Name: immobilization of live caenorhabditis elegans individuals using an ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention
Uploaded: 2019-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention at JoVE.com

Forfatterne takke Dr. Atsushi Higashitani for venlig rådgivning i forbindelse med behandling af C. elegans og Drs. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota og Yasuhiko Kobayashi for værdifulde drøftelser. Forfatterne takke Caenorhabditis genetisk Center for at levere stammer af C. elegans og E. coli. Vi takker besætningen på cyclotron af DIADEM på QST-Takasaki for deres venlige assistance med bestråling eksperimenter. Vi takker Dr. Susan Furness til redigering af et udkast til dette håndskrift. Denne undersøgelse var delvist understøttet af KAKENHI (Grant numre JP15K11921 og JP18K18839) fra JSP'ER til M.S.

1. stammer og vedligeholdelse
<ol><li>Vælg en egnet stamme af C. elegans og Escherichia coli (mad) afhængigt af formålet med forsøget. Bemærk: I det foreliggende papir, wild-type N210C. elegans (fig. 2A) er generelt bruges, og HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V11 er kun ansat til imaging assay. E. coli OP50 blev brugt som mad til C. elegans</...

<ol>
	<li>Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy-Ion+microbeams-development+and+applications+in+biological+studies.">Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies.</a> IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).</li><li>Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+biological+effects+of+ion+beams+on+lethality,+molecular+nature+of+mutation,+mutation+rate,+and+spectrum+of+mutation+phenotype+for+mutation+breeding+in+higher+plants.">Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants.</a> Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).</li><li>Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Br&#228;uer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbeam+evolution:+from+single+cell+irradiation+to+pre-clinical+studies.">Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies.</a> International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).</li><li>Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+irradiation+system+with+heavy-ion+microbeam+for+active+individuals+of+Caenorhabditis+elegans.">Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).</li><li>Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy-ion+microbeam+system+at+JAEA-Takasaki+for+microbeam+biology.">Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology.</a> Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).</li><li>Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+arrest+and+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans+germline+cells+following+heavy-ion+microbeam+irradiation.">Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation.</a> International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).</li><li>Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+irradiation+method+for+the+first+instar+silkworm+larvae+using+locally+targeted+heavy-ion+microbeam.">Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam.</a> Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).</li><li>Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscopal+activation+of+microglia+in+embryonic+fish+brain+following+targeted+irradiation+with+heavy-ion+microbeam.">Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).</li><li>Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration.">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1 (1), 12-14 (2012).</li><li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Biology. 204, 1757-1764 (2001).</li><li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+locomotory+rate+is+modulated+by+the+environment+through+a+dopaminergic+pathway+and+by+experience+through+a+serotonergic+pathway.">C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li><li>Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+calcium+leakage+causes+mitochondrial+damage+in+Caenorhabditis+elegans+body-wall+muscles.">Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles.</a> Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).</li><li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles.">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. 2, 1-13 (2006).</li><li>Aubry, G., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perspective+on+optical+developments+in+microfluidic+platforms+for+Caenorhabditis+elegans+research.">A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research.</a> Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).</li><li>Lumirror Catalog. TORAY Available from: <a target="_blank" href="https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf">https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf</a> (2018)</li><li>Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-moulded+substrates+for+the+analysis+of+structure-dependent+behaviour+of+nematodes.">Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes.</a> Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans.">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).</li><li>Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+dirt:+Microfluidic+substrates+for+nematode+neurobiology+and+behavior.">Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior.</a> Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).</li><li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li><li>Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+microfluidics+device+for+mechanical+stimulation+and+high+resolution+imaging+of+C.+elegans.">Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).</li></ol>

På chip immobilisering af C. elegans live betingelser ved hjælp af en vanddispergerbare PDMS mikrofluid chip giver mulighed for effektiv målrettede microbeam bestråling af flere dyr. Nem håndtering og funktioner til at forhindre udtørring gøre dette system velegnet til applikationer, ikke kun i microbeam bestråling, men også i flere adfærdsmæssige assays. Disse orm plader har allerede blevet kommercialiseret og kan hentes nemt. Konventionelle mikrofluid chips, som olfaktoriske chips, er forbundet med ...

Stråling, herunder x-stråler, gammastråler, og heavy-ion stråle, er meget udbredt for biologiske applikationer som i kræftdiagnose og behandling og for ion-beam avl. Talrige undersøgelser og tekniske udvikling i øjeblikket fokuserer på virkningerne af stråling1,2,3. Microbeam bestråling er et kraftfuldt middel til at identificere radiosensitive websteder i levende organismer4. Den Takasaki avanceret stråling Institute af nationale forskningsinstitutter for Quantum og radiologisk videnskab og teknologi (QST-Takasaki) har udviklet en teknologi til at bestråle individuelle celler under mikroskopisk observation ved hjælp af tung-ion microbeams5, og har etableret metoder for at aktivere målrettede microbeam bestråling af flere model dyr, såsom nematode Caenorhabditis elegans4,6, silkeorme7og Oryzias latipes (japanske medaka)8. Målrettede microbeam bestråling af det ødelægge C. elegans tillader den effektive knockdown i specifikke regioner, såsom nerve ring i regionen hoved, hvilket bidrager til at identificere roller af disse systemer i processer som bevægelse.
En metode til-chip immobilisering af C. elegans enkeltpersoner uden behov for anæstesi er blevet udviklet for at muliggøre microbeam bestråling4. Derudover for at forbedre mikrofluid chips anvendes i den tidligere undersøgelse4, har vi for nylig udviklet vanddispergerbare, ion-gennemtrængelige, Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluid chips, omtales som orm ark (Se Tabel af materialer), for immobilisere C. elegans personer9. Disse omfatter ultra-tynd blød ark (tykkelse = 300 µm; bredde = 15 mm længde = 15 mm) med flere (20 eller 25) lige mikrofluid kanaler (dybde = 70 µm; bredde = 60 µm eller 50 µm; længde = 8 mm) på overfladen (figur 1A-D). Mikrofluid kanalerne er åbne og tillade flere dyr til at blive lukket inde i dem samtidig (figur 1E). Arkene er modstandsdygtige at tillade mikrofluid kanalerne skal udvides (ved ~ 10%, figur 1F), og elasticitet tillader dyr at være indhyllet forsigtigt. Også, på grund af selvstændig adsorption kapaciteten af PDMS, dyr kan være forseglet i kanaler ved at dække overfladen af ormen ark med et tyndt dække film, hvor dyr ikke er skubbet ind i kanalerne til kabinet. Ved at dreje dækslet film over, kan vi nemt indsamle dyr.
Kanalerne ondt ikke orme, når de er ved at blive lukket, eller når de er indsamlet. Derudover arkene er lavet af PDMS, som er det væsentlige hydrofobe, men væskeophobning kan opnås ved at videregive hydrofiliciteten til materialet. Væskeophobning og tykkelse er gunstige egenskaber orm ark. Vand-retention kapacitet forhindrer dehydrering af dyrene efter forlænget immobilisering og gør det muligt for langsigtede observationer skal udføres.
Desuden, som tidligere beskrevet9, er arkene kun 300 µm tykt, så tunge ioner som kulstof ioner (med et udvalg af omkring 1 mm i vand) til at passere gennem arket omslutter dyr. Dette giver mulighed for ion partikler til at blive opdaget og de anvendte strålingsdosis skal måles nøjagtigt. Derudover orm ark kan genbruges og er dermed økonomisk. Med den konventionelle injektion metode, dyrene lukket er undertiden døde og de kan ikke tages ud af kanalen. deres æg kan også blokere kanalerne. Dette gør chippen ubrugelig. Chips er derfor dybest set engangs og cost-benefit-forholdet er dårligt.
I det foreliggende papir, vi beskriver i detaljer en række metoder til-chip immobilisering af levende C. elegans enkeltpersoner ved hjælp af orm ark. Gennem bevægelse assays af dyr 3 h efter-chip immobilisering vurderet vi egnet dækning film. Derudover viste vi eksempler på-chip immobilisering for både imaging observationer og microbeam bestråling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1151px;" width="1152">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">C. elegans wild-type strain</td>
			<td style="width:125px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td>
			<td style="width:353px;">N2</td>
			<td style="width:449px;">Wild-type C. elegans strain generally used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain</td>
			<td style="width:125px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td>
			<td style="width:353px;">CB4845</td>
			<td style="width:449px;">C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:223px;">C. elegans transgenic strain HBR4</td>
			<td style="width:125px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td>
			<td style="width:353px;">HBR4</td>
			<td style="width:449px;">The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54&#8211;3&#8217;utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">E. coli strain</td>
			<td style="width:125px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td>
			<td style="width:353px;">OP50</td>
			<td style="width:449px;">E. coli strain used as food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Worm Sheet IR (50/60)</td>
			<td style="width:125px;">Biocosm, Inc., Hyogo, Japan</td>
			<td>BCM17-0001</td>
			<td style="width:449px;">Microfluidic chip with 25 straight 50/60-&#181;m width channels used in all experiments and observation in this paper&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Worm Sheet 60</td>
			<td style="width:125px;">Biocosm, Inc., Hyogo, Japan</td>
			<td>BCM18-0001</td>
			<td style="width:449px;">Microfluidic chip with 20 straight 60 &#181;m-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Worm Sheet 50</td>
			<td style="width:125px;">Biocosm, Inc., Hyogo, Japan</td>
			<td>BCM18-0002</td>
			<td style="width:449px;">Microfluidic chip with 20 straight 50 &#181;m-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MICRO COVER GLASS</td>
			<td style="width:125px;">MATSUNAMI GLASS IND. LTD.</td>
			<td>C030401</td>
			<td style="width:449px;">Cover glass (thickness: 130-170 &#181;m) used in locomotion assays in Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polystyrene Film</td>
			<td style="width:125px;">Biocosm, Inc., Hyogo, Japan</td>
			<td>BCM18-0001/ BCM18-0002</td>
			<td style="width:449px;">Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 &#181;m) used in locomotion assays in Protocol 3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyester Film Lumirror</td>
			<td style="width:125px;">TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan</td>
			<td>Lumirror T60 (t 125 &#181;m)</td>
			<td style="width:449px;">PET filim (thickness: 125 &#181;m) used in locomotion assays in Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IWAKI 60 mm/non-treated dish</td>
			<td style="width:125px;">AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan).</td>
			<td>1010-060</td>
			<td style="width:449px;">Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IWAKI 35 mm/non-treated dish</td>
			<td style="width:125px;">AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan).</td>
			<td>1010-035</td>
			<td style="width:449px;">Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Milli-Q</td>
			<td style="width:125px;">Merck, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:449px;">Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kimwipe S-200</td>
			<td style="width:125px;">Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan</td>
			<td>62020</td>
			<td style="width:449px;">120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">WormStuff Worm Pick</td>
			<td style="width:125px;">Genesee Scientific Corporation, CA, USA)</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td style="width:449px;">Platina picker specilized for picking up C. elegans</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Research Stereo Microscope System</td>
			<td style="width:125px;">OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZX16</td>
			<td style="width:449px;">Micriscope used in all experiments and observation in this paper</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Motorized Focus Stand for SZX16</td>
			<td style="width:125px;">OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:353px;">SZX2-ILLB</td>
			<td style="width:449px;">This was used for bright field observation in Protocol 3-8.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective Lens (&#215;1)</td>
			<td style="width:125px;">OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan</td>
			<td>SDFPLAPO1&#215;PF</td>
			<td style="width:449px;">NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective Lens (&#215;2)</td>
			<td style="width:125px;">OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan</td>
			<td>SDFPLAPO2XPFC</td>
			<td style="width:449px;">NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This&#160; lends was used for imaging observations.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of live caenorhabditis elegans individuals using an ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention

Stråling er almindeligt anvendt til biologiske applikationer og ion-beam avlsdyr, og blandt disse metoder, microbeam bestråling udgør et effektivt middel til at identificere radiosensitive websteder i levende organismer. Dette papir beskriver en række på chip immobilisering metoder udviklet for målrettet microbeam bestråling af levende individer af Caenorhabditis elegans. Især behandlingen af Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluid chips, som vi tidligere har udviklet til at immobilisere C. elegans enkeltpersoner uden behov for anæstesi er forklaret i detaljer. Denne chip, omtales som en orm ark, er modstandsdygtige at tillade mikrofluid kanalerne skal udvides, og elasticitet tillader dyr at være indhyllet forsigtigt. Også, på grund af selvstændig adsorption kapaciteten af PDMS, dyr kan være forseglet i kanaler ved at dække overfladen af ormen ark med et tyndt dække film, hvor dyr ikke er skubbet ind i kanalerne til kabinet. Ved at dreje dækslet film over, kan vi nemt indsamle dyr. Derudover orm ark viser væskeophobning og tillader C. elegans enkeltpersoner udsættes for mikroskopiske observation i lange perioder under live betingelser. Arket er derudover kun 300 µm tykt, så tunge ioner som kulstof ioner passere arket omslutter dyr, således at ion partiklerne til at blive opdaget og de anvendte strålingsdosis skal måles nøjagtigt. Fordi udvalg af cover film bruges til omslutter dyrene er meget vigtigt for vellykket langvarig immobilisering, vi gennemførte udvælgelse af passende dækning film og viste en anbefalede en blandt nogle film. Et ansøgning eksempel på chippen indførte vi imaging observation af muskulære aktiviteter af dyr omslutter mikrofluid kanalen af arket orm, samt microbeam bestråling. Disse eksempler viser, at ormen ark høj grad har udvidet mulighederne for biologiske eksperimenter.

Aktive C. elegans enkeltpersoner kunne være immobiliseret lykkedes ved hjælp af en ultra-tynd, sprøjtepulver PDMS, mikrofluid chip (orm ark). Vi undersøgte egnetheden af forskellige cover film til tætning arket orm, som beskrevet i afsnit 3-protokollen. For at evaluere effekterne forsegling af cover film, vi bestemt motilitet af dyr 3 h efter-chip immobilisering ved hjælp af dækslet glas (tykkelse: 130-170 µm), PET-folie (tykkelse: 125 µm), og PS film (tykkelse: ~ 130 µ...

Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention at JoVE.com

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Immobilisering af levende Caenorhabditis elegans enkeltpersoner ved hjælp af en ultra-tynd Polydimethylsiloxan mikrofluid Chip med væskeophobning

En serie af immobilisering metoder er blevet etableret til at tillade den målrettede bestråling af levende Caenorhabditis elegans enkeltpersoner ved hjælp af en nyligt udviklede ultra-tynde Polydimethylsiloxan mikrofluid chip med væskeophobning. Denne roman på chip immobilisering er også passende for imaging observationer. Detaljeret behandling og applikationseksempler chip er forklaret.

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

En fordel ved denne protokol er, at ormen ark er let at håndtere. Arket har funktioner, der forhindrer tørring, gør det muligt for os at foretage mikrostrålebestråling til levende dyr, udføre flere adfærdsmæssige analyser, og langsigtet observation. De mikrofluidiske kanaler i dette ormeark er åbne, hvilket gør det nemmere at indsamle dyr.Disse ormeark kan også bruges gentagne gange, hvilket gør dem mere økonomiske. Da vi udviklede denne teknik, ønskede vi kun at bestråle en del af dyrene med en mikrobæmme under et mikroskop. Så vi havde brug for klare, meget tynde chips i stand til at holde dyrene.Til at begynde, placere en tynd, gennemsigtig ark på scenen til brug som en bund dække film. Placer forsigtigt et ormeark på den nederste dækfilm med flad pincet. Placer mindst tre dråber bufferopløsning på overfladen af en 6 centimeter, ikke-behandlet petriskål.Vælg derefter flere voksne C.elegans med en platina picker fra en kulturplade. Overfør dyrene til en dråbe med platina picker og lad dyrene svømme i buffer for at fjerne eventuelle bakterier. Vask dyrene i to separate dråber og skyl dyrene i en anden dråbe.Placer derefter en dråbe bufferløsning på overfladen af ormearket. Fjern de vaskede dyr fra bufferdråbeværktøjet, og overfør dem til en dråbe på ormearket. Brug flad pincet til at placere en PS-coverfilm over ormenarket, og tryk forsigtigt over kanalerne fra den ene ende af arket til den anden.Eller bare drop dyr i dråbe og forsigtigt forsegle med dækslet filmen, så dråbe spreder sig mellem dækslet og ormen ark med dyrene i kanalen. Bekræft dyrene er i live ved at kontrollere for bevægelse med et mikroskop på 1-2x forstørrelse. Dyrenes positioner registreres, og nummeret på den kanal, hvori hvert dyr er lukket, og hvert dyrs position i kanalen registreres.Til indsamling af immobiliserende dyr skal du bruge flade pincet til at fjerne dækslet fra ormearket og derefter slippe 10-15 mikroliter bufferopløsning på en af de mikrofluidiske kanaler, der omslutter dyrene. Under stereomikroskopet skal du observere dyrene, når de begynder at spinde. Brug derefter platina picker til at afhente svømning dyr og overføre dem til en analyse plade.Efter omslutter dyrene som tidligere påvist, observere fluorescerende pletter på dyrene med en flourescence mikroskop. Så billede calcium ion bølge formering ved hjælp af video erhvervelse til at observere dynamiske aktiviteter. Placer den brugte orm ark på en seks centimeter petriskål og sted omkring 100 mikroliter af steriliseret ultra-rent vand på arket.Brug behandskede fingre til at sprede vand på overfladen af arket og vaske eventuelle forurenende stoffer. Brug derefter engangsservietter til at fjerne fugten fra ormearket. Dispensere fem milliliter 70% ethanol i Petri-skålen og bruge behandskede fingre til at sprede ethanol over ormen ark.Endelig, efter arket er tørt, placere arket på en steril Petri-skål og dække. Ved hjælp af denne protokol blev egnetheden af forskellige coverfilm undersøgt. Der var ingen signifikant forskel i motilitet mellem kontroldyr og dyr, der var omgivet af mikrofluidiske kanaler med PS-film.I modsætning hertil blev motilitet signifikant reduceret i dyr, der var lukket under et dækglas. Den motilitet af dyr omgivet med et kæledyr film blev også betydeligt nedsat. Det er vigtigt at vælge coverfilm til forsegling af mikrofluidic kanaler omhyggeligt.Ved hjælp af denne protokol evaluerede vi egnetheden af forskellige coverfilm gennem bevægelsesanalyser af dyrene tre timer efter immobilisering på chippen. Ved hjælp af denne teknik havde vi kun til hensigt at udvikle en ultratynd vådchip til bestråling af mikrostråler. Men, disse orm ark er allerede blevet brugt til billedbehandling og adfærdsmæssige analyser ud over deres oprindelige applikationer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescenspåvisning metoder for mikrofluide dråbe platforme

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Mikrofluid-baserede Electrotaxis for On-demand kvantitativ analyse af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Mikrofluid chip fabrikation og metode til at påvise Influenza

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

En Mikrofluid Chip til Alsidig kemisk analyse af enkelte celler

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

En Mikrofluid Chip for ICPMS Sample Introduktion

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier af lungecancerceller ved hjælp af en Multichannel Dual-elektriske-felt Mikrofluid Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

Tredimensionalt trykte Mikrofluid Cross-flow System for Ultrafiltrering / nanofiltreringsmembran Performance Test

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Automatiseret lipiddobbeltlagsmembranen Formation Ved hjælp af en Polydimethylsiloxan Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Hurtig Subtraktiv mønster af levende cellelag med et Mikrofluid Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

Polydimethylsiloxan-polykarbonat mikrofluidenheder for Cell Migrationsstudier Under Perpendicular Kemiske og Oxygen farveforløb

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...