمرنا CsgD التي تعتبر مهمة للربط الكامل ل HFQ.تعتمد طريقة الطفرات الموجهة من الموقع الموضحة هنا على PCR. الممارسات الجيدة PCR هي هناك حاسمة للأسلوب وقد تتطلب التحسين لتكون ناجحة. الموقع الموجه الطفرات هي قوية فقط مع جميع الأساليب الثلاث مثل EMSA وغرب النشاف.وتشمل الطرق الأخرى، على سبيل المثال، مختلف الأقوال الهيكلية وبعض مقايسات النشاط، ودراسات تعديل الترجمة اللاحقة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em&gt; كولاي</em&gt; الوصيفة HdeB<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

وصف جليكوبروتينس مع حظيرة الغلوبولين المناعي علم البلورات بالأشعة السينية والتقنيات الفيزيائية الحيوية

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

سريع للغاية ومحددة وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي في فيفو مع 4-ثيوراسيل (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

استخراج RNA سريع وفعال من حيث التكلفة من أنسجة البنكرياس الجرذ

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

موقع محدد ليسين أسيتيل الهستونات لإعادة تشكيل النوكليوسوم باستخدام توسيع الشفرة الوراثية في الإشريكية القولونية

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...