Name: production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting
Uploaded: 2019-03-01T12:30:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting at JoVE.com

Wij wensen alle leden van de Whittaker en Daniel labs voor nuttige opmerkingen bedanken. Onderzoeksfinanciering werd verstrekt door de NIH grants R21 AI111085 en R01 AI135270. T.T. erkent steun van de presidentiële Life Science Fellowship in Cornell University en de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program onder Grant nr. DGE-1650441. L.N. erkent steun van een Samuel C. Fleming familie Graduate Fellowship en de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program onder Grant nr. DGE-1650441. Dit werk wordt ook ondersteund door de National Science Foundation 1504846 (aan S.D. en G.R.W.).

1. de cel zaaien voor de productie van het Pseudotyped deeltje
Opmerking: Voer deze stap in het biosafety kabinet.
<ol><li>Door standaard cel cultuur technieken, het verkrijgen van een 80-90% confluente 75 cm2 kolf van HEK-293T/17 cellen gepasseerd in volledige Dulbecco is bewerkt Eagle's Medium (DMEM-C) die 10% (vol/vol) foetale runderserum (FBS), 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) 100 IU/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine. DMEM-T medium voorbereiden op transfections (de samenstelling is hetzelfde als DMEM-C, maar zonder antibiotica).</li>
	<li>Cellen met 10 mL van de voorverwarmde (37 ° C) Dulbecco fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) twee keer wassen. Opmerking: HEK293T/17 cellen met zorg behandelen zoals ze gemakkelijk los.</li>
	<li>De bovendrijvende substantie gecombineerd en losmaken van cellen met 1 mL van 0,25%-oplossing van de trypsine vooraf opgewarmd bij 37 ° C. Plaats de kolf van cellen bij 37 ° C, 5% CO2 incubator voor 3−5 min of totdat cellen beginnen loskoppelen. Opmerking: Vermijd cellen met trypsine voor meer dan 5 min aan het broeden als dit meestal tot het samendoen van de cel leidt.</li>
	<li>Deactiveren trypsine door toevoeging van 4 mL DMEM-C medium en het aantal cellen met behulp van een cel tellen dia en lichte Microscoop. Opmerking: Om te vermijden moetend teveel cellen tellen, eventueel een extra verdunning stap vooraf. Vergeet niet rekening houden met deze tweevoudige verdunning bij de berekening van de werkelijke celdichtheid van trypsinized cellen.</li>
	<li>Verdun cellen tot 5 x 105 cellen/mL met DMEM-C.</li>
	<li>6-well weefselkweek plaat met 2 mL cell oplossing per putje zaad en zachtjes heen en weer bewegen van de plaat en kant naar kant gelijkmatig verdelen van cellen, het vermijden van de cirkelbeweging. Opmerking: Dit is een belangrijke stap. Gelijkmatig verdeelde cellen zal ervoor zorgen dat de cellen niet doen klomp in het centrum van putten. Op zijn beurt, zal hierdoor goede transfectie efficiëntie en pseudotyped deeltje productie.</li>
	<li>Incubeer de plaat 's nachts (16-18 h) in een 37 ° C, 5% CO2 cel cultuur incubator.</li>
</ol>2. drie-plasmide co transfectie
Opmerking: Voer deze stap in het biosafety kabinet.
<ol><li>Observeren van cellen onder een omgekeerde lichte Microscoop te controleren voor de morfologie van de cel en de dichtheid. Opmerking: Idealiter moet de celdichtheid in de confluency bereik van 40-60%. Het is van cruciaal belang dat cellen niet te zijn heuvels (80−90% heuvels) noch ook dun verspreid (20−30% heuvels) in elk putje. Een celdichtheid van 40−60% confluentie zorgt voor goede pseudotyped deeltjes productie.</li>
	<li>
Plasmiden mix
	<ol>
<li>Bereken de plasmide mix voor elke envelop glycoproteïne na de hoeveelheden voor een goed van een plaat van de 6-well vermeld in tabel 1. Vermenigvuldigen van hoeveelheden, als transfecting van verschillende putten en bevatten een extra goed Voorkom opraakt van mix. Opmerking: Samen met de SARS-CoV S en MERS-CoV S codering van plasmiden, lege vectorbestrijding te omvatten voor de generatie van negatieve controle deeltjes die geen virale envelop-glycoproteïnes (Δenv deeltjes) samen met een positieve controle glycoproteïne zoals vesiculaire stomatitis virus (VSV) G glycoproteïne die erom bekend te krachtig infecteren een zeer breed scala van cellen (VSV-BPP). Plasmiden zijn beschikbaar op aanvraag.</li>
		<li>Meng berekende hoeveelheid plasmiden en verminderde serum cel kweekmedium (Zie Tabel van materialen) in een microcentrifuge buis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lipide gebaseerde transfectiereagens mix (Zie Tabel van materialen)<ol>
<li>Berekenen van de volumes voor de transfectie reagens mix van de hoeveelheden die in tabel 2 aangegeven voor een goed (1:3 verhouding van de transfectie, vermenigvuldigen hoeveelheden zo nodig). Extra wells Voorkom opraakt van transfectie reagens mix opnemen.</li>
		<li>Meng berekende hoeveelheid lipide gebaseerde transfectiereagens (3 µL per putje) en verlaagde serum cel kweekmedium (47 µL per putje) in een microcentrifuge buis, ervoor zorgend om de transfectiereagens in het kweekmedium van verminderde serum cel en niet de andere manier toevoegen rond.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer beide mixen (voor één goed: 50 µL van plasmiden, meng en 50 µL van lipide gebaseerde transfectiereagens mix) afzonderlijk gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>De inhoud van de transfectie reagens mix toevoegen aan de mix van plasmiden op een 1:1 verhouding (voor 1 goed: 50 µL van elke mix)</li>
	<li>Het uitvoeren van grondige omhoog / omlaag pipetteren van de resulterende mix.</li>
	<li>Laat het mengsel gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>Het gebruikte medium van cellen gecombineerd.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 1 mL voorverwarmde (37 ° C) verminderde serum cel kweekmedium per putje.</li>
	<li>Toevoegen van dropwise 100 µL van transfectie mix aan elk putje. Opmerking: Oefenen zorg bij het toevoegen van de transfectie mix aan putjes van HEK-293T zoals ze gemakkelijk los.</li>
	<li>Incubeer de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 cel cultuur incubator voor 4 – 6 h.</li>
	<li>Voeg 1 mL per putje van voorverwarmde (37 ° C) DMEM-T medium, die geen antibiotica bevat Opmerking: Dit is een belangrijke stap. Transfectie reagentia vergroten van de permeabiliteit van de cel en verhogen van de gevoeligheid voor antibiotica. Goede transfectie efficiëntie en pseudotyped deeltje productie te garanderen, is het belangrijk om te voorkomen dat met behulp van cel kweekmedium dat antibiotica</li>
	<li>Incubeer de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 cel cultuur incubator voor 48 uur.</li>
</ol>3. pseudotyped deeltjes collectie
Opmerking: Voer deze stap in het biosafety kabinet.
<ol><li>Observeren van cellen onder omgekeerde lichte Microscoop om te controleren of cel morfologie en algemene conditie. Controleer ook de kleur van het medium dat licht moet roze/licht oranje. Opmerking: Dit is een belangrijke stap. Als er teveel dood van de cel die is gekoppeld aan de transfectie of de middellange kleur draaide oranje/geel (zure pH), zal dit meestal worden geassocieerd met lagere rendementen in besmettelijke pseudotyped deeltjes</li>
	<li>Supernatant van transfected cellen omzetten in 50 mL conische centrifuge buizen.</li>
	<li>Centrifugeer buizen bij 290 x g gedurende 7 min te verwijderen cel puin.</li>
	<li>Filtreer geklaarde supernatant door een steriele 0,45 µm porie-grootte-filter.</li>
	<li>Maken van kleine hoeveelheden aliquots (bijvoorbeeld., 500 µL of 1 mL) van pseudotyped virus oplossing in cryovials.</li>
	<li>Winkel bij-80 ° C. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Pseudotyped deeltjes zijn stabiel op-80 ° C voor vele maanden maar eenmaal ontdooid, te voorkomen dat opnieuw bevriezen ze als ze infectiviteit verliezen zal</li>
</ol>4. pseudotyped Particle infectie van gevoelige cellen
Opmerking: Voer deze stap in het biosafety kabinet.
<ol><li>
Cel zaaien van gevoelige cellen in 24-well plaat
	<ol>
<li>Verkrijgen door standaard cel cultuur technieken 80−90% confluente 75 cm2 kolf van gevoelige cellen: Vero-E6 cellen voor SARS-CoV pseudotyped deeltjes (SARS-Spp) en Huh-7 cellen voor MERS-CoV S pseudotyped deeltjes (MERS-Spp). Opmerking: Om te bevestigen dat of de pseudotyped deeltjes die zijn geproduceerd besmettelijk zijn, is het belangrijk zorgvuldig kiezen van een passende gevoelig cellijn voor pseudovirion infectiviteit testen. Slecht tolerante cuvetten zal leiden tot lage infectiviteit.</li>
		<li>Wassen cellen tweemaal met 10 mL voorverwarmde (37 ° C) DPBS.</li>
		<li>De bovendrijvende substantie gecombineerd en losmaken van cellen met 1 mL van 0,25%-oplossing van de trypsine vooraf opgewarmd bij 37 ° C. Plaats de kolf van cellen bij 37 ° C, 5% CO2 incubator voor 3−5 min of totdat cellen beginnen loskoppelen. Opmerking: Vermijd het broeden van cellen met trypsine voor meer dan 5 minuten omdat dit meestal tot het samendoen van de cel leidt. He-7 cellen zijn vooral gevoelig voor dit effect.</li>
		<li>Deactiveren trypsine door toe te voegen DMEM-C medium en het aantal cellen met behulp van een cel tellen dia en lichte Microscoop.</li>
		<li>Verdun cellen tot 5 x 105 cellen/mL met DMEM-C.</li>
		<li>Zaad putjes van een 24-well plaat met 0,5 mL cell oplossing per putje en zachtjes heen en weer bewegen van de plaat en kant naar kant cellen, het vermijden van cirkelvormige beweging gelijkmatig te verdelen Opmerking: Dit is een belangrijke stap. Gelijkmatig verdeelde cellen zal ervoor zorgen dat de cellen niet doen klomp in het centrum van putten. Op zijn beurt, zal hierdoor goede infectiviteit testen. Voor elke pseudotyped deeltje (SARS-Spp, MERS-Spp) en conditie, kunt u het drie putten voorbereiden door drie experimentele replicatieonderzoeken. Opnemen van putten voor de niet-besmette (N.I.), de lege vector Δenv deeltjes en de positieve controle deeltjes zoals VSV-Gpp</li>
		<li>Incubeer de plaat 's nachts (16−18 h) in een 37 ° C, 5% CO2 cel cultuur incubator</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pseudotyped deeltje infectie
	<ol>
<li>Cellen onder lichte Microscoop observeren en visueel bevestigen dat er een confluente tapijt van cellen.</li>
		<li>Cryovials van pseudotyped virus te ontdooien op ijs te brengen.</li>
		<li>Wash cellen drie keer met 0,5 mL pre opgewarmd (37 ° C) DPBS Opmerking: Dit is een belangrijke stap. Cellen die niet goed gespoeld voorafgaand aan de infectie meestal leiden tot slechte infectiviteit uitlezingen</li>
		<li>Gecombineerd het supernatant van cellen.</li>
		<li>Inoculeer cellen met 200 µL van ontdooide pseudotyped deeltje oplossing.</li>
		<li>Incubeer de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 cel cultuur incubator voor 1−2 h.</li>
		<li>Voeg 300 µL voorverwarmde (37 ° c) DMEM-C medium.</li>
		<li>Incubeer de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 cel cultuur incubator voor 72 uur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. infectiviteit kwantificering door Luciferase Assay uitlezing
Opmerking: Eerste stappen in het biosafety kabinet.
<ol><li>Dooi luciferine substraat (opgeslagen bij-80 ° C) en 5 x luciferase assay lysis-buffermengsel (opgeslagen bij-20 ° C) totdat zij bereiken kamertemperatuur.</li>
	<li>Verdun luciferase assay lysis-buffermengsel naar 1 x met steriel water.</li>
	<li>Gecombineerd supernatant van cellen geïnfecteerd met pseudotyped deeltjes.</li>
	<li>Voeg 100 µL van 1 x luciferase assay lysis-buffermengsel aan elk putje.</li>
	<li>Plaats de plaat op een rocker en incubeer gedurende 15 min met rockende bij kamertemperatuur (vanaf dat moment die de plaat kan buiten een kabinet bioveiligheid worden behandeld).</li>
	<li>Microcentrifuge buizen voorbereiden door elk putje door 20 µL van luciferine substraat toe te voegen in elke buis.</li>
	<li>Inschakelen van de luminometer.</li>
	<li>Luciferase activiteitsmeting een goed per keer uitvoeren door de overdracht van 10 µL van lysate aan één buis met 20 µL van luciferine substraat.</li>
	<li>Flick de tube zachtjes om mix van inhoud, maar voorkomen dat de vloeistof op muren van buis verdringt.</li>
	<li>Plaats de buis in apparaat en deksel dicht doet.</li>
	<li>Meet de waarde van de luminescentie van de buis met behulp van de luminometer.</li>
	<li>Meting van de relatieve licht van het apparaat opnemen.</li>
	<li>Herhaal stap 5.8 – 5.12 totdat alle putjes worden geanalyseerd. Opmerking: Met de juiste apparatuur zoals een plaat luminometer lezen, kan dit proces automatisch worden uitgevoerd. De bepaling moet worden geschaald naar de plaat-indeling (bijvoorbeeld, 96-wells-plaat formaat).</li>
</ol>6. de gegevensanalyse
<ol><li>
Berekening en plotten van relatieve luciferase eenheden gemiddelden en standaardafwijkingen
	<ol>
<li>Met een grafiek plotten software kunnen berekenen luciferase assay meting gemiddelden en standaardafwijkingen van experimentele en biologische repliceert.</li>
		<li>Gegevens uitzetten als staafdiagram met standaarddeviaties. Opmerking: Bij het uitvoeren van statistische analyses op de gegevens, zorg ervoor dat ten minste drie replicaat-biologische organismen in datasets.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een methode om efficiënt produceren pseudotyped deeltjes, rekening houdend met de S-proteïne van risico groep 3 coronaviruses, SARS-CoV en MERS-CoV, in een omgeving van BSL-2. Deze deeltjes, die een luciferase verslaggever gen nemen, kunnen we gemakkelijk kwantificeren coronavirus ingang S-gemedieerde gebeurtenissen door een relatief eenvoudige luciferase assay48,49,50,51. In infectiviteit assays tolerante cuvetten, bevestigen wij dat de activiteit van de luciferase gemeten afhankelijk van de concentratie van deeltjes is. Daarnaast voorziet het ACE2 en DPP4 receptor transfectie efficiënter vermelding in slecht tolerante cellen lijnen, zoals HEK-293T cellen. De methode is zeer aan te passen aan andere virale envelop-glycoproteïnes en is gebruikt uitgebreid48,49,50,51,52,53, 55,56,,57,58,59, vaak als aanvulling op andere testen zoals biochemische analysen of native virusinfecties.
Het protocol dat wij hier beschrijven is gebaseerd op het retrovirus MLV waarin een luciferase verslaggever. Het is echter belangrijk te benadrukken dat er een zeer breed scala van andere pseudotyping-systemen die zijn met succes ontwikkeld voor verpakking coronavirus S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 en andere virale envelop glycoproteïnen10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. sommige van deze andere systemen zijn gebaseerd op de gebruikte MLV retrovirale kern7,8,9,10,11,,,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, of op basis van de gebruikte lentivirale HIV-1 pseudotyping systeem met behulp van verschillende strategieën23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, of met het rhabdovirus vesiculaire stomatitis virus (VSV) als kern, die het mogelijk maakt om op te nemen van een grote verscheidenheid van envelop-glycoproteïnes, en opnieuw met verschillende werkzaam strategieën37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. Daarnaast andere verslaggevers zoals fluorescerende eiwitten zoals GFP11,13 en RFP36, of enzymen dan luciferase zoals β-galactosidase16,17 en uitgescheiden alkalische fosfatase (SEAP)42 zijn met succes tewerkgesteld voor metingen. Bovendien in de assay gepresenteerd in dit protocol, werd een voorbijgaande transfectie gebruikt om uit te drukken de MLV en CoV S genen en proteïnen. Er zijn echter andere strategieën voor expressie, zoals generatie stabiele cellijnen voor productie van pseudotyped virussen7,14. Zoals elk van deze systemen hebben hun voor- en nadelen, is het belangrijk om te overwegen de volgende belangrijke parameters bij de beslissing welk beste pseudotyping-systeem van een onderzoeker past: pseudovirion core (MLV, HIV-1, VSV of anderen), hoe selectieve een bijzondere pseudotyping kern is een glycoproteïne specifieke virale envelop, verslaggever voor assay uitlezing (GFP, luciferase, SEAP of andere) en de strategie van de transfectie (aantal plasmiden die betrokken zijn bij co transfectie, voorbijgaande te integreren transfectie of generatie van stabiele cellijnen).
Er zijn een aantal essentiële stappen in de methode die belangrijk zijn om te benadrukken. Celdichtheid, met name voor de cellijn van HEK-293T/17 producent is een kritische factor bij het waarborgen van de succesvolle transfectie. De celdichtheid van een in het bereik van 40-60% confluentie bleek te zijn optimaal. Hogere dichtheden meestal leiden tot lage transfectie efficiëntie en lage deeltje productie. Ook is het belangrijk om te houden in het achterhoofd dat HEK-293T/17 cellen minder aanhangend dan andere cellijnen zijn. Bij de behandeling van hen om te voorkomen dat ze onnodig te ontkoppelen, moet voorzichtigheid worden betracht. Een optie is voor de behandeling van de cel cultuur kunststofoppervlakken met poly-D-lysine ter verbetering van de hechting. Hogere cel passage leidt bovendien vaak arme transfectie tarieven. Na de transfectiereagens aan HEK-293T/17 cellen toe te voegen, is het ook belangrijk om te onthouden dat verhoogt de permeabiliteit van de cel. Dit is de reden waarom op dit moment is het het beste om te voorkomen dat gebruik van middellange met antibiotica, aangezien zij de cytotoxiciteit kunnen verhogen. Controleer voor het verzamelen van pseudotyped deeltjes, de kleur van transfected HEK-293T/17 cel supernatant. Meestal neemt de celkleur kweekmedium na 48u van transfectie, een oranje-roze tint. Geel uitdrukkingsloos medium meestal vertaalt naar arme pseudotyped deeltjes opbrengsten en is vaak het gevolg van problemen met cel zaaien dichtheid of hoge passage nummer.
In dit protocol wordt pseudotyped deeltje productie uitgevoerd in een 6-well plaat-indeling. Om verhogen de hoeveelheid geproduceerde deeltjes, diverse putjes van de plaat van een 6-well kunnen zijn transfected met dezelfde plasmiden mix en het supernatant kunnen samen worden gebundeld. Het zwembad kan vervolgens worden verduidelijkt, gefilterde en aliquoted. U kunt ook op de schaal van de productie omhoog, andere soorten schepen (bijvoorbeeld 25 of 75 cm2 flacons) kunnen worden gebruikt. In dit geval moeten transfectie voorwaarden worden opgeschaald dienovereenkomstig. In dit protocol, is de bepaling van de infectiviteit uitgevoerd met behulp van een 24-well plaat formaat en een luminometer waarmee alleen metingen één buis tegelijk. Voor hoge-doorvoer screenings zijn andere formaten ook mogelijk, zoals de indeling van de 96-wells-plaat en een plaat lezer luminometer. Volumes en reagentia voor de luciferase assay moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Van pseudotyped deeltjes in cryovials bij-80 ° C automatisch bijgehouden hoe vaak hun stabiliteit maandenlang zonder merkbare afname van de infectiviteit. Het is niet aanbevolen om onderwerpen te bevriezen-ontdooien cycli zoals dit hun infectiviteit in de tijd afnemen zal. Het is dus best om hen te slaan in kleine porties zoals 0,5 – 1 mL en ze ontdooien voordat een infectie.
De methode die hier gepresenteerd heeft verscheidene beperkingen. Belangrijk is het feit dat pseudotyped deeltjes alleen virale post gebeurtenissen recapituleren. Voor het analyseren van andere stappen in de infectieuze levenscyclus, zijn andere testen nodig. Bovendien, zoals MLV deeltjes bud op het plasma-membraan, het is belangrijk te bedenken er rekening mee dat de envelop glycoproteïne bestudeerd behoeften om ook verkeer naar het plasmamembraan voor inbouw in pseudovirions tijdens de productie. Als zodanig, is het belangrijk om te weten waar in de cel een bepaalde virale envelop glycoproteïne wordt uitgedrukt in Transfectie voorwaarden, zoals door het visualiseren van subcellular localisatie met een immunofluorescentietest test en/of door te controleren voor retentie signalen binnen het eiwit. Ook, terwijl het protocol worden de stappen beschreven voor het produceren en testen van infectiviteit, het doet niet in detail hoe meet opneming van virale envelop-glycoproteïnes pseudotyped deeltjes. Een methode is om te voeren westelijke vlek testen op geconcentreerde oplossingen van deeltjes, als eerder beschreven50,,51 voor MERS-CoV S inbouw. In deze testen, wordt de S envelop glycoproteïne van MERS-CoV onderzocht samen met de Eiwitmantel (p30) proteïne van MLV, waarmee ons te normaliseren van de opneming van het S-eiwit deeltjes. Andere voorbeelden van deze gehaltebepalingen analyseren van virale envelop glycoproteïne opneming in pseudovirions zijn uitgevoerd voor SARS-CoV S moeten worden opgenomen in een HIV-1 lentivirale pseudovirion systeem32 , Ebola glycoproteïne (GP) in een ander MLV pseudotyped particle systeem17, en influenza hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) in VSV pseudovirions38. Een recente ontwikkeling in het karakteriseren van pseudotyped deeltje productie is het gebruik van innovatieve imaging-apparaten zoals Nanosight: kunnen wij direct visualiseren, kwantificeren en virale deeltjes50de grootte. Het apparaat geeft gedetailleerde informatie over de totale productie van de deeltjes; het is echter belangrijk om te houden in het achterhoofd dat het levert geen informatie over envelop glycoproteïne opneming. Een toekomstige koers voor de toepassing van deze veelzijdige pseudovirion deeltjes is om te analyseren van individuele virale fusion gebeurtenissen met behulp van één deeltje bijhouden, microfluidics en totale interne reflectie fluorescentie microscopie60,61 ,62. Dergelijke benaderingen werden met succes toegepast op influenzavirus, evenals feline coronavirus deeltjes en influenza HA - en NA-pseudotyped VSV-gebaseerde pseudovirions63. De implementatie van dergelijke technieken toegepast op coronavirus S-pseudotyped MLV gebaseerde deeltjes wordt momenteel ontwikkeld.

Cel hostingingang vormt de eerste stappen van de besmettelijke virale levenscyclus. Voor envelop-virussen hierbij binding aan een enkelvoudige host cel receptor of verschillende receptoren, gevolgd door de fusie van virale of cellulaire membranen. Deze essentiële functies worden uitgevoerd door virale envelop glycoproteïnen1,2. Het coronavirus envelop glycoproteïne heet het eiwit spike (S) en is een lid van de klasse ik virale fusion eiwitten2,3,4,5,6. Bestuderen van virale envelop-glycoproteïnes is van cruciaal belang voor het begrijpen van veel belangrijke kenmerken van een bepaald virus, zoals: lifecycle inleiding, zijn gastheer en cellulaire tropisme, interspecies transmissie, pathogenese van virale, evenals gastheer cel vermelding trajecten. Virale pseudotyped deeltjes, ook genaamd pseudovirions, zijn krachtige hulpmiddelen waarmee ons te gemakkelijk het bestuderen van de functie van virale fusie-eiwitten. Pseudotyped deeltjes of pseudovirions zijn chimeer virionen die bestaan uit een surrogaat virale kern met een heteroloog virale envelop eiwitten aan hun oppervlak. Het hoofddoel van het protocol is te laten zien hoe verkrijgen coronavirus spike pseudotyped deeltjes die zijn gebaseerd op de kern van een lymfkliertest leukemie virus (MLV) en bevatten een luciferase verslaggever gen. Als voorbeeld, de methode voor de productie van pseudotyped deeltjes met de eiwitten van de piek van de hoogpathogene ernstig acuut respiratoir syndroom (SARS) en het Midden-Oosten luchtwegziektesyndroom (MERS) coronaviruses worden gepresenteerd. Het protocol beschrijft de transfectie procedure betrokken zijn, hoe te infecteren gevoelig target cellen, en kwantificering van de infectiviteit door luciferase assay.
Aangezien de stappen van de vermelding van de pseudovirions worden beheerst door het coronavirus S op hun oppervlak, invoeren ze cellen op een soortgelijke manier aan inheemse tegenhangers. Als zodanig zijn zij uitstekende surrogaten van functionele infectiviteit tests. Pseudotyped deeltjes zijn meestal afgeleid van ouderlijke model virussen zoals retrovirussen (MLV7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 en de lentivirus humaan immunodeficiëntie virus-HIV23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) of rhabdoviruses (virus van de vesiculaire stomatitis — VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). Wanneer gebruikt in pseudotyping, de ouderlijke virussen genoom worden gewijzigd om te verwijderen van essentiële genen, waardoor ze defect voor het uitvoeren van een volledige replicatiecyclus. Deze functie kunnen ze worden gebruikt in de tussenliggende bioveiligheid niveau voorzieningen (BSL-2) en is een belangrijk voordeel boven het gebruik van hoogpathogene inheemse virussen die vereisen hogere bioveiligheid voorzieningen (BSL-3, BSL-4, die niet zo gemakkelijk beschikbaar) wanneer virus in post orkestdirectie. Hier, de S-eiwitten van risico groep 3 ziekteverwekkers SARS-CoV en MERS-CoV worden gebruikt als voorbeelden van virale envelop eiwitten wordt ingebed in MLV pseudotyped deeltjes, het genereren van SARS-CoV S en MERS-CoV S pseudovirions (SARS-Spp en MERS-Spp, respectievelijk). Deze pseudovirions zijn met succes gebruikt in studies gericht op post gebeurtenissen van deze virussen48,49,50,51. Een ander voordeel is dat de hier beschreven techniek niet beperkt tot pseudotyping coronavirus S eiwitten is: het is zeer flexibel en kan worden gebruikt voor het opnemen van vertegenwoordigers van alle drie de klassen van virale fusie-eiwitten. Voorbeelden zijn influenza hemagglutinine (HA, klasse I)52, Ebola virus glycoproteïne (GP klasse I), E1 eiwit van het alphavirus Semliki Forest virus (SFV, klasse II), en VSV glycoproteïne (G, klasse III)53. Bovendien meer dan één soort virale glycoproteïne kunnen mede opgenomen in een pseudotyped deeltje, zoals in het geval van influenza HA- en NA - pseudotyped deeltjes51.
Gebaseerd op het werk uitgevoerd door Bartosch et al.20, dit protocol beschrijft de generatie van MLV pseudotyped deeltjes met een drie-plasmide co transfectie-strategie met behulp van de grote schaal beschikbaar en transfectie-competent HEK-293T cel lijn 54. de eerste plasmide codeert de MLV kern genen gag en pol , maar mist het MLV envelop env gen. De tweede plasmide is een vector van de overdracht wordt gecodeerd een firefly luciferase verslaggever gen, een MLV Ψ-RNA verpakking signaal, samen met 5'- en de 3'-begeleidende MLV lang terminal herhalen (LTR) regio's. De derde plasmide codeert de fusieproteïne van belang, in dit geval ofwel de SARS-CoV S of MERS-CoV S proteïne. Op co transfectie van de drie plasmiden, met behulp van een transfectiereagens, krijgen virale RNA en eiwitten uitgedrukt binnen transfected cellen waardoor generatie van pseudotyped deeltjes. Omdat de MLV wordt gebruikt als de ruggengraat van de pseudovirion, dit gebeurt op het plasma-membraan: de RNAs met de luciferase gene verslaggever en verpakking signaal krijgen ingekapseld in de ontluikende deeltjes die ook plasmamembraan-uitgedrukt coronavirus spike nemen eiwitten. De deeltjes die bud uit uit cellen bevatten het coronavirus S eiwitten aan hun oppervlak en worden geoogst voor gebruik in infectiviteit testen. Omdat pseudotyped deeltjes haven het coronavirus S eiwit en niet de MLV envelop eiwitten, wanneer gebruikt voor het infecteren van cellen, gedragen ze zich als hun tegenhangers van de inheemse coronavirus voor post stappen. De virale RNA met de verslaggever luciferase en begeleidende liter is dan vrijgegeven binnen de cel en de retrovirale polymerase-activiteiten zijn omgekeerde transcriptie in DNA en integratie in het genoom van de cel host inschakelen. Kwantificering van de infectiviteit van virale pseudotyped deeltjes in de geïnfecteerde cellen wordt vervolgens uitgevoerd met een eenvoudige luciferase activiteit test. Aangezien de opeenvolging van DNA die wordt geïntegreerd in het genoom van de cel host alleen het gen luciferase en geen van de MLV of coronavirus eiwit-encoding genen bevat, zijn ze inherent veiliger te gebruiken dan replicatie-bevoegde inheemse virussen.
Naast het feit dat veiliger surrogaten en hoogst aanpasbaar dat opneming van verschillende soorten envelop-glycoproteïnes, de pseudotyped deeltjes die hier beschreven zijn ook zeer veelzijdig en kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van vele aspecten van virus binnenkomst. Dit omvat, maar is niet beperkt tot: testen van de ontvangende cel vatbaarheid voor infectie met een macrovirus analyseren van de trajecten van de cellulaire vermelding een omhuld-virus gebruikt, bestudeert de effecten van farmacologische remmers en drug screenings, uitvoeren van neutralisatie antilichaam testen, karakteriseren van cel hostingingang van envelop-virussen die niet kunnen worden gekweekt, en het genereren van virale vectoren voor de levering van het gen, stabiele cellulaire expressie van genen van belang, of gene zwijgen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1213px;" width="1212">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:419px;">Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells&#160;</td>
			<td style="width:287px;">ATCC</td>
			<td style="width:155px;">CRL-11268</td>
			<td style="width:353px;">Clone 17 cells are highly competent for transfection.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human hepatic Huh-7 cells&#160;</td>
			<td>Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition</td>
			<td>JCRB0403</td>
			<td style="width:353px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted light microscope with 10 &#215; objective&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#39;s medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>1614071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethanesulphonic acid (HEPES)&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#215; penicillin-streptomycin (PS) solution</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 &#215; solution&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:419px;">Cell counting slides with grids&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Kova</td>
			<td style="width:155px;">87144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-minimal essential medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45 &#181;m pore-size sterile filter&#160;</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10 mL syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5 &#215; luciferase assay lysis buffer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luciferin, substrate for luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile water&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E476-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GloMax 20/20 luminometer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>2030-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting

Het protocol is gericht op het genereren van coronavirus (CoV) spike (S) fusieproteïne pseudotyped deeltjes met een lymfkliertest leukemie virus (MLV) kern en luciferase verslaggever, met behulp van een eenvoudige transfectie procedure van de wijd-beschikbaar HEK-293T cel lijn. Eenmaal gevormd en uit producent cellen vrijkomen, nemen deze pseudovirions een luciferase verslaggever gen. Aangezien ze alleen bevatten de heterologe coronavirus spike eiwit op hun oppervlak, de deeltjes zich gedragen als hun tegenhangers van de inheemse coronavirus voor post stappen. Als zodanig zijn zij uitstekende surrogates van inheemse virionen voor het bestuderen van virale indienststelling gastheer cellen. Na het succesvolle entree en infectie in de doelcellen, de verslaggever luciferase wordt geïntegreerd in het genoom van de cel host en wordt uitgedrukt. Met behulp van een eenvoudige luciferase assay, kunnen getransduceerde cellen worden gemakkelijk gekwantificeerd. Een belangrijk voordeel van de procedure is dat het kan worden uitgevoerd in de bioveiligheid niveau 2 (BSL-2) voorzieningen in plaats van BSL-3 installaties die nodig zijn voor het werken met hoogpathogene coronaviruses zoals Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) en ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus (SARS-CoV). Een ander voordeel vandaan zijn veelzijdigheid als het kan worden toegepast op de envelop eiwitten die behoren tot alle drie de klassen van virale fusion eiwitten, zoals de klasse ik griep hemagglutinine (HA) en Ebola virus glycoproteïne (GP), de klasse II Semliki forest virus E1 proteïne, of de klasse III vesiculaire stomatitis virus G glycoproteïne. Een beperking van de methodiek is dat het alleen kan recapituleren virus post stappen gemedieerd door de envelop eiwit onderzocht. Voor de studie van andere virale levenscyclus stappen, zijn andere methoden nodig. Voorbeelden van de vele toepassingen die deze pseudotype deeltjes kunnen worden gebruikt in onderzoek naar host cel gevoeligheid en tropisme en testen van de effecten van virus vermelding remmers te ontleden virale vermelding trajecten gebruikt.

Representatieve resultaten van tests van de infectiviteit van SARS-CoV S en MERS-CoV S pseudotyped deeltjes zijn afgebeeld in Figuur 1. Zoals verwacht, voor beide Figuur 1A en 1B, de VSV-G pseudotyped positieve controle deeltjes (VSV-BPP) gaf zeer hoge gemiddelde infectiviteit in de 106 tot 107 relatieve luciferase eenheden (RLU) variëren respectievelijk. Voor SARS-CoV S pseudotyped deeltjes (Figuur 1A) infectie van gevoelige Vero-E6 cellen, een sterke gemiddelde infectiviteit werd gemeten op ongeveer 9,8 x 104 RLU. Deze waarde is bijna 3 ordes van grootte hoger dan de waarde die is gemeten voor de controle van niet-besmette (1.1 x 102 RLU), of de Δenv deeltjes (1,5 x 102 RLU), die doen niet haven virale envelop-glycoproteïnes aan hun oppervlak. Ook voor MERS-CoV S pseudotyped deeltjes (Figuur 1B) infectie van Huh-7 cellen, een hoge gemiddelde infectiviteit werd gemeten op ongeveer 1,0 x 106 RLU. Dit is bijna 4 ordes van grootte hoger dan de waarde die is gemeten voor de controle van niet-besmette (0.8 x 102 RLU), of de Δenv deeltjes (2.0 x 102 RLU). Een extra infectiviteit assay werd uitgevoerd waarin de SARS-Spp en MERS-Spp waren serieel verdund en gebruikt voor het infecteren van Vero-E6 cellen(Figuur 2). Deze bepaling bevestigt dat de activiteit van de luciferase gemeten afhankelijk van de concentratie van de deeltjes gebruikt is om cellen te infecteren. Om te bevestigen de rol van angiotensine converting enzyme 2 (ACE2) en kunnen peptidase 4 (DPP4), de receptoren van SARS-CoV en MERS-CoV, respectievelijk in het bemiddelen van gehechtheid en vermelding van de pseudotyped deeltjes, gebruikten we slecht-tolerante HEK-293T cellen en hen om uit te drukken van ACE2 of DPP4 transfected (Figuur 2B). Transfected cellen werden vervolgens gebruikt voor een infectiviteit assay. Deze analyse blijkt dat bij overexpressie van ACE2 en DPP4, er een verhoging van het ~ 4-log en ~ 2-log voor SARS-Spp en MERS-Spp infectiviteit, respectievelijk is voor het bevestigen van deze receptor-gebruik van pseudovirions is vergelijkbaar met die van de inheemse virussen.
De hier getoonde voorbeelden tonen het belang van met inbegrip van negatieve (niet-besmette, Δenv deeltjes) en de positieve controle (VSV-BPP) voorwaarden bij de productie van pseudotyped deeltjes. Inderdaad, de positieve controle VSV-Gpp-deeltjes ons in staat stellen te beoordelen of een bepaalde partij van pseudotyped deeltjes succesvol was in functionele en infectieuse pseudovirions oplevert. Verwachte resultaten van typische infectie door VSV-Gpp deeltjes in meest zoogdieren cel regels bevinden zich in het bereik 106−107 RLU. Problemen met HEK-293T/17 producent cellen (hoge passage nummer, problemen met de dichtheden van de cel) of slechte transfectie efficiëntie kunnen invloed hebben op de algehele pseudotyped deeltje productie en infectiviteit. Bovendien, de voorwaarden van de negatieve controle zijn ook belangrijk omdat ze ons in staat te beoordelen van de basislijnen van RLU metingen in een bepaalde cellijn (niet-besmette voorwaarde) en niet-specifieke internalisering van deeltjes (Δenv infectie), die is niet gemedieerde door een virale envelop eiwitten. Ideaal, voor een bepaald type van deeltje pseudotyped met een virale envelop proteïne van belang, is het aanbevolen om het verkrijgen van waarden die een paar ordes van grootte hoger zijn dan de negatieve controlewaarden, zoals hier afgebeeld in Figuur 1A, B. Echter, als voor een bepaald celtype een pseudotyped virusinfectie weinig infectiviteit geeft (dwz, sluiten tot negatieve controles zoals in Figuur 2B in niet-transfected N.T. voorwaarden) het betekent niet noodzakelijkerwijs dat de pseudotyped deeltje productie was defect. Het kan goed zijn dat de gebruikte bepaalde cel-lijn is niet of slecht tolerante tot infectie. Het is raadzaam om te controleren of een bepaald celtype naar verwachting zijn gevoelig voor infectie door het virus worden onderzocht. Transfecting slecht tolerante cellen plasmid(s) tot uitdrukking te brengen die de virale receptor(s) kunnen efficiënter virale ingang en infectie optreden, als afgebeeld in Figuur 2B, waar bij de transfectie van ACE2 en DPP4 receptoren in target HEK-293T cellen, er is een ~ 4- en ~ 2-log toename infectiviteit, respectievelijk.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Plasmide/reagens</td>
			<td>Hoeveelheid</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCMV-MLVgagpol MLV gag en pol codering plasmide</td>
			<td>300 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>pTG-Luc overdracht vector met luciferase verslaggever</td>
			<td>400 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>pcDNA-SARS-S, pcDNA-MERS-S of lege vector</td>
			<td>300 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verminderde serum cel kweekmedium</td>
			<td>Tot 50 µL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: hoeveelheden plasmiden en verminderde serum cel kweekmedium moet één putje van een 6-well plaat van HEK-293T/17 cellen voor pseudotyped deeltjes productie transfect. Bereken uit de concentratie van plasmide preparaten, het vereiste volume te bereiken van de vereiste hoeveelheid plasmide DNA. Als meer dan één goed is transfected met de dezelfde plasmiden, vermenigvuldig volumes door vereiste aantal putten te transfect, en een extra goed opnemen in berekeningen te vermijden voor mix in latere stappen opraakt. De totale hoeveelheid DNA wordt transfected is 1 µg per putje. Plasmiden zijn beschikbaar op verzoek aan auteurs.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Hoeveelheid</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transfectiereagens</td>
			<td>3 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verminderde serum cel kweekmedium</td>
			<td>47 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: hoeveelheden transfectiereagens en verminderde serum cel kweekmedium moet één putje van een 6-well plaat van HEK-293T/17 cellen voor pseudotyped deeltjes productie transfect. Vermenigvuldigen volumes door vereiste aantal putten te transfect en extra wells in berekeningen te vermijden voor mix in latere stappen opraakt. De transfectiereagens: plasmide DNA verhouding gebruikt is 3:1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig1.jpg"> Figuur 1 : Coronavirus S-pseudotyped deeltje infectiviteit testen in gevoelig gastheer cellen met behulp van een lymfkliertest leukemie virus (MLV) backbone en luciferase verslaggever gen. (A) SARS-CoV S pseudotyped deeltje infectiviteit assay in Vero-E6 cellen. (B) MERS-CoV S pseudotyped deeltje infectiviteit assay in Huh-7 cellen. Voor zowel (A) en (B), uitgezette gegevens stemmen overeen met de gemiddelde relatieve luciferase eenheden uit drie onafhankelijke experimenten, met foutbalken overeenkomt met standaardafwijking (s.d.). Gegevens die zijn uitgezet in10 logschaal op y-as. N.I.: niet-besmette controle; Δenv: infectie met pseudotyped deeltjes ontbreekt virale envelop-glycoproteïnes en VSV-Gpp: infectie met pseudotyped deeltjes, rekening houdend met positieve controle VSV G envelop glycoproteïne. Andere afkorting gebruikt, SARS-Spp: infectie met SARS-CoV S pseudotyped deeltjes, MERS-Spp: besmetting met MERS-CoV S pseudotyped deeltjes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig2.jpg"> Figuur 2 : Concentratie-afhankelijkheid van CoV S-pseudovirion infectiviteit en rol van ACE2 en DPP4 receptoren in vermelding Spp-SARS en MERS-Spp. (A) concentratie-afhankelijkheid van SARS-Spp en MERS-Spp infectiviteit gemeten door luciferase activiteit assay. Pseudovirions waren serieel verdund en gebruikt voor het infecteren van Vero-E6 cellen. (B) infectiviteit kwantitatieve analyse van de SARS-Spp en MERS-Spp in slecht tolerante HEK-293T target cellen transfected aan uitdrukkelijke ACE2, en DPP4 receptoren, respectievelijk. Gegevens die zijn uitgezet in10 logschaal op y-as zoals in Figuur 1 van dubbele experimenten, met foutbalken overeenkomt met standaardafwijking (s.d.). N.T.: niet-transfected HEK-293T cellen; ACE2: angiotensine converting enzyme 2 (SARS-CoV-receptor) en DPP4: dipeptidylpeptidase 4 (MERS-CoV receptor). Andere afkortingen zijn hetzelfde als in Figuur 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting at JoVE.com

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

Productie van Pseudotyped deeltjes te bestuderen van hoogpathogene Coronaviruses in een omgeving van bioveiligheid niveau 2

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van pseudotyped deeltjes in een BSL-2 omgeving waarin de proteïne van de piek van de hoogpathogene virussen Midden-Oosten respiratoir syndroom en het ernstig acuut respiratoir syndroom coronaviruses. Deze pseudotyped deeltjes bevatten een luciferase verslaggever gen waardoor kwantificering van virus host doelcellen indienststelling.

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om pseudotypevirussen te genereren die veilig kunnen worden gebruikt om virale instapgebeurtenissen van hoogpathogene virussen te bestuderen, zoals sal coronavirus en de meeste coronavirus. Deze veelzijdige techniek is gebaseerd op de eenvoudige setup tijdelijke transfectie. Dit systeem kan ook worden toegepast op deeltjes pseudotyped met fusie-eiwitten van andere virussen te produceren, niet alleen coronavirus S.Voor de beste resultaten is het belangrijk om de gezondheid van cellen en dichtheid te controleren voor transfectie en voor pseudotype virusinfectie.Het aantonen van deze procedure zal Tiffany Tang, en Lakshmi Nathan. Afgestudeerde studenten van mijn laboratorium. Om te beginnen, zorgvuldig wassen HEK293T cellen met 10 milliliter van 37 graden Celsius, voorverwarmde DPBS tweemaal.Vervolgens, aspirate de supernatant en bevestig cellen met een milliliter van 25%trypsine oplossing die is voorverwarmd op 37 graden Celsius. Dan, incubeer de kolf van cellen op 37 graden Celsius in 5% kooldioxide milieu gedurende drie tot vijf minuten totdat cellen beginnen los te maken. Voeg vier milliliter complete DMEM toe om de trypsineoplossing te deactiveren.En dan cellen tellen met behulp van een cel tellen dia en een lichtmicroscoop. Verdun cellen tot 500.000 cellen per milliliter met volledige DMEM. Vervolgens zaad twee milliliter per put van de celoplossing in een 6-well weefsel kweekplaat.En beweeg de plaat voorzichtig heen en weer en van links naar rechts om cellen gelijkmatig te verdelen. Na ervoor te zorgen dat cellen gelijkmatig worden verdeeld incubeer de plaat op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide milieu 's nachts of 16 tot 18 uur. Om drie plasmide cotransfectie voor te vormen, meng je eerst berekende hoeveelheden plasmiden en het verlaagde serumcelkweekmedium in een microcentrifugebuis.Broed het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens drie microliters per put van het op lipide gebaseerde transfectiereagensagemiddel toe aan 47 microliter per put van het verlaagde serumcelkweekmedium. Broed het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur.Meng vervolgens in een microcentrifugebuis gelijke hoeveelheden van het transfectiereagens en de plasmideoplossingen door een pijp meerdere keren op en neer te laten gaan. Incubeer het mengsel op kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Na nachtelijke incubatie van de celplaat, gebruik een omgekeerde lichtmicroscoop om cellen te onderzoeken op hun morfologie en dichtheid.Dan, aspirate het gebruikte medium van cellen en voeg voorzichtig een milliliter per put van de voorverwarmde verminderde serum cel cultuur medium aan elke put. Voeg vervolgens 100 microliters van de transfectieoplossing toe aan elke putdrop wise. En de cellen uitbroeden bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide gedurende vier tot zes uur.Voeg aan het einde van de incubatie een milliliter voorverwarmde antibioticavrije transfectie DMEM toe, bij 37 graden Celsius aan elke put. En de cellen incubeer maken op 37 graden Celsius in 5% kooldioxide gedurende 48 uur. Om te beginnen pseudotype deeltjes collectie gebruik maken van een omgekeerde lichtmicroscoop om de cellen examen voor hun morfologie en algemene conditie.De kleur van het medium moet lichtroze of licht oranje zijn. Breng vervolgens de supernatanten van de transfected cellen over naar 50 milliliter conische centrifugebuizen. Centrifuge de buizen op 290 keer zwaartekracht gedurende zeven minuten om celpuin te verwijderen.Vervolgens filter verduidelijkt supernatant door middel van een steriele 0,45 micron porie grootte filter. Maak kleine hoeveelheden aliquots van pseudotype virus oplossing in cryo flesjes. En bewaar ze op negatieve 80 graden Celsius.Om pseudotyped deeltjesbesmetting uit te voeren, eerste examencellen onder lichte microscoop om te bevestigen dat er een samenvloeid tapijt van cellen is. Was vervolgens de cellen drie keer met 0,5 milliliter van het voorverwarmde DPBS bij 37 graden Celsius. Vervolgens, aspirate de supernatants van cellen en inenten de cellen met 200 microliters van de ontdooide pseudotyped deeltjes oplossing.Incubeer de cellen op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende een tot twee uur. Voeg na de incubatietijd 300 microliter van het voorverwarmde DMEMc toe bij 37 graden Celsius. En de geïnfecteerde cellen in te broeden op 37 graden Celsius in 5% kooldioxide gedurende 72 uur.Tot slot de supernatants van de geïnfecteerde cellen aanzuigen. En voorafgaan aan luciferase reporter test. Om de infectiviteit van pseudo-getypte deeltjes eerst te ontdooien luciferin substraat, opgeslagen bij min 80 graden Celsius, op vijf keer luciferase assay lysis buffer opgeslagen bij min 20 graden Celsius tot kamertemperatuur.Verdun vervolgens de luciferase assay lysis buffer tot een keer concentratie met steriel water. Voeg vervolgens 100 microliter van de verdunde buffer toe aan elke put. En incubeer bij kamertemperatuur op een rocker gedurende 15 minuten.Om luciferase activiteit meting uit te voeren, een goed per keer, eerst 20 microliter luciferine substraat toe te voegen aan een microcentrifuge buis. Voeg vervolgens 10 microliter van het lysaat toe aan de buis. Meng de inhoud door de buizen voorzichtig te bewegen.En plaatste de buis in een luminometer apparaat. Sluit het deksel en meet de luminescentiewaarde van de buis. Nota van de relatieve lichteenheden meting, en voorafgaan aan gegevensanalyse.Infectiviteitstesten van SARS-Spp en MERS-Spp in gevoelige gastheercellen, toonden een sterke gemiddelde infectiviteit, vergeleken met de verwachte positieve controledeeltjes. Niet-geïnfecteerde controles en de negatieve controle deeltjes ontbreekt virale envelop glycoproteins. Ook luciferase activiteit testen toonde concentratie afhankelijkheid van SARS-Spp en MERS-Spp infectiviteit.Een toename van SARS-Spp of MERS-Spp infectiviteit in slecht tolerante doelcellen, overtransfected om ACE2 receptor van SARS-Spp, of DPP4 receptor van MERS-Spp, uit te drukken, bevestigt dat receptorgebruik vanvirionen vergelijkbaar is met dat van navo-virussen voor bemiddelende gehechtheid en binnenkomst van pseudovirions. Controleer de berekeningen voordat u deze stap uitvoert. En zorg ervoor dat alle oplossingen goed worden gemengd tijdens de stap.Een westerse vlektest kan worden uitgevoerd op geconcentreerde pseudotyped deeltjes om S glycoproteïne-integratie in de pseudovirions te beoordelen. Hoewel de hier beschreven gepseufde deeltjes veiliger zijn dan navo-virussen, vereisen ze nog steeds bioveiligheidsniveau twee voorzorgsmaatregelen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Veiligheidsmaatregelen en operationele procedures in een (A) BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry en Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Het modelleren van de levenscyclus van Ebola Virus onder Biosafety Level 2 Voorwaarden met het virus-achtige deeltjes die Tetracistronic minigenomen

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Een nieuwe Feeder-vrij systeem voor massaproductie van lymfkliertest Natural Killer cellen In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Inductie van geneesmiddel-geïnduceerde, auto-immune hepatitis bij BALB / c-muizen voor de studie van de pathogene mechanismen

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Productie van Hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes met envelop glycoproteïnen van hoogpathogene H5N1 en aviaire H7N9 virussen

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

Stabiliteit en structuur van Vleermuis Major Histocompatibiliteit Complexe Klasse I met Heterologe β2-Microglobuline

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Dubbele etikettering van immunofluorescentie met behulp van antilichamen van dezelfde soort om gastheer-pathogeeninteracties te bestuderen

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...