Name: production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting
Uploaded: 2019-03-01T12:30:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting at JoVE.com

Vi vil gerne takke alle medlemmer af Whittaker og Daniel labs for nyttige kommentarer. Forskningsmidler blev leveret af NIH tilskud R21 AI111085 og R01 AI135270. T.T. anerkender støtte fra præsidentens Life Science Fellowship i Cornell University og National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant nr. DGE-1650441. Larsen anerkender støtte fra en Samuel C. Fleming familie Graduate stipendium og National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant nr. DGE-1650441. Dette arbejde er også støttet af National Science Foundation 1504846 (til S.D. og G.R.W.).

1. celle Seeding for Pseudotyped partikel produktion
Bemærk: Udføre dette trin i biosikkerhed kabinet.
<ol><li>Standard celle kultur teknikker, opnår en 80-90% sammenflydende 75 cm2 kolbe af HEK-293T/17 celler passaged i komplette Dulbecco er ændret Eagle's Medium (DMEM-C) med 10% (vol/vol) føtal bovin serum (FBS), 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 100 IE/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Forberede DMEM-T medium for transfections (dens sammensætning er den samme som DMEM-C men uden antibiotika).</li>
	<li>Vaske cellerne med 10 mL af pre varmede (37 ° C) Dulbecco phosphat bufferet saltvand (DPBS) to gange. Bemærk: Håndtere HEK293T/17 celler med omhu, da de nemt løsne.</li>
	<li>Opsug supernatanten og frigør celler med 1 mL 0,25% trypsin løsning pre varmes ved 37 ° C. Kolben celler ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 3−5 min, eller indtil celler begynder at afmonterer. Bemærk: Undgå inkubere celler med trypsin i mere end 5 min, da dette typisk fører til celle sammenklumpning.</li>
	<li>Deaktivere trypsin ved tilsætning af 4 mL af DMEM-C medium og tælle celler ved hjælp af en celle tælle dias og lysmikroskop. Bemærk: For at undgå at skulle tælle for mange celler, en yderligere fortynding skridt kan være påkrævet på forhånd. Husk at faktor i denne fortynding ved beregningen af den faktiske celle tæthed af trypsinized celler.</li>
	<li>Fortynd celler til 5 x 105 celler/mL med DMEM-C.</li>
	<li>Seed 6-godt vævskultur plade med 2 mL af celle løsning pr. brønd og forsigtigt flytte pladen frem og tilbage og side til side for at jævnt distribuere celler, undgå cirkelbevægelser. Bemærk: Dette er et vigtigt skridt. Jævnt fordelte celler vil sikre, at cellerne ikke klump i midten af brønde. Igen, dette sikrer god Transfektion effektivitetsgevinster og pseudotyped partikel produktion.</li>
	<li>Inkuber plade natten (16 – 18 h) i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator.</li>
</ol>2. tre-plasmid Co Transfektion
Bemærk: Udføre dette trin i biosikkerhed kabinet.
<ol><li>Observere celler under en inverteret lysmikroskop hen til indskrive nemlig den celle morfologi og tæthed. Bemærk: Ideelt set bør celle tæthed i rækken 40 – 60% confluency. Det er afgørende, at cellerne er hverken for sammenflydende (80−90% sammenflydende) heller ikke alt for tyndt fordelt (20−30% sammenflydende) i hver brønd. En celle tæthed af 40−60% confluency vil sikre en god pseudotyped partikler produktion.</li>
	<li>
Plasmider mix
	<ol>
<li>Beregne plasmid blanding for hver konvolut glycoprotein efter mængder for et godt af en 6-godt plade vist i tabel 1. Multiplicer mængder, hvis transfecting flere brønde og inkluderer en ekstra godt for at undgå at køre af mix. Bemærk: SARS-CoV S og MERS-CoV S kodning plasmider, omfatter Tom vektor kontrol for generation af negativ kontrol partikler, som mangler virale kuvert glykoproteiner (Δenv partikler) sammen med en positiv kontrol glykoprotein som vesikulære stomatitis-virus (VSV) G glykoprotein, der vides at håndfast inficere en meget bred vifte af celler (VSV-Gpp). Plasmider er tilgængelige efter anmodning.</li>
		<li>Bland beregnede mængder af plasmider og reducerede serum cellekulturmedium (Se Tabel af materialer) i et microcentrifuge rør.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lipid-baserede Transfektion reagens blandes (Se Tabel af materialer)<ol>
<li>Beregne diskenheder for Transfektion reagens mix fra de mængder, der er vist i tabel 2 for et godt (1:3 Transfektion ratio, Multiplicer mængder efter behov). Omfatte ekstra wells for at undgå at køre af Transfektion reagens mix.</li>
		<li>Bland beregnede mængder af lipid-baserede Transfektion reagens (3 µL pr. brønd) og nedsat serum cellekulturmedium (47 µL pr. brønd) i et microcentrifuge rør, og sørg for at tilføje Transfektion reagens i nedsat serum cellekulturmedium og ikke anden vej i nærheden af.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkuber begge blandinger (for et godt: 50 µL af plasmider mix og 50 µL af lipid-baserede Transfektion reagens blandes) særskilt for 5 min ved stuetemperatur.</li>
	<li>Tilsæt indholdet af Transfektion reagens mix til plasmider blandes i forholdet 1:1 (for 1 godt: 50 µL af hver mix)</li>
	<li>Udføre grundig op-ned Pipettering af den resulterende blanding.</li>
	<li>Inkuber mix i mindst 20 min. ved stuetemperatur.</li>
	<li>Opsug brugt mediet af celler.</li>
	<li>Tilføj forsigtigt 1 mL af pre varmede (37 ° C) reducerede serum cellekulturmedium pr. brønd.</li>
	<li>Tilføje dråbevis 100 µL af Transfektion mix til hver brønd. Bemærk: Udvise omhu, når du tilføjer Transfektion mix til wells af HEK-293T som de frigøre nemt.</li>
	<li>Inkuber celler i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator for 4-6 h.</li>
	<li>Der tilsættes 1 mL pr. brønd af pre varmede (37 ° C) DMEM-T medium, som ikke indeholder antibiotika Bemærk: Dette er et vigtigt skridt. Transfektion reagenser øge celle permeabilitet og øge følsomhed over for antibiotika. For at sikre god Transfektion effektivitet og pseudotyped partikel produktion, er det vigtigt at undgå at bruge cellekulturmedium indeholdende antibiotika</li>
	<li>Inkuber celler i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator for 48 h.</li>
</ol>3. pseudotyped partikler samling
Bemærk: Udføre dette trin i biosikkerhed kabinet.
<ol><li>Observere celler under inverteret lysmikroskop at tjekke for celle morfologi og almentilstand. Også kontrollere farven på det medie, der skal være lys pink/lidt orange. Bemærk: Dette er et vigtigt skridt. Hvis der er for meget celledød, tilknyttet Transfektion eller medium farve vendte orange/gul (sure pH), vil det typisk være forbundet med lavere udbytter i smitsomme pseudotyped partikler</li>
	<li>Overfør supernatanter af transfekteret celler til 50 mL konisk centrifugeglas.</li>
	<li>Der centrifugeres rør på 290 x g i 7 min til at fjerne celle debris.</li>
	<li>Filtrer klarede analysere gennem et filter, sterile 0,45 µm pore-størrelse.</li>
	<li>Gøre lille volumen delprøver (e.g., 500 µL eller 1 mL) af pseudotyped virus løsning i cryovials.</li>
	<li>Opbevares ved-80 ° C. Bemærk: Protokollen kan være midlertidigt her. Pseudotyped partikler er stabile ved-80 ° C for mange måneder men når optøet, undgå re frysning dem som de vil miste smitteevne</li>
</ol>4. pseudotyped partikel smitte af modtagelige celler
Bemærk: Udføre dette trin i biosikkerhed kabinet.
<ol><li>
Celle såning af følsomme celler i 24-godt plade
	<ol>
<li>Få af standard celle kultur teknikker 80−90% sammenflydende 75 cm2 kolbe af følsomme celler: Vero-E6 celler for SARS-CoV pseudotyped partikler (SARS-Spp) og Huh-7 celler for MERS-CoV S pseudotyped partikler (MERS-Spp). Bemærk: For at bekræfte, om de pseudotyped partikler, der er blevet produceret er smitsom, det er vigtigt at omhyggeligt vælge et passende modtagelige cellelinie for pseudovirion smitteevne assays. Ved hjælp af dårligt permissive celler vil føre til lavt smitteevne.</li>
		<li>Vaske cellerne to gange med 10 mL af pre varmede (37 ° C) DPBS.</li>
		<li>Opsug supernatanten og frigør celler med 1 mL 0,25% trypsin løsning pre varmes ved 37 ° C. Kolben celler ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 3−5 min, eller indtil celler begynder at afmonterer. Bemærk: Undgå inkubere celler med trypsin i mere end 5 minutter, da dette typisk fører til celle sammenklumpning. Huh-7 celler er særligt følsomme over for denne effekt.</li>
		<li>Deaktivere trypsin ved at tilføje DMEM-C medium og tælle celler ved hjælp af en celle tælle dias og lysmikroskop.</li>
		<li>Fortynd celler til 5 x 105 celler/mL med DMEM-C.</li>
		<li>Froe wells af en 24-godt plade med 0,5 mL af celle løsning pr. brønd og forsigtigt flytte pladen frem og tilbage og side til side for at jævnt distribuere celler, undgå cirkelbevægelser Bemærk: Dette er et vigtigt skridt. Jævnt fordelte celler vil sikre, at cellerne ikke klump i midten af brønde. Dette vil til gengæld sikre god smitteevne assays. For hver pseudotyped partikel (SARS-Spp, MERS-Spp) og betingelse, forberede tre brønde tre eksperimentelle replikater. Omfatte brønde for ikke-inficerede (ni), Tom vektor Δenv partikler og positiv kontrol partikler såsom VSV-Gpp</li>
		<li>Inkuber plade natten over (16−18 h) i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pseudotyped partikel infektion
	<ol>
<li>Observere celler under lysmikroskop og visuelt bekræfte at der er en sammenflydende tæppe af celler.</li>
		<li>Bringe cryovials af pseudotyped virus at tø på is.</li>
		<li>Vask celler tre gange med 0,5 mL pre varmede (37 ° C) DPBS Bemærk: Dette er et vigtigt skridt. Celler, ikke der ordentligt skylles forud for infektion typisk føre til dårlig smitteevne udlæsninger</li>
		<li>Opsug analysere af celler.</li>
		<li>Podes celler med 200 µL af optøede pseudotyped partikel løsning.</li>
		<li>Inkuber celler i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator for 1−2 h.</li>
		<li>Tilsæt 300 µL af pre varmede (37 ° C) DMEM-C medium.</li>
		<li>Inkuber celler i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator i 72 timer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. smitteevne kvantificering af Luciferase Assay udlæsning
Bemærk: Udføre indledende trin i biosikkerhed kabinet.
<ol><li>Tø luciferin substrat (opbevares ved-80 ° C) og 5 x luciferase assay lysisbuffer (opbevares ved-20 ° C) indtil de nå stuetemperatur.</li>
	<li>Fortynd luciferase assay lysisbuffer til 1 x med sterilt vand.</li>
	<li>Opsug analysere af celler inficeret med pseudotyped partikler.</li>
	<li>Tilsæt 100 µL 1 x luciferase assay lysisbuffer til hver brønd.</li>
	<li>Pladen anbringes på en rocker og Inkuber i 15 min med vuggende ved stuetemperatur (fra dette punkt og fremefter, pladen kan håndteres uden for et kabinet biosikkerhed).</li>
	<li>Forberede microcentrifuge rør til hver brønd ved at tilføje 20 µL af luciferin substrat i hver tube.</li>
	<li>Tænd luminometrisk.</li>
	<li>Udføre luciferase aktivitet måling, et godt ad gangen ved at overføre 10 µL af lysate til et rør indeholdende 20 µL af luciferin substrat.</li>
	<li>Svirp rør forsigtigt for at blande indholdet, men undgå at fortrænge væske på væggene i røret.</li>
	<li>Røret anbringes i enheden, og luk låget.</li>
	<li>Måle værdien luminescence af røret ved hjælp af en luminometrisk.</li>
	<li>Optage den relative lette måleenhed.</li>
	<li>Gentag trin 5.8 – 5.12 indtil alle brønde er analyseret. Bemærk: Med det relevante udstyr såsom en plade læsning luminometrisk, kan denne proces udføres automatisk. Analysen skal skaleres til plade-format (f.eks., 96 brønde plade format).</li>
</ol>6. dataanalyse
<ol><li>
Beregning og afbildning af relative luciferase enheder gennemsnit og standardafvigelser
	<ol>
<li>Bruge en graf plotte software til at beregne luciferase assay måling gennemsnit og standardafvigelser af eksperimentelle og biologiske replikater.</li>
		<li>Plotte data som liggende søjlediagram med standardafvigelser. Bemærk: Når du udfører statistiske analyser på data, Sørg for at medtage mindst tre biologiske replikater i datasæt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Denne protokol beskriver en metode til at producere effektivt pseudotyped partikler forsynet med S protein af risiko gruppe 3 coronavirus, SARS-CoV og MERS-CoV, i BSL-2 omgivelser. Disse partikler, der inkorporerer en luciferase reporter gen, give os mulighed at nemt kvantificere coronavirus S-medieret post begivenheder af en relativt simpel luciferase assay48,49,50,51. I smitteevne assays bruger permissive celler, bekræfte vi, at den luciferase aktivitet målt er afhængig af koncentrationen af partikler. Hertil kommer, ACE2 og DPP4 receptor Transfektion giver mulighed for mere effektiv løsning i dårligt permissive celler linjer, såsom HEK-293T celler. Metoden er meget tilpasningsdygtige til andre virale kuvert glykoproteiner og har været brugt i udstrakt grad48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, ofte som supplement til andre assays som biokemiske analyser eller indfødte virusinfektioner.
Den protokol, vi beskriver her er baseret på retrovirus MLV, der inkorporerer en luciferase reporter. Det er imidlertid vigtigt at understrege, at der er en meget bred vifte af andre pseudotyping systemer, der har med held udviklet til emballage coronavirus S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 og andre virale kuvert glykoproteiner10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. nogle af disse andre systemer er baseret på den almindeligt anvendte MLV retroviral core7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, eller baseret på den udbredte lentiviral HIV-1 pseudotyping system ved hjælp af forskellige strategier23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, eller med rhabdovirus vesikulær stomatitis-virus (VSV) som kernen, som giver mulighed for at inddrage en bred vifte kuvert glykoproteiner, og igen med forskellige ansat strategier37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. Derudover andre journalister såsom fluorescerende proteiner som normal god landbrugspraksis11,13 og RFP36eller enzymer end luciferase som β-galactosidase16,17 og udskilles alkalisk fosfatase (SEAP)42 er blevet med held ansat for målinger. Derudover i analysen præsenteret i denne protokol, blev en forbigående Transfektion brugt til at udtrykke MLV og CoV S gener og proteiner. Men der er andre strategier for udtryk, såsom generation af stabil cellelinjer til produktion af pseudotyped virus7,14. Hver af disse systemer har deres fordele og ulemper, er det vigtigt at overveje følgende vigtige parametre, når de beslutter hvilke pseudotyping system bedst passer en investigator behov: pseudovirion core (MLV, HIV-1, VSV eller andre), hvordan selektiv en bestemt pseudotyping kerne er indarbejde en specifik virale kuvert glykoprotein, reporter for assay udlæsning (normal god landbrugspraksis, luciferase, SEAP eller andre) og Transfektion strategi (antal plasmider involveret i co Transfektion, forbigående Transfektion eller generation af stabil cellelinjer).
Der er en række kritiske trin i metoden, der er vigtigt at understrege. Celle tæthed, især af HEK-293T/17 producent cellelinje er en kritisk faktor for at sikre vellykket Transfektion. En celle tæthed i rækken af 40 – 60% confluency fandtes for at være optimal. Højere tætheder typisk resultere i lav Transfektion effektivitet og lav partikel produktion. Det er også vigtigt at huske at HEK-293T/17 celler er mindre klæbende end andre cellelinjer. Bør udvises forsigtighed ved håndtering af dem for at undgå afmontering dem unødigt. En mulighed er at behandle celle kultur plastoverflader med poly-D-lysin til at forbedre overholdelsen. Desuden resulterer højere celle passage ofte i dårlig Transfektion priser. Efter tilføjer Transfektion reagens til HEK-293T/17 celler, er det også vigtigt at huske, at celle permeabilitet øger. Det er derfor på dette punkt er det bedst at undgå at bruge medium indeholdende antibiotika, da de kan øge cytotoksicitet. Før indsamling pseudotyped partikler, kontrollere farven på transfekteret HEK-293T/17 celle analysere. Typisk efter 48 h af Transfektion tager næringssubstrat cellefarve en orange-pink skær. Gul-farvet medium normalt oversætter til fattige pseudotyped partikler udbytter og er ofte et resultat af problemer med celle såning tæthed eller høj passage nummer.
I denne protokol udføres pseudotyped partikel produktion i en 6-godt plade format. For at øge mængden af producerede partikler, flere brønde i en 6-godt plade kan være transfekteret med den samme plasmider mix og analysere kan samles sammen. Swimmingpoolen kan derefter blive afklaret, filtreret og aliquoted. Alternativt, for at skalere produktionen op, andre former for fartøjer (f.eks. 25 eller 75 cm2 kolber) kan bruges. I dette tilfælde skal Transfektion betingelser skaleres i overensstemmelse hermed. I denne protokol, er smitteevne analysen udført ved hjælp af en 24-godt plade format og en luminometrisk, der kun tillader målinger en tube ad gangen. For høj overførselshastighed screeninger er andre formater også muligt, som 96-brønd plade format og en plade læser luminometrisk. Diskenheder og reagenser for luciferase assayet skal tilpasses i overensstemmelse hermed. Opbevaring af pseudotyped partikler i cryovials ved-80 ° C fastholder deres stabilitet i flere måneder uden mærkbar nedgang i smitteevne. Det anbefales ikke at udsætte dem for at fryse-tø cyklus som dette vil mindske deres smitteevne over tid. Derfor er det bedst at opbevare dem i små prøver som 0,5-1 mL og tø dem før en infektion.
Metoden præsenteres her har flere begrænsninger. Vigtigt er det faktum, at pseudotyped partikler sammenfatte kun viral entry begivenheder. For at analysere andre trin i smitsomme livscyklus, er andre assays påkrævet. Desuden, som MLV partikler bud på plasma membranen, det er vigtigt at huske på sind, kuvert glycoprotein undersøgt behov at også trafikken til plasma membran til indbygning i pseudovirions under produktionen. Som sådan, er det vigtigt at vide, hvor i cellen en bestemt virale kuvert glycoprotein udtrykkes i Transfektion betingelser, såsom ved at visualisere subcellulært lokalisering med en immunofluorescens analyse og/eller ved at kontrollere for fastholdelse signaler inden for protein. Mens protokollen beskriver trin for at producere og teste smitteevne, sådan måler omsætning af virale kuvert glykoproteiner i pseudotyped partikler ikke detaljer. Én metode er at udføre vestlige skamplet assays på koncentrerede opløsninger af partikler, som tidligere beskrevet50,51 for MERS-CoV S vedtægter. I disse assays, er S kuvert glycoprotein af MERS-CoV aftestede sammen med kapsid (p30) protein af MLV, som tillader os at normalisere indarbejdelse af S protein i partikler. Andre eksempler på sådanne assays analysere virale kuvert glycoprotein indbygning i pseudovirions er blevet udført for SARS-CoV S indarbejdelse i en HIV-1 lentiviral pseudovirion system32 , Ebola glycoprotein (GP) i en anden MLV pseudotyped partikel system17, og influenza hemagglutinin (HA) og neuraminidasetypen (NA) i VSV pseudovirions38. En nyere udvikling i kendetegner pseudotyped partikel produktion er brugen af innovative billedenheder som Nanosight: det gør det muligt for os at direkte visualisere, kvantificere og størrelse viruspartikler50. Enheden indeholder detaljerede oplysninger om generelle partikel produktion; Det er dog vigtigt at huske på at det ikke indeholder oplysninger om kuvert glycoprotein indarbejdelse. En fremtidig retning for anvendelsen af disse alsidige pseudovirion partikler er at analysere enkelte viral fusion begivenheder ved hjælp af enkelt partikel tracking, mikrofluidik og total interne reflection Fluorescens mikroskopi60,61 ,62. Sådanne metoder blev anvendt med succes til influenzavirus samt feline coronavirus partikler og influenza HA - og NA-pseudotyped VSV-baserede pseudovirions63. Indsættelsen af sådanne teknikker, der anvendes til coronavirus S-pseudotyped MLV-baserede partikler er i øjeblikket ved at blive udviklet.

Værten celleindtastning udgør de indledende skridt viral smitsomme livscyklus. For kappebærende virus indebærer dette binding til en enkelt vært celle receptoren eller flere receptorer, efterfulgt af fusion af viral og cellulær membraner. Disse væsentlige funktioner udføres af virale kuvert glykoproteiner1,2. Coronavirus kuvert glycoprotein kaldes spike (S) protein og er medlem af klassen jeg viral fusion proteiner2,3,4,5,6. At studere virale kuvert glykoproteiner er afgørende for at forstå mange vigtige egenskaber af en given virus, såsom: livscyklus indledning, sin vært og cellulære tropisme, interspecies transmission, viral patogenese, samt vært celle løsning veje. Pseudotyped viruspartikler, også kaldet pseudovirions, er stærke værktøjer, der gør det muligt at nemt studere funktionen af viral fusion proteiner. Pseudotyped partikler eller pseudovirions er kimære virioner, der består af en surrogat viral kerne med en heterolog virale kuvert protein på deres overflade. Den protokol hovedformål er at vise, hvordan du anskaffer coronavirus spike pseudotyped partikler, der er baseret på en murine leukæmi virus (MLV) kerne og indeholder et luciferase reporter gen. Som eksempler, metoden til at producere pseudotyped partikler med spike proteiner af højpatogen svær Akut respiratorisk syndrom (SARS) og Mellemøsten luftvejssyndrom (MERS) coronavirus præsenteres. Protokollen beskriver proceduren Transfektion involveret, hvordan at inficere modtagelige target-celler, og smitteevne kvantificering af luciferase assay.
Da post trinene i pseudovirions er underlagt coronavirus S på deres overflade, Angiv de celler i en lignende måde til native modparter. Som sådan, er de fremragende surrogater af funktionelle smitteevne assays. Pseudotyped partikler er sædvanligvis udvundet fra forældrenes model vira som retrovira (MLV7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 og lentivirus human immundefektvirus – HIV23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) eller rhabdoviruses (vesikulær stomatitis-virus-VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). når det bruges i pseudotyping, den parental virus genomer er blevet ændret for at fjerne væsentlige gener, gør dem defekte for varetagelse af en komplet replikering cyklus. Denne funktion tillader dem at blive brugt i mellemliggende biosikkerhed niveau faciliteter (BSL-2) og er en vigtig fordel over ved hjælp af højpatogen indfødte vira, der kræver højere biosikkerhed faciliteter (BSL-3, BSL-4, som ikke er så let tilgængelige) når gennemførelse af virus løsning undersøgelser. Her, S proteiner af risiko gruppe 3 patogener SARS-CoV og MERS-CoV bruges som eksempler på virale kuvert proteiner integreres i MLV pseudotyped partikler, generering af SARS-CoV S og MERS-CoV S pseudovirions (SARS-Spp og MERS-Spp, henholdsvis). Disse pseudovirions har held været anvendt i studier med fokus på post begivenheder af disse vira48,49,50,51. En anden fordel er at den teknik beskrevet her ikke er begrænset til pseudotyping coronavirus S proteiner: det er meget fleksibel og kan bruges til at inddrage repræsentanter for alle tre klasser af viral fusion proteiner. Eksempler kan nævnes influenza hemagglutinin (HA, klasse I)52, Ebola virus glycoprotein (GP klasse I), E1 protein alphavirus Semliki skov virus (SFV, klasse II), og VSV glycoprotein (G, klasse III)53. Derudover mere end en form for viral glycoprotein kan være co indarbejdet i en pseudotyped partikel, som i tilfælde af influenza HA- og NA - pseudotyped partikler51.
Baseret på arbejde udført af Bartosch et al.20, denne protokol beskriver generation af MLV pseudotyped partikler med en tre-plasmid Co Transfektion strategi ved hjælp af den alment tilgængelige og yderst Transfektion-kompetente HEK-293T celle linje 54. den første plasmid koder MLV core gener gag og pol men mangler MLV kuvert env genet. Den anden plasmid er en transfer vektor, der koder en firefly luciferase reporter gen, en MLV Ψ-RNA emballage signal, sammen med 5'- og 3'-flankerende MLV længe terminal repeat (LTR) regioner. Den tredje plasmid koder fusion protein af interesse, i dette tilfælde enten SARS-CoV S eller MERS-CoV S proteinet. Ved co Transfektion af de tre plasmider ved hjælp af en Transfektion reagens, får viral RNA og proteiner udtrykt i transfekteret celler giver generation af pseudotyped partikler. Da MLV bruges som pseudovirion rygrad, dette sker på plasmamembran: RNA'er indeholdende luciferase gen reporter og emballage signal få indkapslet i spirende partikler, der også omfatter plasma membran-udtrykt coronavirus spike proteiner. De partikler, der bud ud fra celler indeholder coronavirus S-protein på deres overflade og høstes til brug i smitteevne assays. Fordi pseudotyped partikler havnen coronavirus S protein og ikke MLV kuvert proteiner, når det bruges til at inficere celler, de opfører sig som deres indfødte coronavirus modstykker for post trin. Viral RNA indeholdende luciferase reporter og flankerende LTRs er derefter frigivet i cellen og retroviral polymerase aktiviteter aktiverer sin reverse transkription i DNA og integration i vært celle genom. Kvantificering af smitteevne af pseudotyped viruspartikler i inficerede celler er derefter udført med en simpel luciferase aktivitet assay. Fordi den DNA-sekvens, der bliver integreret i vært celle genom indeholder kun luciferase-genet, og ingen af MLV eller coronavirus protein-kodning gener, er de i sagens natur sikrere at bruge end replikationskompetente indfødte vira.
Ud over at være sikrere surrogater og meget fleksibel at tillade indarbejdelse af forskellige slags kuvert glykoproteiner, de pseudotyped partikler beskrevet her er også meget alsidige og kan bruges til at studere mange aspekter af virus løsning. Dette omfatter, men er ikke begrænset til: test vært celle modtagelighed over for virusinfektion, analysere den cellulære post veje et kappebærende virus bruger, at studere virkningerne af farmakologiske hæmmere og narkotika screeninger, gennemføre neutralisering antistof assays, kendetegner vært celleindtastning kappebærende virus, der ikke kan være kulturperler, og generere virale vektorer for gen levering, stabil cellulære udtryk af gener af interesse, eller genhæmning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1213px;" width="1212">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:419px;">Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells&#160;</td>
			<td style="width:287px;">ATCC</td>
			<td style="width:155px;">CRL-11268</td>
			<td style="width:353px;">Clone 17 cells are highly competent for transfection.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human hepatic Huh-7 cells&#160;</td>
			<td>Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition</td>
			<td>JCRB0403</td>
			<td style="width:353px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted light microscope with 10 &#215; objective&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#39;s medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>1614071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethanesulphonic acid (HEPES)&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#215; penicillin-streptomycin (PS) solution</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 &#215; solution&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:419px;">Cell counting slides with grids&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Kova</td>
			<td style="width:155px;">87144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-minimal essential medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45 &#181;m pore-size sterile filter&#160;</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10 mL syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5 &#215; luciferase assay lysis buffer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luciferin, substrate for luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile water&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E476-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GloMax 20/20 luminometer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>2030-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting

Protokollen har til formål at generere coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped partikler med en murine leukæmi virus (MLV) kerne og luciferase reporter, ved hjælp af en simpel Transfektion procedure i den alment tilgængelige HEK-293T celle linje. Når dannet og frigivet fra producent celler, indarbejde disse pseudovirions et luciferase reporter gen. Da de kun indeholder de heterolog coronavirus spike protein på deres overflade, partikler opfører sig som deres indfødte coronavirus modstykker for post trin. Som sådan, er de fremragende surrogater af indfødte virioner for at studere viral indrejse i værtsceller. Ved succesfuld løsning og infektion i target-cellerne, luciferase reporter bliver integreret i vært celle genom og udtrykkes. Ved hjælp af en simpel luciferase assay, kan transduced celler nemt kvantificeres. En vigtig fordel af proceduren er, at det kan udføres i biosikkerhed niveau 2 (BSL-2) faciliteter i stedet for BSL-3 faciliteter, der kræves for arbejde med højpatogen coronavirus som Mellemøsten luftvejssyndrom coronavirus (MERS-CoV) og Svær akut respiratorisk syndrom coronavirus (SARS-CoV). En anden fordel kommer fra sin alsidighed, så det kan anvendes til kuvert proteiner tilhører alle tre klasser af viral fusion proteiner, som klassen jeg influenza hemagglutinin (HA) og Ebola virus glycoprotein (GP), klasse II Semliki skov virus E1 protein, eller klasse III vesikulær stomatitis-virus G glycoprotein. En begrænsning af metoden er, at det kun kan sammenfatte virus post trin medieret af kuvert protein undersøges. For at studere andre virale livscyklus trin, er andre metoder nødvendige. Eksempler på de mange applikationer disse pseudotype partikler kan bruges i undersøgelse af vært celle modtagelighed og tropisme og test virkningerne af virus løsning hæmmere at dissekere viral entry veje anvendes.

Repræsentative resultater af smitteevne assays af SARS-CoV S og MERS-CoV pseudotyped partikler er vist i figur 1. Som forventet, for begge figur 1A og 1 b, VSV G pseudotyped positiv kontrol partikler (VSV-Gpp) gav meget høje gennemsnitlige infektivitetsniveauet i 106 107 relative luciferase enheder (RLU) spænder hhv. For SARS-CoV S pseudotyped partikler (fig. 1A) smitte af modtagelige Vero-E6 celler, en stærk gennemsnitlige smitteevne blev målt til omkring 9,8 x 104 RLU. Denne værdi er næsten 3 størrelsesordener højere end de værdier, der måles til ikke-inficerede kontrol (1,1 x 102 RLU), eller Δenv partiklerne (1.5 x 102 RLU), der ikke nærer nogen virale kuvert glykoproteiner på deres overflade. På samme måde for MERS-CoV S pseudotyped partikler (figur 1B) infektion af Huh-7 celler, en høj gennemsnitlig smitteevne blev målt til omkring 1,0 x 106 RLU. Det er næsten 4 størrelsesordener højere end de værdier, der måles til ikke-inficerede kontrol (0,8 x 102 RLU), eller Δenv partiklerne (2.0 x 102 RLU). En yderligere smitteevne analyse blev udført hvor den SARS-Spp MERS-Spp seriefremstillede fortyndet og blev brugt til at inficere Vero-E6 celler (fig. 2A). Denne analyse bekræfter, at den luciferase aktivitet målt afhænger af koncentrationen af partikler bruges til at inficere celler. For at bekræfte den rolle af angiotensin konvertering enzym 2 (ACE2) og dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), receptorer af SARS-CoV og MERS-CoV, henholdsvis i mægle vedhæftet fil og løsning af de pseudotyped partikler, brugte vi dårligt-eftergivende HEK-293T celler og transfekteret dem til at udtrykke enten ACE2 eller DPP4 (figur 2B). De transfected celler blev derefter brugt til en infektivitet assay. Denne analyse viser, at ved overekspression af ACE2 og DPP4, der er en ~ 4-log og ~ 2-log stigning for SARS-Spp og MERS-Spp infektivitet, henholdsvis, bekræfter denne receptor brugen af pseudovirions er svarer til native vira.
Eksemplerne her demonstrere vigtigheden af herunder negative (ikke-inficerede, Δenv partikler) samt positiv kontrol (VSV-Gpp) betingelser når producerer pseudotyped partikler. Positiv kontrol VSV-Gpp partikler, muligt at vurdere, om en bestemt batch af pseudotyped partikler lykkedes giver funktionelle og smitsom pseudovirions. Forventede resultater af typiske infektion af VSV-Gpp partikler i de fleste pattedyr celle linjer er i 106−107 RLU rækkevidde. Problemer med HEK-293T/17 producent celler (høj passage nummer, problemer med celle tætheder) eller dårlig Transfektion effektivitetsgevinster kan påvirke samlede pseudotyped partikel produktion og smitteevne. Negativ kontrol betingelser er desuden også vigtigt, da de gør det muligt at vurdere basislinjer RLU målinger i en bestemt cellelinje (ikke-inficerede tilstand) og ikke-specifik internalisering af partikler (Δenv infektion), som ikke er medieret af en viral kuvert protein. Ideelt, for en given type partikel pseudotyped virale kuvert protein af interesse anbefales det, at få de værdier, der er et par størrelsesordener højere end negative kontrolværdierne, som vist her i figur 1A, B. Men hvis for en given celletype et pseudotyped virusinfektion giver meget lidt smitteevne (dvs., tæt til negative kontroller sådan som i figur 2B i ikke-transfekteret N.T. betingelser) det betyder ikke nødvendigvis, at den pseudotyped partikel produktion var defekt. Det kan godt være, at den særlige cellelinie anvendes er ikke eller dårligt eftergivende til infektion. Det anbefales at kontrollere, om en given celletype forventes at være modtagelige over for infektion med virus ved at blive undersøgt. Transfecting dårligt permissive celler med plasmid(s) giver udtryk for den virale receptor(s) kan give mulighed for mere effektiv viral entry og infektion at forekomme, som vist i figur 2B, hvor efter Transfektion af ACE2 og DPP4 receptorer i målrette HEK-293T celler, der er en ~ 4- og ~ 2-log stigning i smitteevne, henholdsvis.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Plasmid/reagens</td>
			<td>Mængde</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCMV-MLVgagpol MLV gag og pol kodning plasmid</td>
			<td>300 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>pTG-Luc transfer vektor med luciferase reporter</td>
			<td>400 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>pcDNA-SARS-S, pcDNA-MERS-S eller tomme vektor</td>
			<td>300 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nedsat serum cellekulturmedium</td>
			<td>Til 50 µL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: mængder plasmider og reducerede serum celle næringssubstratet skal transfect et godt af en 6-godt plade af HEK-293T/17 celler til produktion af pseudotyped partikel. Koncentration af plasmid præparater, beregnes den krævede mængde for at nå den nødvendige mængde af plasmid DNA. Hvis mere end én brønd er transfekteret med de samme plasmider, formere mængder af nødvendige antal brønde til transfect, og inkluderer en ekstra godt i beregninger for at undgå at køre af mix på senere trin. Den samlede mængde DNA bliver transfekteret er 1 µg/godt. Plasmider kan bestilles til forfatterne.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Mængde</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transfektion reagens</td>
			<td>3 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nedsat serum cellekulturmedium</td>
			<td>47 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: antal Transfektion reagens og reducerede serum celle næringssubstratet skal transfect et godt af en 6-godt plade af HEK-293T/17 celler til produktion af pseudotyped partikel. Formere mængder af nødvendige antal brønde til transfect og omfatter ekstra brønde i beregninger for at undgå at køre af mix på senere trin. Transfektion reagens: plasmid DNA forhold er 3:1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig1.jpg"> Figur 1 : Coronavirus S-pseudotyped partikel smitteevne assays i modtagelige værtsceller ved hjælp af en murine leukæmi virus (MLV) rygraden og luciferase reporter gen. (A) SARS-CoV S pseudotyped partikel smitteevne assay i Vero-E6 celler. (B) MERS-CoV S pseudotyped partikel smitteevne assay i Huh-7 celler. For begge (A) og (B), plottede data svarer til de gennemsnitlige relative luciferase enheder fra tre uafhængige forsøg, med fejllinjer svarende til standardafvigelsen (s.d.). Data afbildes i log10 skala på y-aksen. Ni: ikke-inficerede kontrol; Δenv: infektion med pseudotyped partikler mangler virale kuvert glykoproteiner og VSV-Gpp: infektion med pseudotyped partikler forsynet med positiv kontrol VSV G kuvert glycoprotein. Andre forkortelse, der bruges, SARS-Spp: infektion med SARS-CoV S pseudotyped partikler, MERS-Spp: infektion med MERS-CoV S pseudotyped partikler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig2.jpg"> Figur 2 : Koncentration-afhængighed af CoV S-pseudovirion smitteevne og rollen som ACE2 og DPP4 receptorer i SARS-Spp og MERS-Spp indrejse. (A) koncentration-afhængighed af SARS-Spp og MERS-Spp smitteevne målt ved luciferase aktivitet assay. Pseudovirions var seriefremstillede fortyndet og bruges til at inficere Vero-E6 celler. (B) smitteevne assay af SARS-Spp og MERS-Spp i dårligt eftergivende HEK-293T target-cellerne transfekteret at udtrykke ACE2, og DPP4 receptorer, henholdsvis. Data afbildet i log10 skala på y-aksen i figur 1 fra dublerede eksperimenter med fejllinjer svarende til standardafvigelsen (s.d.). N.T.: ikke-transfekteret kontrol HEK-293T celler; ACE2: angiotensin konverterende enzym 2 (SARS-CoV receptor) og DPP4: dipeptidyl peptidase 4 (MERS-CoV receptor). Andre forkortelser er de samme som i figur 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting at JoVE.com

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

Produktion af Pseudotyped partikler at studere højpatogen coronavirus i biosikkerhed niveau 2 omgivelser

Vi præsenterer her, en protokol til at generere pseudotyped partikler i BSL-2 omgivelser indarbejde spike protein af højpatogene virus Mellemøsten respiratorisk syndrom og svær Akut respiratorisk syndrom coronavirus. Disse pseudotyped partikler indeholder et luciferase reporter gen giver mulighed for kvantificering af virus ibrugtagning vært målceller.

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Denne protokol giver forskerne mulighed for at generere pseudotype virus, der kan sikkert bruges til at studere viral indrejse begivenheder af højpatogene vira, såsom sal coronavirus og de fleste coronavirus. Denne alsidige teknik er baseret på den nemme opsætning forbigående transfection. Dette system kan også anvendes til at producere partikler pseudotyped med fusion proteiner af andre vira, ikke bare coronavirus S.For de bedste resultater er det vigtigt at overvåge celle sundhed og tæthed for transfektion samt for pseudotype virusinfektion.Demonstrere denne procedure vil være Tiffany Tang, og Lakshmi Nathan. Kandidatstuderende fra mit laboratorium. Til at begynde, omhyggeligt vaske HEK293T celler med 10 milliliter af 37 grader Celsius, forvarmt DPBS to gange.Dernæst aspirere supernatanten og fastgør celler med en milliliter 25% trypsin opløsning, der er blevet forvarmt ved 37 grader Celsius. Bortset fra inkuber kolben af celler ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid miljø i tre til fem minutter, indtil cellerne begynder at løsne. Tilføj fire milliliter komplet DMEM for at deaktivere trypsinopløsningen.Og derefter tælle celler ved hjælp af en celle optælling dias og et lys mikroskop. Cellerne fortyndes til 500.000 celler pr. milliliter med komplet DMEM. Dernæst frø to milliliter pr brønd af celleopløsningen i en 6-godt væv kultur plade.Og forsigtigt flytte pladen frem og tilbage og fra side til side for jævnt at fordele celler. Efter at have sørget for, at cellerne er jævnt fordelt inkubere pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid miljø natten over eller 16 til 18 timer. Til præforme tre plasmid cotransfection, første mix beregnede mængder af plasmider og den reducerede serum cellekultur medium i en mikro centrifuge rør.Inkuber blandingen ved stuetemperatur i fem minutter. Derefter tilsættes tre mikroliter pr. brønd af lipidbaseret transinfektionsreage til 47 mikroliter pr. brønd af det reducerede serumcellekulturmedium. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i fem minutter.Dernæst blandes der i et mikrocentrifugerør lige store mængder transfektionsreage og plasmidopløsningerne ved rør, der går op og ned flere gange. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 20 minutter. Efter natten inkubation af cellepladen, bruge en omvendt lys mikroskop til at undersøge celler for deres morfologi og tæthed.Derefter aspirere det brugte medie af celler og tilsæt forsigtigt en milliliter per brønd af det forvarmte reducerede serumcellekulturmedium til hver brønd. Dernæst tilsættes 100 mikroliter af transfektionsopløsningen til hver brønd dråbe klogt. Og inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i fire til seks timer.Ved slutningen af inkubationen tilsættes en milliliter forvarmt antibiotikafri transfektion DMEM ved 37 grader Celsius til hver brønd. Og inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i 48 timer. For at begynde pseudotype partikler indsamling bruge en omvendt lys mikroskop til eksamen cellerne for deres morfologi og generelle tilstand.Farven på mediet skal være lys pink eller lidt orange. Derefter overføres supernatanterne i de transfmittede celler til 50 milliliter koniske centrifugerør. Centrifuge rørene ved 290 gange tyngdekraften i syv minutter for at fjerne cellerester.Dernæst filter præciseret supernatant gennem en steril 0,45 micron pore størrelse filter. Lav små mængder aliquots af pseudotype virus opløsning i kryo hætteglas. Og gemme dem på negative 80 grader Celsius.For at udføre pseudotypet partikelinfektion, første eksamen celler under lys mikroskop for at bekræfte, at der er et sammenløb tæppe af celler. Derefter vaskes cellerne tre gange med 0,5 milliliter af den forvarmte DPBS ved 37 grader Celsius. Dernæst aspirere supernatanter af celler og inokuler cellerne med 200 mikroliter af den optøede pseudotypede partikelopløsning.Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i en til to timer. Efter inkubationstiden tilsættes 300 mikroliter af det forvarmte DMEMc ved 37 grader Celsius. Og inkubere de inficerede celler ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i 72 timer.Endelig aspirere supernatants af de inficerede celler. Og gå forud for luciferase reporter assay. At kvantificere infektiviteten af pseudotypede partikler første tø luciferin substrat, opbevares ved minus 80 grader Celsius, på fem tid luciferase assay lysis buffer gemt på minus 20 grader Celsius til stuetemperatur.Derefter fortyndes luciferase assay lysis buffer til en gang koncentration med sterilt vand. Dernæst tilsættes 100 mikroliter af den fortyndede buffer til hver brønd. Og inkubere ved stuetemperatur på en rocker i 15 minutter.For at udføre luciferase aktivitet måling, en brønd ad gangen, først tilføje 20 mikroliter luciferin substrat til en mikro centrifuge rør. Derefter tilsættes 10 mikroliter af lysatet til røret. Bland indholdet ved forsigtigt at svippe rørene.Og placeret røret i et luminometer enhed. Luk låget og mål lysstofværdien af røret. Post målingen af de relative lysenheder, og gå forud for dataanalyse.Infektivitetsanalyser af SARS-Spp og MERS-Spp i modtagelige værtsceller viste en stærk gennemsnitlig infektivitet sammenlignet med de forventede positive kontrolpartikler. Ikke-inficerede kontroller og de negative kontrolpartikler mangler virale kuvertglykoproteiner. Også luciferase aktivitet assays viste koncentration afhængighed af SARS-Spp og MERS-Spp infektivitet.En stigning i SARS-Spp eller MERS-Spp-infektivitet i dårligt eftergivende målceller, der er transficeret til at udtrykke ACE2-receptor af SARS-Spp eller DPP4-receptoren i MERS-Spp, bekræfter, at receptorbrug af pseudovirions svarer til brugen af nato-vira til mediering af fastgørelse og indtræden af pseudovirioner. Dobbelttjek beregninger, før dette trin udføres. Og sørg for, at alle løsninger blandes godt i løbet af trinnet.En western blot assay kan udføres på koncentrerede pseudotypede partikler til at vurdere S glycoprotein inkorporering i pseudovirions. Mens de pseudotypede partikler, der er beskrevet her, er sikrere surrogater end nato-vira, kræver de stadig to forholdsregler på sikkerhedsniveau.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Emballagen HIV-eller FIV-baserede Lentivector ekspressionskonstruktioner og transduktion af VSV-G-pseudotypet virale partikler

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til Studieinformationen Heterogeneity for Human Makrofag Differentiering og polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Sikkerhedsforanstaltninger og driftsprocedurer i et (A) BSL-4 Laboratorium: 1. biosikkerhedsniveau 4 Suit Laboratory Suite Ind-og udrejse Procedurer

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modeling Lifecycle af Ebola virus Under biosikkerhedsniveau 2 Betingelser med virus-lignende partikler indeholdende Tetracistronic minigenomer

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fri ordning for masseproduktion af Murine naturlige dræberceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Induktion af lægemiddelinduceret, autoimmun hepatitis i BALB / c-mus til undersøgelse af dets patogene mekanismer

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Højeffektiv Transfection af primær makrofager med in vitro transkriberet mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Produktion af Højtiter infektiøse influenza Pseudoskrevne partikler med kuvert glycoproteiner fra højpatogen H5N1 og aviær H7N9 vira

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

Stabilitet og struktur Bat Major Histocompatibility Complex Klasse I med heterolog β2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Dobbelt mærkning immunofluorescence ved hjælp af antistoffer fra samme art til at studere Host-Patogen interaktioner

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...