Name: immobilization of live caenorhabditis elegans individuals using an ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention
Uploaded: 2019-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Atsushi Higashitani for snill råd om behandling av C. elegans og Dr. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota og Yasuhiko Kobayashi for verdifulle diskusjoner. Forfatterne takker Caenorhabditis genetisk Center for å gi stammer av C. elegans og E. coli. Vi takker mannskapet på cyclotron av TIARA på QST-Takasaki for deres type hjelp med bestråling eksperimenter. Vi takker Dr. Susan Furness for å redigere et utkast av dette manuskriptet. Denne studien ble støttet i en del av KAKENHI (Grant tall JP15K11921 og JP18K18839) fra JSP til M.S.

1. stammer og vedlikehold
<ol><li>Velg en passende stamme av C. elegans og Escherichia coli (mat) avhengig av formålet av eksperimentet. Merk: I dagens papir, vill-type N210C. elegans (figur 2A) er vanligvis brukt, og HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3 utr, unc-119(+)] V11 er bare ansatt for imaging analysen. E. coli OP50 ble brukt som mat for C. elegans. Noen ...

<ol>
	<li>Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy-Ion+microbeams-development+and+applications+in+biological+studies.">Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies.</a> IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).</li><li>Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+biological+effects+of+ion+beams+on+lethality,+molecular+nature+of+mutation,+mutation+rate,+and+spectrum+of+mutation+phenotype+for+mutation+breeding+in+higher+plants.">Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants.</a> Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).</li><li>Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Br&#228;uer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbeam+evolution:+from+single+cell+irradiation+to+pre-clinical+studies.">Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies.</a> International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).</li><li>Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+irradiation+system+with+heavy-ion+microbeam+for+active+individuals+of+Caenorhabditis+elegans.">Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).</li><li>Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy-ion+microbeam+system+at+JAEA-Takasaki+for+microbeam+biology.">Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology.</a> Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).</li><li>Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+arrest+and+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans+germline+cells+following+heavy-ion+microbeam+irradiation.">Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation.</a> International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).</li><li>Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+irradiation+method+for+the+first+instar+silkworm+larvae+using+locally+targeted+heavy-ion+microbeam.">Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam.</a> Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).</li><li>Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscopal+activation+of+microglia+in+embryonic+fish+brain+following+targeted+irradiation+with+heavy-ion+microbeam.">Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).</li><li>Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration.">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1 (1), 12-14 (2012).</li><li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Biology. 204, 1757-1764 (2001).</li><li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+locomotory+rate+is+modulated+by+the+environment+through+a+dopaminergic+pathway+and+by+experience+through+a+serotonergic+pathway.">C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li><li>Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+calcium+leakage+causes+mitochondrial+damage+in+Caenorhabditis+elegans+body-wall+muscles.">Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles.</a> Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).</li><li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles.">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. 2, 1-13 (2006).</li><li>Aubry, G., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perspective+on+optical+developments+in+microfluidic+platforms+for+Caenorhabditis+elegans+research.">A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research.</a> Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).</li><li>Lumirror Catalog. TORAY Available from: <a target="_blank" href="https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf">https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf</a> (2018)</li><li>Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-moulded+substrates+for+the+analysis+of+structure-dependent+behaviour+of+nematodes.">Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes.</a> Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans.">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).</li><li>Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+dirt:+Microfluidic+substrates+for+nematode+neurobiology+and+behavior.">Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior.</a> Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).</li><li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li><li>Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+microfluidics+device+for+mechanical+stimulation+and+high+resolution+imaging+of+C.+elegans.">Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).</li></ol>

På prosessoren immobilisering C. elegans under bor forhold med en vannbløtbart PDMS microfluidic brikke muliggjør effektiv målrettet microbeam bestråling av flere dyr. Enkel håndtering og funksjoner for å hindre tørking gjør dette systemet egnet for programmer ikke bare i microbeam bestråling, men også i flere atferdsmessige analyser. Disse ormen ark har allerede blitt kommersialisert og oppnås enkelt. Konvensjonelle microfluidic chips, for eksempel olfactory brikker, er forbundet med problemer inklu...

Stråling, inkludert røntgenstråler, gammastråling og tunge-ion stråle, er mye brukt for biologiske applikasjoner som kreftdiagnostikk og behandling og ion-beam avl. Tallrike studier og teknologiske er for tiden fokusere på effekter av stråling1,2,3. Microbeam bestråling er en kraftig måte å identifisere radiosensitive områder i levende organismer4. Den Takasaki avansert stråling Research Institute av nasjonale institutter for Quantum og radiologiske vitenskap og teknologi (QST-Takasaki) har utviklet en teknologien å irradiate enkeltceller under mikroskopisk observasjon med tunge-ion microbeams5, og har etablert metoder for å aktivere målrettet microbeam bestråling av flere modell dyr, som Rundormer Caenorhabditis elegans4,6, silkeormer7og Oryzias latipes (japansk medaka)8. Målrettet microbeam bestråling av Rundormer C. elegans kan effektiv knockdown av bestemte områder, for eksempel nerve ringen i regionen hodet, dermed bidra til å identifisere roller av disse systemene i prosesser som bevegelse.
En metode for på prosessoren immobilisering av C. elegans individer uten behov for anestesi er utviklet for å tillate microbeam bestråling4. I tillegg for å forbedre microfluidic brikker i den tidligere studien4, har vi nylig utviklet vannbløtbart, ion-penetrable, polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips, kalles ormen ark (se Tabell for materiale), for immobilizing C. elegans enkeltpersoner9. Dette omfatter ultratynne myk ark (tykkelse = 300 µm; bredde = 15 mm; lengde = 15 mm) med flere (20 eller 25) rett microfluidic kanaler (dybde = 70 µm; bredde = 60 µm eller 50 µm; lengde = 8 mm) på overflaten (figur 1A-D). Microfluidic kanaler er åpne og la flere dyr å stå i dem samtidig (figur 1E). Arkene er resilient å tillate microfluidic kanalene skal utvides (med ~ 10%, figur 1F) og elastisitet gjør dyr til være omsluttet forsiktig. Også, på grunn av selvtillit adsorpsjon kapasiteten til PDMS, dyr kan tettes kanalene av dekker overflaten av ormen en tynn dekke film, der dyr ikke er trykket inn kanalene for kabinett. Ved å dreie dekselet film over, kan vi enkelt samle dyrene.
De gjør ikke vondt ormer når de står eller når de er samlet. Videre arkene er laget av PDMS, som er i hovedsak hydrofobe, men vannretensjon kan oppnås ved å formidle hydrophilicity til materialet. Vannretensjon og tykkelse er gunstige egenskaper av ormen ark. Vannretensjon kapasiteten forhindrer dehydrering av dyrene etter langvarig immobilisering og gjør det mulig langsiktige observasjoner utføres.
Dessuten, som beskrevet tidligere9, er arkene bare 300 µm tykk, slik at tunge ioner som karbon ioner (med en rekke ca 1 mm i vann) gjennom arket omsluttende dyrene. Dette gir ion partikler kan oppdages og brukte stråling dosen skal måles nøyaktig. Videre ormen arkene kan gjenbrukes og er dermed økonomisk. Med metoden konvensjonelle injeksjon dyrene vedlagt er noen ganger død og de kan ikke tas ut av kanalen. egg kan også tette kanalene. Dette gjør chip ubrukelig. Chips er derfor i utgangspunktet disponibel og det kost-nytte-forholdet er dårlig.
I dagens papir, vi beskrive i detalj en rekke metoder for på prosessoren immobilisering av live C. elegans personer som bruker ormen ark. Gjennom bevegelse analyser av dyr 3t etter på prosessoren immobilisering vurdert vi egnet dekke filmen. I tillegg viste vi eksempler på på prosessoren immobiliseringsløsninger til både tenkelig observasjoner og microbeam bestråling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1151px;" width="1152">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">C. elegans wild-type strain</td>
			<td style="width:125px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td>
			<td style="width:353px;">N2</td>
			<td style="width:449px;">Wild-type C. elegans strain generally used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain</td>
			<td style="width:125px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td>
			<td style="width:353px;">CB4845</td>
			<td style="width:449px;">C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:223px;">C. elegans transgenic strain HBR4</td>
			<td style="width:125px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td>
			<td style="width:353px;">HBR4</td>
			<td style="width:449px;">The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54&#8211;3&#8217;utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">E. coli strain</td>
			<td style="width:125px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td>
			<td style="width:353px;">OP50</td>
			<td style="width:449px;">E. coli strain used as food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Worm Sheet IR (50/60)</td>
			<td style="width:125px;">Biocosm, Inc., Hyogo, Japan</td>
			<td>BCM17-0001</td>
			<td style="width:449px;">Microfluidic chip with 25 straight 50/60-&#181;m width channels used in all experiments and observation in this paper&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Worm Sheet 60</td>
			<td style="width:125px;">Biocosm, Inc., Hyogo, Japan</td>
			<td>BCM18-0001</td>
			<td style="width:449px;">Microfluidic chip with 20 straight 60 &#181;m-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Worm Sheet 50</td>
			<td style="width:125px;">Biocosm, Inc., Hyogo, Japan</td>
			<td>BCM18-0002</td>
			<td style="width:449px;">Microfluidic chip with 20 straight 50 &#181;m-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MICRO COVER GLASS</td>
			<td style="width:125px;">MATSUNAMI GLASS IND. LTD.</td>
			<td>C030401</td>
			<td style="width:449px;">Cover glass (thickness: 130-170 &#181;m) used in locomotion assays in Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polystyrene Film</td>
			<td style="width:125px;">Biocosm, Inc., Hyogo, Japan</td>
			<td>BCM18-0001/ BCM18-0002</td>
			<td style="width:449px;">Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 &#181;m) used in locomotion assays in Protocol 3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyester Film Lumirror</td>
			<td style="width:125px;">TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan</td>
			<td>Lumirror T60 (t 125 &#181;m)</td>
			<td style="width:449px;">PET filim (thickness: 125 &#181;m) used in locomotion assays in Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IWAKI 60 mm/non-treated dish</td>
			<td style="width:125px;">AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan).</td>
			<td>1010-060</td>
			<td style="width:449px;">Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IWAKI 35 mm/non-treated dish</td>
			<td style="width:125px;">AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan).</td>
			<td>1010-035</td>
			<td style="width:449px;">Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Milli-Q</td>
			<td style="width:125px;">Merck, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:449px;">Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kimwipe S-200</td>
			<td style="width:125px;">Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan</td>
			<td>62020</td>
			<td style="width:449px;">120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">WormStuff Worm Pick</td>
			<td style="width:125px;">Genesee Scientific Corporation, CA, USA)</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td style="width:449px;">Platina picker specilized for picking up C. elegans</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Research Stereo Microscope System</td>
			<td style="width:125px;">OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZX16</td>
			<td style="width:449px;">Micriscope used in all experiments and observation in this paper</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Motorized Focus Stand for SZX16</td>
			<td style="width:125px;">OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:353px;">SZX2-ILLB</td>
			<td style="width:449px;">This was used for bright field observation in Protocol 3-8.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective Lens (&#215;1)</td>
			<td style="width:125px;">OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan</td>
			<td>SDFPLAPO1&#215;PF</td>
			<td style="width:449px;">NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective Lens (&#215;2)</td>
			<td style="width:125px;">OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan</td>
			<td>SDFPLAPO2XPFC</td>
			<td style="width:449px;">NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This&#160; lends was used for imaging observations.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of live caenorhabditis elegans individuals using an ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention

Stråling er mye brukt for biologiske programmer og ion-beam avl, og blant disse metodene, microbeam bestråling representerer en kraftig måte å identifisere radiosensitive områder i levende organismer. Dette dokumentet beskriver en rekke på prosessoren immobilisering metoder utviklet for målrettet microbeam bestråling av levende individer av Caenorhabditis elegans. Spesielt behandling av polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic brikker som vi utviklet for å nakkens C. elegans enkeltpersoner uten behov for anestesi er forklart i detalj. Denne brikken, referert til som en orm ark, er resilient å tillate microfluidic kanalene skal utvides, og elastisitet tillater dyr å være innhyllet forsiktig. Også, på grunn av selvtillit adsorpsjon kapasiteten til PDMS, dyr kan tettes kanalene av dekker overflaten av ormen en tynn dekke film, der dyr ikke er trykket inn kanalene for kabinett. Ved å dreie dekselet film over, kan vi enkelt samle dyrene. Videre ormen arket viser vannretensjon og tillater C. elegans individer utsettes for mikroskopiske observasjon i lange perioder under bor forhold. I tillegg er arket bare 300 µm tykk, slik at tunge ioner som karbon ioner gjennom arket omsluttende dyrene, slik at ion partikler kan oppdages og brukte stråling dosen skal måles nøyaktig. Utvalg av dekselet filmene brukes for omsluttende dyrene er svært viktig for vellykket langvarig immobilisering, vi gjennomført valg av egnet dekke filmene og viste en anbefalt blant noen filmer. Eksempel søknad av chip introdusert vi tenkelig observasjon av muskel aktiviteter av dyr omsluttende mikrovæskekanalen orm arket, i tillegg til microbeam-bestråling. Disse eksemplene viser at ormen arkene har sterkt utvidet mulighetene for biologiske forsøk.

Aktive C. elegans enkeltpersoner kan bli immobilisert vellykket bruker en ultratynn og vannbløtbart PDMS, microfluidic chip (orm ark). Vi undersøkt hensiktsmessigheten av forskjellige cover filmer for tetting ormen arket, som beskrevet i del 3-protokollen. For å evaluere tetting effekten av dekselet filmene, vi bestemt motilitet i dyr 3t etter på prosessoren immobilisering bruke cover glass (tykkelse: 130-170 µm), PET film (tykkelse: 125 µm), og PS film (tykkelse: ~ 130 µm...

Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention at JoVE.com

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Immobilisering av Live Caenorhabditis elegans individer med en Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic brikke med vann oppbevaring

En rekke immobilisering metoder er etablert for å tillate den målrettede bestråling av live Caenorhabditis elegans personer som bruker en nylig utviklet ultra-spinkle polydimethylsiloxane microfluidic chip med vann oppbevaring. Denne romanen på prosessoren immobilisering er også tilstrekkelig for imaging observasjoner. Detaljert behandling og programmet eksempler av brikken er forklart.

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

En fordel med denne protokollen er at ormarket er lett å håndtere. Arket har funksjoner som forhindrer tørking, slik at vi kan utføre mikrobeambestråling til levende dyr, utføre flere atferdsanalyser og langsiktig observasjon. De mikrofluidiske kanalene i dette ormarket er åpne, noe som gjør det lettere å samle dyr.Disse ormarkene kan også brukes gjentatte ganger, noe som gjør dem mer økonomiske. Da vi utviklet denne teknikken, ønsket vi å bestråle bare en del av dyrene med mikroam under et mikroskop. Så vi trengte klare, veldig tynne chips i stand til å holde dyrene.For å begynne, plasser et tynt, gjennomsiktig ark på scenen for bruk som en bunndekselfilm. Plasser forsiktig et ormark på bunndekselet med flate pinsett. Plasser minst tre dråper bufferløsning på overflaten av en 6 centimeter, ikke-behandlet petriskål.Deretter velger du flere voksne C.elegans med en platina picker fra en kulturplate. Overfør dyrene til en dråpe med platinaplukkeren og la dyrene svømme i buffer for å fjerne bakterier. Vask dyrene i to separate dråper og skyll dyrene i en annen dråpe.Deretter plasserer du en dråpe bufferløsning på overflaten av ormarket. Fjern de vasket dyrene fra bufferdråpen, og overfør dem til en dråpe på ormarket. Bruk flate pinsett til å plassere en PS-forsidefilm over ormarket, og trykk forsiktig over kanalene fra den ene enden av arket til den andre.Eller bare slipp dyr i dråpe og forsiktig forsegle med dekkfilmen slik at dråpen sprer seg mellom dekselet og ormarkene med dyrene i kanalen. Bekreft at dyrene er i live ved å se etter bevegelse med et mikroskop ved 1-2x forstørrelse. Registrer dyrenes posisjoner og legg spesielt merke til nummeret på kanalen der hvert dyr er vedlagt, og plasseringen av hvert dyr i kanalen.For å samle immobiliserende dyr, bruk flate pinsett for å fjerne dekkfilmen fra ormarket, og slipp deretter 10-15 mikroliter bufferløsning på en av de mikrofluidiske kanalene som omslutter dyrene. Under stereomikroskopet observerer du dyrene når de begynner å spinne. Bruk deretter platinaplukkeren til å plukke opp svømmedyrene og overføre dem til en analyseplate.Etter å ha omsluttet dyrene som tidligere demonstrert, observere fluorescerende flekker på dyrene med et flourescence mikroskop. Deretter bilde kalsium ion bølge forplantning ved hjelp av video oppkjøp for å observere dynamiske aktiviteter. Legg det brukte ormarket på en seks centimeter petriskål og legg ca 100 mikroliter sterilisert ultra rent vann på arket.Bruk hansker fingre for å spre vann på overflaten av arket og vaske av eventuelle forurensninger. Deretter bruker du engangsservietter for å fjerne fuktigheten fra ormarket. Dispenser fem milliliter med 70% etanol i petriskålen og bruk hanskerfingre til å spre etanol over ormarket.Til slutt, etter at arket er tørt, legg arket på en steril petriskål og deksel. Ved hjelp av denne protokollen ble egnetheten til forskjellige coverfilmer undersøkt. Det var ingen signifikant forskjell i motilitet mellom kontrolldyr og dyr omsluttet av mikrofluidiske kanaler med PS-film.I motsetning ble motiliteten betydelig redusert hos dyr omsluttet under et dekkglass. Motiliteten til dyr vedlagt med en dyrefilm ble også betydelig redusert. Det er viktig å velge dekkfilmer for tetting av mikrofluidiske kanaler nøye.Ved hjelp av denne protokollen evaluerte vi egnetheten til forskjellige coverfilmer gjennom bevegelsesanalyser av dyrene tre timer etter immobilisering på chip. Ved hjelp av denne teknikken hadde vi til hensikt å utvikle en ultratynn våtbrikke bare for mikrobeambestråling. Imidlertid har disse ormarkene allerede blitt brukt til avbildning og atferdsanalyser utover sine opprinnelige applikasjoner.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescens deteksjon metoder for microfluidic dråpe plattformer

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-baserte Electrotaxis for On-demand Kvantitativ analyse av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Microfluidic Chip Fabrikasjon og metode for å oppdage Influensa

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

En Microfluidic Chip for Allsidig Kjemisk analyse av enkeltceller

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

En mikrofluid Chip for ICPMS Sample Innledning

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier av lungekreft celler ved hjelp av en Multichannel Dual-elektrisk-felt microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Three-Dimensionally Printed Microfluidic Cross-flow System for Ultrafiltration/Nanofiltration Membrane Performance Testing

Tredimensjonalt Trykt microfluidic Cross-flow system for ultrafiltrering / Nanofiltrering Membran Performance Testing

Minimization and management of membrane fouling is a formidable challenge in diverse industrial processes and other practices that utilize membrane ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Automatisert lipid bilaget Membran Dannelse Ved hjelp av en Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Subtraktiv Mønstring av levende cellelag med en mikrofluid Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

Polydimethylsiloxane-polykarbonat microfluidic Enheter for celle migrasjon Studies Under Perpendicular Kjemisk og Oksygen Graderinger

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...