Name: production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting
Uploaded: 2019-03-01T12:30:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting at JoVE.com

Nous tenons à remercier tous les membres des laboratoires Whittaker et Daniel des commentaires utiles. Recherche a été financé par le NIH subventions R21 AI111085 et AI135270 R01. T.T. reconnaît le soutien de la bourse de sciences de la vie présidentielle en Cornell University et National Science Foundation recherche Fellowship programme d’études supérieures sous le Grant no. DGE-1650441. L.N. reconnaît le soutien d’un Samuel C. Fleming famille bourse d’études supérieures et de la National Science Foundation recherche Fellowship programme d’études supérieures sous le Grant no. DGE-1650441. Ce travail est également soutenu par la National Science Foundation 1504846 (à S.D. et G.R.W.).

1. cellule semis pour la Production de particules pseudo
Remarque : Effectuez cette étape dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
<ol><li>Par des techniques de culture cellulaire standard, obtenir un flacon de2 confluentes 75 cm 80 – 90 % des cellules HEK-293 t/17 repiquées dans Dulbecco complète du milieu modifié de l’aigle (DMEM-C) contenant de 10 % (vol/vol) sérum fœtal (SVF), 10 mM 4-(2-hydroxyéthyl) -1- acide piperazineethanesulfonic (HEPES), 100 UI/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. Préparer milieu DMEM-T pour transfections (sa composition est la même que DMEM-C mais sans antibiotiques).</li>
	<li>Laver les cellules avec 10 mL de Dulbecco préchauffé (37 ° C) Phosphate Buffered Saline (SPD). Remarque : Gérer les cellules HEK293T/17 avec soin car ils se détachement facilement.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et détacher les cellules avec 1 mL de solution de trypsine 0,25 % préchauffée à 37 ° C. Placer la fiole de cellules à 37 ° C, 5 % CO2 incubateur 3−5 min ou jusqu'à ce que les cellules commencent à détacher. Remarque : Évitez d’incubation des cellules avec la trypsine pendant plus de 5 min car cela mène habituellement à l’agglutination des cellules.</li>
	<li>Désactiver la trypsine en ajoutant 4 mL de DMEM-C moyen et le nombre de cellules utilisant une cellule comptage diapositive et au microscope photonique. Remarque : Pour éviter de compter trop de cellules, une étape de dilution supplémentaire peut être nécessaire au préalable. N’oubliez pas de tenir compte de cette dilution lors du calcul de la densité de cellule réelle des cellules trypsinisés.</li>
	<li>Diluer les cellules à 5 x 105 cellules/mL avec DMEM-C.</li>
	<li>Plaque de culture de tissu de 6 puits avec 2 mL de solution de cellule par puits de graines et doucement déplacer la plaque en arrière et côté à l’autre pour répartir les cellules, en évitant les mouvements circulaires. Remarque : Il s’agit d’une étape clé. Répartie de façon uniforme les cellules s’assurera que les cellules ne pas s’agglutiner au centre du puits. À son tour, cela garantira efficacité de transfection bon et pseudo particules production.</li>
	<li>Incuber la plaque du jour au lendemain (16 – 18 h) dans un 37 ° C, 5 % CO incubateur de culture de2 cellules.</li>
</ol>2. trois-plasmide transfection co
Remarque : Effectuez cette étape dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
<ol><li>Observer des cellules au microscope inversé léger pour vérifier la morphologie cellulaire et la densité. Remarque : Idéalement, la densité cellulaire devrait être dans la gamme confluency de 40 à 60 %. Il est essentiel que les cellules ne soient ni trop anastomosé (80−90 % anastomosé), ni trop peu distribués (20−30 % anastomosé) dans chaque puits. Une densité cellulaire de 40−60 % confluence assurera la production de particules pseudo bonne.</li>
	<li>
Mélange de plasmides
	<ol>
<li>Calculer le mélange de plasmide pour chaque glycoprotéine d’enveloppe suivant les quantités pour un puits d’une plaque de 6 puits indiqués au tableau 1. Multiplier les quantités si transfectants plusieurs puits et inclure un puits supplémentaire pour éviter de manquer de mélange. Remarque : Avec le SRAS S et S MERS-CoV encodage plasmides, comprennent la lutte antivectorielle vide pour la génération de particules de contrôle négatif qui manquent des glycoprotéines d’enveloppe virale (Δenv particules) ainsi que d’une glycoprotéine de contrôle positif tel que vésiculaire stomatite virus (VSV) G glycoprotéine est connu pour infecter fermement une très large gamme de cellules (VSV-ppm). Plasmides sont disponibles sur demande.</li>
		<li>Mélanger les volumes calculés de plasmides et de milieu de culture cellulaire sérum réduit (voir Table des matières) dans un tube de microcentrifuge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Réactif de transfection de lipides à base mix (voir Table des matières)<ol>
<li>Calculer le volume du mélange réactif de transfection des quantités indiquées dans le tableau 2 pour un puits (1:3 ratio de transfection, multiplier les quantités selon les besoins). Inclure des puits supplémentaires pour éviter de manquer de mélange réactif de transfection.</li>
		<li>Mélanger les volumes calculés de réactif de transfection de base de lipides (3 µL / puits) et le milieu de culture cellulaire sérum réduit (47 µL / puits) dans un tube de microcentrifuge, en veillant à ajouter le réactif de transfection dans le milieu de culture cellulaire sérum réduit et non l’inverse autour.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber les mélanges (pour un puits : 50 µL de plasmides mélanger et 50 µL de réactif de transfection de lipides à base de mélange) séparément pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter le contenu du mélange réactif transfection au mélange plasmides dans un rapport 1:1 (pour 1 bien : 50 µL de chaque mélange)</li>
	<li>Effectuer approfondie haut-bas pipetage du mélange qui en résulte.</li>
	<li>Incuber le mélange pendant au moins 20 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirez le milieu usé des cellules.</li>
	<li>Ajouter doucement 1 mL de milieu de culture cellulaire sérum réduit préchauffé (37 ° C) / puits.</li>
	<li>Ajouter goutte à goutte 100 µL du mélange de transfection dans chaque puits. Remarque : Soyez prudent lorsque vous ajoutez le mélange de transfection au puits de HEK-293 t comme ils se détachement facilement.</li>
	<li>Incuber les cellules dans un incubateur 5 % CO2 cell culture pendant 4 à 6 h 37 ° C.</li>
	<li>Ajouter 1 mL par puits de milieu DMEM-T préchauffé (37 ° C) qui ne contient-elle pas d’antibiotiques Remarque : Il s’agit d’une étape clé. Réactifs de transfection augmentent la perméabilité cellulaire et augmentent la sensibilité aux antibiotiques. Pour assurer l’efficacité de transfection bon et production de pseudo particules, il est important d’éviter d’utiliser un milieu de culture cellulaire contenant des antibiotiques</li>
	<li>Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5 % CO2 cell culture incubateur pendant 48 h.</li>
</ol>3. pseudo particules Collection
Remarque : Effectuez cette étape dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
<ol><li>Observer les cellules sous microscope inversé de lumière pour vérifier la morphologie cellulaire et état général. Vérifiez également la couleur du milieu qui devrait être de lumière rose/légèrement orange. Remarque : Il s’agit d’une étape importante. S’il y a trop d’apoptose associée à la transfection ou la couleur moyenne tourné orange/jaune (pH acide), ce sera généralement associé à des rendements plus faibles dans les particules infectieuses pseudo</li>
	<li>Transfert de surnageants de cellules transfectées à tubes à centrifuger coniques 50 mL.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 290 x g pendant 7 min éliminer les débris cellulaires.</li>
	<li>Filtrer sur un filtre stérile 0,45 µm taille de pore surnageant clarifié.</li>
	<li>Faire des portions de faible volume (par exemple., 500 µL ou 1 mL) de solution de pseudo virus dans cryovials.</li>
	<li>Conserver à-80 ° C. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Pseudo particules restent stables à-80 ° C pendant plusieurs mois, mais une fois décongelé, éviter la recongélation eux comme ils perdront infectiosité</li>
</ol>4. pseudo particules Infection des cellules susceptibles
Remarque : Effectuez cette étape dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
<ol><li>
Cellule ensemencement des cellules sensibles à la plaque 24 puits
	<ol>
<li>Obtenir en standard techniques 80−90 % confluentes 75 cm2 flacon de culture cellulaire des cellules sensibles : cellules Vero E6 pour SRAS pseudo particules (SRAS-Spp) et Huh-7 cellules pour MERS-CoV S pseudo particules (MERS-Spp). Remarque : Pour confirmer que les pseudo particules qui ont été produites sont infectieuses, il est important de choisir avec soin une lignée de cellules sensibles approprié pour les essais d’infectiosité pseudovirion. En utilisant des cellules mal permissives conduira à faible potentiel infectieux.</li>
		<li>Laver les cellules deux fois avec 10 mL de pré chauffé (37 ° C) SPD.</li>
		<li>Aspirer le surnageant et détacher les cellules avec 1 mL de solution de trypsine 0,25 % préchauffée à 37 ° C. Placer la fiole de cellules à 37 ° C, 5 % CO2 incubateur 3−5 min ou jusqu'à ce que les cellules commencent à détacher. Remarque : Évitez d’incubation des cellules avec la trypsine pendant plus de 5 minutes, car cela mène habituellement à l’agglutination des cellules. Hein-7 cellules sont particulièrement sensibles à cet effet.</li>
		<li>Désactiver la trypsine en ajoutant DMEM-C moyen et le nombre de cellules utilisant une cellule comptage diapositive et au microscope photonique.</li>
		<li>Diluer les cellules à 5 x 105 cellules/mL avec DMEM-C.</li>
		<li>Puits de la graine d’un 24-puits sur plaque avec 0,5 mL de solution de cellule par puits et doucement déplacent la plaque en arrière et côté à l’autre pour répartir les cellules, en évitant les mouvements circulaires Remarque : Il s’agit d’une étape clé. Répartie de façon uniforme les cellules s’assurera que les cellules ne pas s’agglutiner au centre du puits. Cela garantira à son tour, infectiosité bons dosages. Pour chaque particule pseudo (SRAS-Spp, MERS-Spp) et de la condition, préparer trois puits à trois répétitions expérimentales. Inclure des puits pour les non infectés (N.I.), les particules Δenv vecteur vide et les particules de contrôle positif comme VSV-Gpp</li>
		<li>Incuber pendant la nuit à la plaque (16−18 h) dans un 37 ° C, 5 % CO incubateur de culture de2 cellules</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Infection de pseudo particules
	<ol>
<li>Observer des cellules au microscope photonique et confirmer visuellement qu’il n’y a un tapis confluent de cellules.</li>
		<li>Mettre cryovials de pseudo virus à fondre sur la glace.</li>
		<li>Cellules de laver trois fois avec 0,5 mL préchauffée (37 ° C) SPD Remarque : Il s’agit d’une étape clé. Cellules qui ne sont pas correctement rincés avant l’infection en général entraînent des lectures d’infectiosité faible</li>
		<li>Aspirer le surnageant de cellules.</li>
		<li>Ensemencer les cellules avec 200 µL de solution de particules pseudo décongelés.</li>
		<li>Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5 % CO2 cell culture incubateur pour 1−2 h.</li>
		<li>Ajouter 300 µL de pré chauffé (37 ° C) milieu DMEM-C.</li>
		<li>Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5 % CO2 cell culture incubateur pendant 72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. infectiosité Quantification par luciférase test lecture
Remarque : Effectuez les étapes initiales dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
<ol><li>Substrat de luciférine de dégel (conservés à-80 ° C) et 5 x luciférase dosage tampon de lyse (conservé à-20 ° C) jusqu'à ce qu’ils atteigne la température ambiante.</li>
	<li>Diluer le tampon de lyse dosage luciférase à 1 x avec de l’eau stérile.</li>
	<li>Aspirer le surnageant de cellules infectées par des particules de pseudo.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de tampon de lyse luciférase dosage x en 1 à chaque puits.</li>
	<li>Placer la plaque sur une bascule et incuber pendant 15 min avec bascule à température ambiante (à partir de ce point, que la plaque peut être manipulée en dehors d’une armoire de biosécurité).</li>
	<li>Préparer des microtubes à centrifuger pour chaque puits en ajoutant 20 µL de substrat luciférine dans chaque tube.</li>
	<li>Allumez le luminomètre.</li>
	<li>Effectuer des mesures de l’activité luciférase un bien à la fois en transférant 10 µL de lysat dans un tube contenant 20 µL de substrat de la luciférine.</li>
	<li>Mettez le tube doucement pour mélanger le contenu, mais éviter de déplacer le liquide sur les parois du tube.</li>
	<li>Placer le tube dans l’appareil et fermez le couvercle.</li>
	<li>Mesurer la valeur de la luminescence du tube en utilisant le luminomètre.</li>
	<li>Enregistrer la mesure de l’unité lumineuse relative.</li>
	<li>Répétez les étapes 5,8 – 5.12 jusqu'à ce que tous les puits sont analysés. Remarque : Avec l’équipement approprié comme une plaque lecture luminomètre, ce processus peut être exécuté automatiquement. Le dosage devra être redimensionnées au format de plaque (par exemple le format de plaque à 96 puits, ).</li>
</ol>6. analyse de données
<ol><li>
Calcul et traçage de moyennes et écarts-types de luciférase relative unités
	<ol>
<li>Un graphe traçant le logiciel permet de calculer la mesure de dosage luciférase moyennes et écarts-types d’expérimentale et biologique réplique.</li>
		<li>Tracer les données dans le graphique à barres avec des écarts-types. Remarque : Lorsque vous effectuez des analyses statistiques sur les données, assurez-vous d’inclure au moins trois réplicats biologiques dans des ensembles de données.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit une méthode pour produire efficacement les particules pseudo portant la protéine S des risques groupe 3 coronavirus, SARS-CoV et MERS-CoV, dans un cadre de BSL-2. Ces particules, qui incorporent un gène de rapporteur luciférase, permettent de quantifier facilement coronavirus événements S-mediated entrée par une luciférase relativement simple dosage48,49,50,,51. Dans les essais d’infectiosité utilisant des cellules permissives, nous confirmons que l’activité de la luciférase mesurée dépend de la concentration des particules. En outre, ECA2 et DPP4 transfection du récepteur permet une entrée plus efficace dans les lignées de cellules mal permissive, telles que les cellules HEK-293 t. La méthode est très adaptable aux autres glycoprotéines d’enveloppe virale et a été largement utilisée48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, souvent en complément des autres épreuves comme des analyses biochimiques ou des infections de virus natif.
Le protocole que nous décrivons ici est basé sur le rétrovirus MLV qui incorpore un rapporteur de la luciférase. Toutefois, il est important de souligner qu’il existe un très large éventail d’autres systèmes de pseudotypage qui ont été développés avec succès pour emballage coronavirus S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 et autre enveloppe virale glycoprotéines10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. certains de ces autres systèmes reposent sur les couramment utilisés MLV retroviral core7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, ou basé sur le largement utilisé des gènes du VIH-1 système de pseudotypage en utilisant différentes stratégies23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, ou par le virus de la stomatite vésiculeuse rhabdovirus (VSV) comme noyau, qui permet d’incorporer une grande variété des glycoprotéines d’enveloppe, puis avec diverses stratégies utilisées37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. En outre, autres journalistes tels que protéines fluorescentes comme GFP11,13 et DP36ou enzymes autres que de la luciférase comme la β-galactosidase16,17 et sécrétée phosphatase alcaline (SEAP),42 ont été employés avec succès pour les mesures. En outre, dans l’analyse présentée dans le présent protocole, une transfection transitoire a été utilisée pour exprimer les gènes VCP et S du CoV et les protéines. Cependant, il y a des autres stratégies pour l’expression, comme la production de lignées cellulaires stables pour la production de virus pseudo7,14. Comme chacun de ces systèmes ont leurs avantages et leurs inconvénients, il est important d’examiner les paramètres importants suivants pour décider quel système pseudotypage mieux aux besoins de l’enquêteur : pseudovirion core (MLV, VIH-1, VSV ou autres), comment un noyau particulier pseudotypage sélective est en incorporant une glycoprotéine de l’enveloppe virale spécifique, reporter pour la lecture de l’essai (GFP, luciférase, SEAP ou autre) et la stratégie de transfection (nombre de plasmides impliqués dans la transfection co, transitoire transfection ou génération de lignées cellulaires stables).
Il y a un certain nombre d’étapes cruciales dans la méthode qui sont importants à souligner. La densité cellulaire, en particulier de la lignée de cellules HEK 293 t/17 producteur est un facteur critique pour assurer la transfection réussie. Une densité cellulaire au niveau de la confluence de 40 à 60 % s’est avérée pour être optimale. Des densités plus élevées généralement entraîner transfection faibles gains d’efficacité et de la production de particules de faible. En outre, il est important de garder à l’esprit que les cellules HEK-293 t/17 sont moins adhérentes que les autres lignées cellulaires. Il fallait être prudent lors de la manipulation afin d’éviter leur détachement inutilement. Une option consiste à traiter les surfaces en plastique de culture de cellules avec poly-D-lysine pour améliorer l’adhérence. En outre, passage de cellule supérieure aboutit souvent à des taux de transfection pauvres. Après avoir ajouté le réactif de transfection de cellules HEK 293 t/17, il est également important de se rappeler qu’augmente la perméabilité cellulaire. C’est pourquoi, à ce stade, il est préférable d’éviter d’utiliser des antibiotiques contenant moyens car ils peuvent augmenter la cytotoxicité. Avant de recueillir des particules de pseudo, vérifier la couleur des surnageants de cellules transfectées HEK-293 t/17. En règle générale, après 48 h de la transfection, la couleur du milieu de culture cellulaire prend une teinte rose-orangé. Couleur jaune moyen habituellement se traduit par des rendements de particules pseudo pauvres et résulte souvent des problèmes avec cellule ensemencement de densité ou numéro de passage élevé.
Dans ce protocole, production de pseudo particules est réalisée dans un format de plaque 6 puits. Pour augmenter le volume des particules produites, plusieurs puits d’une plaque de 6 puits peuvent être transfectées avec le même mélange de plasmides et les fractions surnageantes peuvent être regroupés ensemble. La piscine peut ensuite être clarifié, filtré et aliquotés. Par ailleurs, à l’échelle de production vers le haut, d’autres types de navires (par exemple, 25, ou 75 cm2 flacons) peuvent être utilisé. Dans ce cas, les conditions de transfection devraient être transposées en conséquence. Dans ce protocole, l’analyse de l’infectiosité est réalisée à l’aide d’un format de plaque 24 puits et un luminomètre qui permet uniquement des mesures un tube à la fois. Pour les projections à haut débit, les autres formats sont également possibles, tels que le format de la plaque à 96 puits et un luminomètre lecteur de plaque. Volumes et réactifs pour l’analyse de luciferase doivent être adaptés en conséquence. Stockage de pseudo particules dans cryovials à-80 ° C maintient leur stabilité pendant plusieurs mois sans réduction appréciable d’infectiosité. Il n’est pas recommandé de les soumettre aux cycles gel-dégel puisque cela diminuerait leur infectiosité au fil du temps. Ainsi, il est préférable de les stocker dans petites parties aliquotes tels que 0,5 à 1 mL et les décongeler avant une infection.
La méthode présentée ici présente plusieurs limites. Un important est le fait que les particules pseudo récapitulent événements entrée seulement virale. Pour analyser les autres étapes du cycle de vie infectieuses, autres tests sont nécessaires. En outre, comme MLV particules bourgeon à la membrane plasmique, il est important de garder à l’esprit que la glycoprotéine d’enveloppe étudiée a besoin pour également le trafic vers la membrane plasmique pour incorporation dans pseudovirions au cours de la production. Par conséquent, il est important de savoir où dans la cellule une glycoprotéine de l’enveloppe virale particulière s’exprime dans des conditions de transfection, comme en visualisant la localisation sous-cellulaire avec un test d’immunofluorescence, et/ou en recherchant les signaux de rétention au sein la protéine. Aussi, tandis que le protocole décrit les étapes pour produire et tester l’infectiosité, il ne pas détailler comment mesurer l’incorporation des glycoprotéines d’enveloppe virale en pseudo particules. Une méthode consiste à effectuer des analyses par transfert western sur des solutions concentrées de particules, comme décrit précédemment50,51 pour incorporation de MERS-CoV S. Ces essais, la glycoprotéine d’enveloppe S des MERS-CoV est détectée ainsi que de la protéine de capside (p30) de MLV, qui nous permettent de normaliser l’incorporation de la protéine S en particules. Autres exemples de ces tests analysant l’enveloppe virale glycoprotéines incorporation pseudovirions ont été effectués pour l’incorporation de SRAS S dans un VIH-1 des gènes pseudovirion système32 , Ebola glycoprotéines (GP) dans un autre MLV pseudo particule système17et hémagglutinine (HA) de la grippe et la neuraminidase (NA) en VSV pseudovirions38. Un développement récent en caractérisant la production de particules pseudo est l’utilisation des appareils d’imagerie innovantes telles que Nanosight : il nous permet de directement visualiser, quantifier et de taille de particules virales50. L’appareil fournit des renseignements détaillés sur la production globale de particules ; Toutefois, il est important de garder à l’esprit qu’il ne fournit pas d’informations sur l’incorporation de glycoprotéine enveloppe. Une orientation future pour l’application de ces particules pseudovirion polyvalent est d’analyser les événements de fusion virale individuels à l’aide de suivi une seule particule, microfluidique et réflexion totale interne fluorescence microscopy60,61 ,,62. Ces approches ont été appliquées avec succès à virus grippal et coronavirus félin particules comme grippe HA - et NA-pseudo axée sur la VSV pseudovirions63. Le déploiement de ces techniques appliquées au coronavirus S-pseudo particules axée sur la canalisation principale est en cours d’élaboration.

Entrée de cellule hôte constitue les étapes initiales du cycle de vie infectieux viral. Pour les virus enveloppés, il s’agit de la liaison à un récepteur de cellule hôte unique ou plusieurs récepteurs, suivies de la fusion des membranes cellulaires et virales. Ces fonctions essentielles sont réalisées par l’enveloppe virale glycoprotéines1,2. La glycoprotéine d’enveloppe de coronavirus est appelée la protéine de l’épi (S) et est membre de la classe j’ai virales fusion protéines2,3,4,5,6. Étudier des glycoprotéines d’enveloppe virale est essentielle pour comprendre plusieurs caractéristiques importantes d’un virus donné, tels que : entrée de cellule de l’initiation du cycle de vie, son hôte et tropisme cellulaire, transmission interespèces, pathogénèse virale, ainsi que hôte voies. Des particules virales pseudo, aussi nommées pseudovirions, sont des outils puissants qui permettent de facilement étudier la fonction des protéines de fusion virale. Particules de pseudo ou pseudovirions sont des virions chimériques qui sont constitués d’un substitut virale avec une protéine de l’enveloppe virale hétérologue à leur surface. Le protocole vise principalement à montrer comment obtenir des coronavirus spike pseudo particules qui reposent sur un noyau de virus (MLV) leucémie murine et contiennent un gène de rapporteur luciférase. Par exemple, la méthode pour produire des particules de pseudo avec les protéines de l’épi du coronavirus du syndrome respiratoire (TCM) Moyen-Orient et hautement pathogène syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) sont présentés. Le protocole décrit la procédure de transfection impliquée, comment pour infecter les cibles sensibles des cellules et de quantification de l’infectiosité de l’analyse de luciferase.
Les marches de l’entrée des pseudovirions étant régies par le coronavirus S à leur surface, ils entrent dans cellules de façon similaire à homologues natives. À ce titre, ils sont excellents substituts des essais fonctionnels de l’infectivité. Pseudo particules proviennent généralement de virus modèle parental tels les rétrovirus (MLV7,8,10,d'9,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 et le virus d’immunodéficience humaine lentivirus — VIH23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) ou rhabdoviruses (virus de la stomatite vésiculeuse — VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). lorsqu’il est utilisé en pseudotypage, les génomes des virus parental sont modifiées afin d’enlever les gènes essentiels, qui les rendent défectueux pour accomplir un cycle de réplication complet. Cette fonctionnalité leur permet d’être utilisé dans les installations de niveau intermédiaire biosafety (BSL-2) et est un avantage important par rapport à l’aide des virus hautement pathogènes indigènes qui nécessitent des installations de sécurité biologique plus élevées (niveau de biosécurité 3, BSL-4, qui ne sont pas aussi facilement disponibles) lorsque des études d’entrée de virus. Ici, les protéines S du risque groupe 3 agents pathogènes-SRAS et MERS-CoV sont utilisés comme exemples des protéines de l’enveloppe virale étant intégrées à MLV pseudo particules, générant des pseudovirions-SRAS S et S MERS-CoV (SRAS-Spp et MERS-Spp, respectivement). Ces pseudovirions ont été utilisées avec succès dans les études portant sur des événements d’entrée de ces virus48,49,50,51. Un autre avantage est que la technique décrite ici n’est pas limitée aux protéines coronavirus S pseudotypage : il est très flexible et peut être utilisé pour intégrer des représentants des trois catégories de protéines de fusion virale. On peut citer hémagglutinine de grippe (HA, classe I)52, glycoprotéines du virus Ebola (GP classe I), E1 protéine du virus de la forêt de Semliki alphavirus (SFV, classe II) et glycoprotéine VSV (G, classe III)53. En outre, plus d’une sorte de glycoprotéine virale peut être co intégrée à une particule de pseudo, comme dans le cas de la grippe HA et NA - pseudo particules51.
Basé sur le travail effectué par Bartosch et coll.20, ce protocole décrit la génération de MLV pseudo particules avec une stratégie de trois-plasmide co transfection avec le largement disponible et très compétent à la transfection HEK-293 t cell line 54. le premier plasmide encode le MLV principaux gènes gag et pol mais il lui manque le gène env MLV enveloppe. Le deuxième plasmide est un vecteur de transfert qui encode un gène rapporteur luciférase de firefly, un signal d’emballage Ψ-RNA MLV, ainsi que 5'-3'-accompagnement MLV longue répétition terminale (LTR) régions et. Le plasmide troisième code la protéine de fusion d’intérêt, dans ce cas soit la protéine S-SRAS ou MERS-CoV S. En co de transfection des trois plasmides à l’aide d’un réactif de transfection, les ARN et les protéines virales obtenir a exprimé dans les cellules transfectées permettant la génération de pseudo particules. Depuis MLV est utilisé comme épine dorsale pseudovirion, c’est le cas à la membrane plasmique : RNAs contenant la luciférase gène reporter et le signal de l’emballage s’encapsulé en particules naissants qui incorporent également exprimés par les membranes plasmiques des coronavirus spike protéines. Les particules qui bourgeonnent à partir de cellules contiennent la protéine coronavirus S à leur surface et sont récoltés pour utilisation lors d’essais de l’infectivité. Parce que les particules pseudo harbor la protéine coronavirus S et pas la protéine d’enveloppe MLV, lorsqu’il est utilisé pour infecter les cellules, ils se comportent comme leurs homologues de coronavirus native pour les étapes de l’entrée. L’ARN viral contenant le rapporteur de la luciférase et litres d’accompagnement est alors libéré dans la cellule et les activités de la polymérase rétroviraux permettent sa transcription inverse dans l’ADN et l’intégration dans le génome de la cellule hôte. Quantification de l’infectivité des particules virales de pseudo dans les cellules infectées est ensuite exécutée avec une analyse d’activité de la luciférase simple. Parce que la séquence d’ADN qui est intégrée dans le génome de la cellule hôte ne contient que le gène de la luciférase et aucun des gènes de protéine-codage MLV ou coronavirus, ils sont intrinsèquement plus sûrs à utiliser que les virus indigènes aptes à la réplication.
En plus d’être des substituts plus sûrs et hautement adaptable pour permettre l’incorporation de divers genres de glycoprotéines d’enveloppe, les pseudo particules décrites ici sont également très polyvalents et peuvent être utilisés pour étudier plusieurs aspects de l’entrée du virus. Ceci inclut mais n’est pas limité à : test de susceptibilité cellule hôte à l’infection par le virus, analyse les voies d’entrée cellulaire utilise un virus enveloppé, étudie les effets des inhibiteurs pharmacologiques et des projections de drogue, effectuant des anticorps de neutralisation essais, caractérisant l’entrée cellule hôte des virus enveloppés qui ne peuvent pas être cultivées et générant des vecteurs viraux pour la livraison de gène, stable cellulaire expression des gènes d’intérêt, ou de silençage génique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1213px;" width="1212">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:419px;">Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells&#160;</td>
			<td style="width:287px;">ATCC</td>
			<td style="width:155px;">CRL-11268</td>
			<td style="width:353px;">Clone 17 cells are highly competent for transfection.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human hepatic Huh-7 cells&#160;</td>
			<td>Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition</td>
			<td>JCRB0403</td>
			<td style="width:353px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted light microscope with 10 &#215; objective&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#39;s medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>1614071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethanesulphonic acid (HEPES)&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#215; penicillin-streptomycin (PS) solution</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 &#215; solution&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:419px;">Cell counting slides with grids&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Kova</td>
			<td style="width:155px;">87144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-minimal essential medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45 &#181;m pore-size sterile filter&#160;</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10 mL syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5 &#215; luciferase assay lysis buffer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luciferin, substrate for luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile water&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E476-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GloMax 20/20 luminometer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>2030-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting

Le protocole vise à produire des coronavirus (CoV) protéine de fusion épi (S) lignée de cellules de pseudo particules avec murine leukemia virus (MLV) core et la luciférase reporter, à l’aide d’une procédure simple de transfection de l’HEK-293 t largement disponibles. Une fois formé et libérés par les cellules de producteur, ces pseudovirions incorporent un gène de rapporteur luciférase. Puisqu’ils contiennent seulement le coronavirus hétérologue spike protéine sur leur surface, les particules se comportent comme leurs homologues de coronavirus native pour les étapes de l’entrée. À ce titre, ils sont excellents substituts des virions natives pour étudier l’entrée virale dans les cellules hôtes. Entrée réussie et infection dans les cellules cibles, le rapporteur de la luciférase est intégré dans le génome de la cellule hôte et s’exprime. À l’aide d’un simple de luciferase, cellules transduits peuvent être facilement quantifiés. Un avantage important de la procédure est qu’elle peut être réalisée en biosécurité niveau 2 installations (BSL-2) au lieu de niveau de biosécurité 3 installations requises pour le travail avec des coronavirus hautement pathogènes comme le Moyen-Orient syndrome respiratoire coronavirus (MERS-CoV) et coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS). Un autre avantage vient de sa polyvalence, car elle peut être appliquée aux protéines de l’enveloppe appartenant aux trois catégories de protéines de fusion virale, telle que la classe j’ai hémagglutinine (HA) de la grippe et glycoprotéine de virus Ebola (GP), le virus de forêt de Semliki II de classe E1 protéine, ou la glycoprotéine de virus G classe III stomatite vésiculeuse. Une limitation de la méthodologie est qu’il peut seulement récapituler étapes d’entrée virus médiées par la protéine de l’enveloppe étant l’objet d’une enquête. Pour l’étude des autres étapes du cycle de vie viral, les autres méthodes sont nécessaires. Parmi les nombreuses applications d’en que ces particules défectif peuvent être utilisés enquête de susceptibilité de cellule hôte et tropisme et tester les effets des inhibiteurs d’entrée de virus à disséquer les voies d’entrée virale utilisées.

Résultats représentatifs des essais d’infectiosité du SARS-CoV S et S MERS-CoV pseudo particules sont indiquées à la Figure 1. Comme prévu, pour les deux figures 1A et 1 b, le VSV G pseudo positive particules contrôle (VSV-Gpp) a donné l’infectivité moyenne très élevée dans les 106 à 10 unités de luciférase relative de7 (RLU) rang respectivement. Pour S-SRAS infection de pseudo particules (Figure 1A) des cellules Vero-E6 susceptibles, une forte infectivité moyenne a été mesurée à environ 9,8 x 104 RLU. Cette valeur est presque 3 ordres de grandeur plus élevés que les valeurs mesurées pour le contrôle non infectés (1,1 x 102 RLU), ou les particules Δenv (1,5 x 102 RLU), qui ne pas héberger des glycoprotéines d’enveloppe virale à leur surface. De même, pour les MERS-CoV S infection de pseudo particules (Figure 1B) des cellules Huh-7, un moyen fort potentiel infectieux a été mesurée à environ 1,0 x 106 RLU. Il s’agit de presque 4 ordres de grandeur plus élevés que les valeurs mesurées pour le contrôle non infectés (0,8 x 102 RLU), ou les particules Δenv (2,0 x 102 RLU). Un dosage d’infectiosité supplémentaire a été effectué dans laquelle le SRAS-Spp et MERS-PSP en série ont été dilué et utilisé pour infecter les cellules Vero-E6 (Figure 2A). Ce test confirme que l’activité de la luciférase mesurée dépend de la concentration des particules utilisés pour infecter les cellules. Pour confirmer le rôle de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ECA2) et de la dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), les récepteurs du SARS-CoV et MERS-CoV, respectivement, dans la médiation attachement et entrée des particules pseudo, nous avons utilisé les cellules HEK-293 t mal permissif et pour exprimer l’ACE2 ou DPP4 transfectées (Figure 2B). Les cellules transfectées ont été utilisées ensuite pour un dosage de l’infectivité. Cette analyse démontre qu’à la surexpression du gène ACE2 et DPP4, il y a ~ 4-log et log-~ 2 augmentation d’infectiosité du SRAS-Spp et MERS-Spp, respectivement, confirmant que l’utilisation des récepteurs de pseudovirions est similaire à celle des virus natifs.
Les exemples montrés ici démontrent l’importance d’y compris négatif (non infectés, Δenv particules) ainsi que des conditions de contrôle positif (VSV-Gpp) lors de la production de particules pseudo. En effet, les particules de contrôle positif VSV-Gpp nous permettent d’évaluer si un lot particulier de pseudo particules a réussi à céder pseudovirions infectieuses et fonctionnelles. Résultats attendus de l’infection typique de VSV-Gpp particules dans des cellules de mammifères plus les lignes sont dans la gamme 106−107 RLU. Problèmes avec des cellules HEK 293 t 17/producteur (numéro de passage élevé, des problèmes avec la densité des cellules) ou de l’efficacité de transfection pauvres peut avoir un impact production de particules pseudo global et l’infectiosité. De plus, les conditions de contrôle négatif sont importantes car ils nous permettent d’évaluer les lignes de base des mesures RLU dans une lignée de cellules particulières (condition non infectés) et non-spécifique internalisation des particules (Δenv infection) qui n’est pas véhiculée par une protéine de l’enveloppe virale. Idéalement, pour un type donné de particule pseudo avec une protéine de l’enveloppe virale d’intérêt, il est recommandé d’obtenir des valeurs qui sont de plusieurs ordres de grandeur supérieures aux valeurs de contrôle négatif, comme ici sur la Figure 1A, B. Toutefois, si pour un type donné de cellules, une infection par le virus pseudo donne très peu d’infectiosité (c'est-à-dire, près de témoins négatifs tels comme dans la Figure 2B dans des conditions de N.T. non transfectées) il ne signifie pas nécessairement que le pseudo production de particules était défectueuse. Il pourrait bien être que la ligne de la cellule particulière utilisée n’est pas ou mal permissive à l’infection. Il est recommandé de vérifier si un type de cellule donnée devrait être sensible à l’infection par le virus à l’étude. Transfection des cellules mal permissives avec plasmid(s) exprimant dans que les récepteurs virales peuvent permettre l’entrée virale plus efficace et l’infection de se produire, comme le montre la Figure 2B, indiquer que la transfection des récepteurs ACE2 et DPP4 ciblent HEK-293 t les cellules, il y a ~ 4- et ~ 2-journal augmentation infectiosité, respectivement.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Plasmide/réactif</td>
			<td>Quantité</td>
		</tr>
<tr>
<td>cmvp-MLVgagpol MLV gag et pol codant le plasmide</td>
			<td>300 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>pTG-Luc vecteur de transfert avec le rapporteur de la luciférase</td>
			<td>400 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>vector pcDNA-SRAS-S, pcDNA-MERS-S ou vide</td>
			<td>300 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>Milieu de culture cellulaire sérum réduit</td>
			<td>À 50 µL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : quantité de plasmides et de sérum réduit cell milieu de culture pour transfecter un puits d’une plaque de 6 puits de cellules HEK 293 t/17 pour la production de particules pseudo. De la concentration des préparations de plasmide, calculer le volume requis pour atteindre le montant requis d’ADN plasmidique. Si plus d’un puits est transfectées avec les plasmides mêmes, multiplier les volumes requis nombre de puits à transfecter et inclure un puits d’appoint dans les calculs pour éviter de manquer de mélange dans les étapes ultérieures. La quantité totale d’ADN étant transfecté est de 1 µg/puits. Plasmides sont disponibles sur demande aux auteurs.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Quantité</td>
		</tr>
<tr>
<td>Réactif de transfection</td>
			<td>3 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Milieu de culture cellulaire sérum réduit</td>
			<td>47 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : quantités de sérum réduit et le réactif de transfection de cellules milieu de culture pour transfecter un puits d’une plaque de 6 puits de cellules HEK 293 t/17 pour la production de particules pseudo. Multipliez les volumes requis nombre de puits à transfecter et inclure des puits supplémentaires dans les calculs pour éviter de manquer de mélange dans les étapes ultérieures. Le réactif de transfection : rapport d’ADN plasmidique utilisé est de 3:1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig1.jpg"> Figure 1 : Coronavirus S-pseudo essais d’infectiosité de particules dans les cellules hôtes sensibles à l’aide d’un gène de murine leukemia virus (MLV) épine dorsale et de la luciférase rapporteur. (A)-SRAS S pseudo particules infectiosité essai sur cellules Vero-E6. (B) S MERS-CoV pseudo particules infectiosité dosage dans les cellules Huh-7. Pour les deux (A) et (B), données restituées correspondant aux unités luciférase relative moyenne de trois expériences indépendantes, avec des barres d’erreur correspondant à la déviation standard (s.d.). Données tracées à l’échelle10 logarithmique sur l’axe des ordonnées. N.I. : contrôle non infectés ; Δenv : infection avec pseudo particules manquant de glycoprotéines d’enveloppe virale et de VSV-Gpp : infection avec pseudo particules portant contrôle positif VSV G glycoprotéine d’enveloppe. Autre abréviation utilisée, SRAS-Spp : infection par le SRAS-CoV S pseudo particules, MERS-Spp : infection avec S MERS-CoV pseudo particules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig2.jpg"> Figure 2 : Concentration-dépendance de l’infectiosité de CoV S-pseudovirion et rôle des récepteurs ACE2 et DPP4 en entrée du SRAS-Spp et MERS-Spp. (A) Concentration-dépendance de l’infectivité du SRAS-Spp et MERS-PSP mesurée par analyse de l’activité de luciferase. Pseudovirions étaient en série diluées et utilisées pour infecter les cellules Vero-E6. Infectiosité (B), dosage du SRAS-Spp et MERS-PSP en cellules de cible mal permissives HEK-293 t transfecté à ACE2 express et les récepteurs de la DPP4, respectivement. Données tracées à l’échelle10 logarithmique sur axe des ordonnées comme dans la Figure 1 des expériences en double, avec des barres d’erreur correspondant à la déviation standard (s.d.). N.T. : les cellules non transfectées contrôle HEK-293 t ; EC2 : angiotensin converting enzyme 2 (récepteur-SRAS) et DPP4 : dipeptidyl peptidase 4 (récepteur des MERS-CoV). Autres abréviations utilisées sont les mêmes que dans la Figure 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting at JoVE.com

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

Production de pseudo particules pour étudier les coronavirus hautement pathogènes dans un cadre de niveau 2 de Biosafety

Nous présentons ici un protocole visant à générer des particules pseudo dans un cadre de BSL-2 intégrant la protéine spike du syndrome respiratoire de virus hautement pathogènes Moyen-Orient et coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère. Ces particules pseudo contiennent un gène de rapporteur luciférase permettant la quantification de l’entrée du virus dans les cellules de l’hôte cible.

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Ce protocole permet aux chercheurs de générer des virus pseudotypes qui peuvent être utilisés en toute sécurité pour étudier les événements d’entrée virale de virus hautement pathogènes, tels que le coronavirus sal et la plupart des coronavirus. Cette technique polyvalente est basée sur la passation transitoire facile d’installation. Ce système peut également être appliqué pour produire des particules pseudotypées avec des protéines de fusion d’autres virus, pas seulement le coronavirus S.Pour de meilleurs résultats, il est important de surveiller la santé cellulaire et la densité de la transfection ainsi que pour l’infection par le virus pseudotype.Tiffany Tang et Lakshmi Nathan feront la démonstration de cette procédure. Des étudiants diplômés de mon laboratoire. Pour commencer, lavez soigneusement les cellules HEK293T avec 10 millilitres de 37 degrés Celsius, DPBS préchauffé deux fois.Ensuite, aspirez le supernatant et fixez les cellules avec un millilitre de solution trypsine de 25% qui a été préchauffé à 37 degrés Celsius. Que, incuber le flacon de cellules à 37 degrés Celsius dans l’environnement de dioxyde de carbone de 5% pendant trois à cinq minutes jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher. Ajoutez quatre millilitres de DMEM complet pour désactiver la solution trypsine.Et puis compter les cellules à l’aide d’une diapositive de comptage cellulaire et d’un microscope léger. Diluer les cellules à 500 000 cellules par millilitre avec un DMEM complet. Ensuite, graine deux millilitres par puits de la solution cellulaire dans une plaque de culture tissulaire de 6 puits.Et déplacez doucement la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre pour répartir uniformément les cellules. Après s’être assuré que les cellules sont réparties uniformément incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone environnement pendant la nuit ou 16 à 18 heures. Pour préformer trois cotransfection plasmide, le premier mélange a calculé des volumes de plasmides et le milieu réduit de culture cellulaire de sérum dans un tube de micro centrifugeuse.Incuber le mélange à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite trois microlitres par puits du réagent transfection à base de lipides à 47 microlitres par puits du milieu réduit de culture cellulaire sérique. Incuber le mélange à température ambiante pendant cinq minutes.Ensuite, dans un tube de micro centrifugeuse, mélanger des quantités égales du réaccente de transfection et les solutions plasmides par tuyau se dirigeant de haut en bas à plusieurs reprises. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 minutes. Après l’incubation nocturne de la plaque cellulaire, utilisez un microscope à lumière inversée pour examiner les cellules pour leur morphologie et leur densité.Ensuite, aspirez le milieu dépensé des cellules et ajoutez doucement un millilitre par puits du milieu de culture réduit préchauffé de cellules sériques à chaque puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la solution de transfection à chaque puits goutte sage. Et incuber les cellules à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant quatre à six heures.À la fin de l’incubation, ajouter un millilitre de transfection sans antibiotiques préchauffé DMEM, à 37 degrés Celsius à chaque puits. Et incuber les cellules à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant 48 heures. Pour commencer la collecte des particules pseudotype utiliser un microscope à lumière inversée pour vérifier les cellules pour leur morphologie et leur état général.La couleur du milieu doit être rose clair ou légèrement orange. Ensuite, transférez les supernatants des cellules transfected aux tubes coniques de centrifugeuse de 50 millilitres. Centrifuger les tubes à 290 fois la gravité pendant sept minutes pour enlever les débris cellulaires.Ensuite, filtre clarifié supernatant à travers un filtre stérile de 0,45 micron pore taille. Faire de petits aliquots volume de solution de virus pseudotype dans les flacons cryo. Et les stocker à 80 degrés Celsius négatifs.Pour effectuer l’infection pseudotypée de particule, premières cellules d’examen sous le microscope léger pour confirmer qu’il y a un tapis confluent des cellules. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 0,5 millilitres du DPBS préchauffé à 37 degrés Celsius. Ensuite, aspirez les supernatants des cellules et inoculez les cellules avec 200 microlitres de la solution de particules pseudotypées décongelées.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant une à deux heures. Après la période d’incubation, ajouter 300 microlitres du DMEMc préchauffé à 37 degrés Celsius. Et incuber les cellules infectées à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant 72 heures.Enfin aspirer les supernatants des cellules infectées. Et précéder à luciferase journaliste analyse. Quantifier l’infectiosité des particules pseudotypées d’abord décongeler le substrat de luciferine, stocké à moins 80 degrés Celsius, à cinq reprises luciferase analyse tampon de lyse stocké à moins 20 degrés Celsius à température ambiante.Ensuite, diluer le tampon de lyse d’analyse de luciferase à une fois la concentration avec de l’eau stérile. Ensuite, ajoutez 100 microlitres du tampon dilué à chaque puits. Et incuber à température ambiante sur un rocker pendant 15 minutes.Pour effectuer la mesure de l’activité de la luciferase, un puits à la fois, ajoutez d’abord 20 microlitres de substrat de luciferine à un tube de micro centrifugeuse. Ajouter ensuite 10 microlitres du lysate au tube. Mélanger le contenu en faisant glisser doucement les tubes.Et placé le tube dans un dispositif de luminomètre. Fermez le couvercle et mesurez la valeur de luminescence du tube. Enregistrez la mesure relative des unités lumineuses et précèdez l’analyse des données.Les analyses d’infectiosité du SRAS-Spp et du MERS-Spp dans les cellules hôtes sensibles ont montré une forte infectiosité moyenne, comparativement aux particules de contrôle positives attendues. Contrôles non infectés et particules de contrôle négatives dépourvues de glycoprotéines enveloppe virale. Les analyses d’activité de luciferase ont également montré la dépendance de concentration de l’infectiosité de SRAS-Spp et de MERS-Spp.Une augmentation de l’infectiosité du SRAS-Spp ou du MERS-Spp dans les cellules cibles mal permissives, transfectées pour exprimer le récepteur ACE2 du SRAS-Spp, ou récepteur DPP4 du MERS-Spp, confirme que l’utilisation des pseudovirions par les récepteurs est similaire à celle des virus de l’OTAN pour la médiation de l’attachement et l’entrée des pseudovirions. Vérifiez les calculs avant d’effectuer cette étape. Et assurez-vous que toutes les solutions sont bien mélangées pendant l’étape.Un essai occidental de tache peut être exécuté sur les particules pseudotypées concentrées pour évaluer l’incorporation de glycoprotéine de S dans les pseudovirions. Bien que les particules pseudotypées décrites ici soient des substituts plus sûrs que les virus de l’OTAN, elles nécessitent toujours des précautions de niveau de biosécurité deux.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Emballage VIH ou FIV à base de constructions d&#39;expression et de transduction du Lentivector VSV-G pseudotypés particules virales

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Recherche

Immunologie et infection

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Mesures de sécurité et procédures d&#39;exploitation dans un (A) 4-BSL laboratoire: Procédures 1. biosécurité de niveau 4 Suit Laboratoire Suite entrée et de sortie

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modélisation du cycle de vie du virus Ebola Sous biosécurité de niveau 2 Conditions de particules de type viral contenant Tetracistronic minigénomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Induction d’une hépatite auto-immune induite par des médicaments chez des souris BALB/c pour l’étude de ses mécanismes pathogènes

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Transfection très efficace des macrophages primaires avec ARNm transcrit in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines d'enveloppe provenant de virus H5N1 hautement pathogènes et de virus H7N9 aviaires

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

Stabilité et structure du complexe histocompatibilité majeur de chauve-souris classe I avec β2-Microglobuline

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Immunofluorescence à double marquage à l’aide d’anticorps de la même espèce pour étudier les interactions hôte-pathogène

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...