Name: production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting
Uploaded: 2019-03-01T12:30:00
Duration: 8 min 40 s
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हम उपयोगी टिप्पणियों के लिए whittaker और डैनियल लैब्स के सभी सदस्यों को धंयवाद देना चाहता हूं । अनुसंधान धन nih अनुदान R21 AI111085 और R01 AI135270 द्वारा प्रदान किया गया था । टीटी अनुदान सं के तहत cornell विश्वविद्यालय और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप कार्यक्रम में राष्ट्रपति जीवन विज्ञान फैलोशिप से समर्थन स्वीकार करता है । DGE-१६५०४४१. l.n. अनुदान सं के तहत एक शमूएल सी फ्लेमिंग परिवार स्नातक फैलोशिप और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप कार्यक्रम से समर्थन स्वीकार करता है । DGE-१६५०४४१. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन १५०४८४६ (S.D. और g.r.w.) द्वारा भी समर्थित है ।

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

मेजबान सेल प्रविष्टि वायरल संक्रामक जीवन चक्र के प्रारंभिक कदम का गठन किया । आवरण वायरस के लिए, यह एक एकल मेजबान सेल रिसेप्टर या कई रिसेप्टर्स, वायरल और सेलुलर झिल्ली के विलय के बाद के लिए बाध्यकारी शामिल है । ये आवश्यक कार्य वायरल लिफाफे द्वारा किए जाते हैं नच१,२. कोरोनाविरस लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन स्पाइक (एस) प्रोटीन कहा जाता है और वर्ग मैं वायरल फ्यूजन प्रोटीन2,3,4,5,6का एक सदस्य है । वायरल लिफाफा नच का अध्ययन एक दिया वायरस के कई महत्वपूर्ण विशेषताओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे कि: जीवन चक्र दीक्षा, अपने मेजबान और सेलुलर अनुवर्तन, interspecies संचरण, वायरल रोगजनन, साथ ही मेजबान सेल प्रविष्टि रास्ते. वायरल कूटलिखित कणों, भी कूटविरिओन नाम, शक्तिशाली उपकरण है कि हमें आसानी से वायरल फ्यूजन प्रोटीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए सक्षम हैं । स्यूडोटाइप कणों या स्यूडोविरिओन चिएरिक विरिओन होते हैं जो उनकी सतह पर एक विषमजातीय वायरल लिफाफा प्रोटीन के साथ एक सरोगेट वायरल कोर से मिलकर बनता है । प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य कोरोनेविरस स्पाइक स्यूडोटाइप कणों को प्राप्त करने का तरीका है जो कि एक मुरीन ल्यूकेमिया वायरस (एमएलवी) कोर पर आधारित है और इसमें एक ल्यूसीफ्रैज़ रिपोर्टर जीन शामिल हैं । उदाहरण के रूप में, उच्च रोगजनक गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम (एसएआरएस) और मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम (MERS) कोरोनावायरस के स्पाइक प्रोटीन के साथ स्यूडोटाइप कणों का उत्पादन करने की विधि प्रस्तुत की गई है । प्रोटोकॉल में शामिल अभिकर्मक प्रक्रिया का वर्णन, कैसे अतिसंवेदनशील लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए, और लूसिफेट्रेस परख द्वारा संक्रमणशीलता परिमाणन.
चूंकि स्यूडोविरिओन के प्रवेश चरणों को उनकी सतह पर कोरोनाविरस एस द्वारा नियंत्रित किया जाता है, वे एक समान फैशन में देशी समकक्षों के लिए कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं । इस प्रकार, वे कार्यात्मक संक्रामकता के उत्कृष्ट सरोगेट हैं । कूटलिखित कणों आम तौर पर रेट्रोवायरस जैसे पैतृक मॉडल वायरस से व्युत्पंन कर रहे है (mlv7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 और लेंटीवायरस मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस — एचआईवी23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , ३२ , ३३ , ३४ , ३५) या रैब्डोवाइरस (vesicular स्टेमाइटिस वायरस-vsv३६,३९,४०,४१,४२,४३,४४ , ४५ , ४६ , ४७). जब कूटलेखन में प्रयोग किया जाता है, पैतृक वायरस ' जीनोम आवश्यक जीन को हटाने के लिए संशोधित कर रहे हैं, उंहें एक पूर्ण प्रतिकृति चक्र पूरा करने के लिए दोषपूर्ण प्रतिपादन । यह सुविधा उन्हें मध्यवर्ती जैव सुरक्षा स्तर की सुविधाओं (बीएसएल-2) में इस्तेमाल करने की अनुमति देती है और अत्यधिक रोगजनक देशी विषाणुओं का उपयोग करने पर एक महत्वपूर्ण लाभ है जो उच्च जैव सुरक्षा सुविधाओं (बीएसएल-3, बीएसएल-4 की आवश्यकता होती है जो आसानी से उपलब्ध नहीं हैं) जब वायरस प्रवेश अध्ययन का आयोजन । यहां, एस प्रोटीन के जोखिम समूह 3 रोगजनकों सार्स-cov और mers-cov वायरल लिफाफा प्रोटीन के उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है mlv स्यूडोटाइप कणों में शामिल, सार्स सृजन एस और MERS-cov एस स्यूडोविरियंस (sars-spp और mers-spp, क्रमशः) । इन स्यूडोविरियनों को सफलतापूर्वक इन वायरस४८,४९,५०,५१के प्रवेश की घटनाओं पर ध्यान केंद्रित कर अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है । एक और लाभ यह है कि तकनीक यहां वर्णित है कि कोरोनावायरस एस प्रोटीन कूटलेखन करने के लिए सीमित नहीं है: यह बहुत लचीला है और वायरल फ्यूजन प्रोटीन के सभी तीन वर्गों के प्रतिनिधियों को शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरणों में इंफ्लूएंजा hemagglutinin (हा, कक्षा मैं)५२, ebola वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी कक्षा मैं), alphavirus सेमलीकी वन वायरस के E1 प्रोटीन (sfv, द्वितीय श्रेणी), और vsv ग्लाइकोप्रोटीन (जी, कक्षा III)५३शामिल हैं । इसके अलावा, एक से अधिक प्रकार के वायरल ग्लाइकोप्रोटीन को एक स्यूडोटाइप कण में सह-शामिल किया जा सकता है, जैसा कि इंफ्लूएंजा हा-और एनए-स्यूडोटाइप कणों५१के मामले में होता है ।
bartosch एट अल.20द्वारा प्रदर्शन किया काम के आधार पर, इस प्रोटोकॉल एक तीन plasmid सह-transfection व्यापक रूप से उपलब्ध है और अत्यधिक transfection-सक्षम हेक-293t सेल लाइन का उपयोग कर रणनीति के साथ mlv pseudotyped कणों की पीढ़ी का वर्णन ५४. पहले प्लाज्मिड mlv कोर जीन गैग और पीओएल encodes लेकिन mlv लिफाफा encodes जीन का अभाव है । दूसरा प्लाज्मिड एक स्थानांतरण सदिश है कि एक जुगनू luciferase रिपोर्टर जीन encodes, एक mlv Ψ-आरएनए पैकेजिंग संकेत, साथ 5 '-और 3 '-flanking mlv लांग टर्मिनल दोहराने (ltr) क्षेत्रों । तीसरे प्लाज्मिड ब्याज के फ्यूजन प्रोटीन encodes, इस मामले में या तो सार्स-cov एस या MERS-cov एस प्रोटीन. तीन plasmids का एक अभिकर्मक अभिकर्मक, वायरल आरएनए और प्रोटीन का उपयोग करने के सह-अभिकर्मक पर पारफेक्टेड कणों के उत्पादन की अनुमति कोशिकाओं के भीतर व्यक्त हो । चूंकि mlv स्यूडोविरिओन रीढ़ के रूप में प्रयोग किया जाता है, यह प्लाज्मा झिल्ली पर होता है: luciferase जीन रिपोर्टर और पैकेजिंग सिग्नल युक्त rnas नवजात कणों में समझाया जाता है जो प्लाज्मा झिल्ली को भी शामिल करते हैं-व्यक्त कोरोनाविरस स्पाइक प्रोटीन. कणों कि कोशिकाओं से बाहर कली उनकी सतह पर कोरोनाविरस एस प्रोटीन होते हैं और संक्रामकता assays में उपयोग के लिए काटा जाता है । क्योंकि कूटलिखित कणों को कोरोनाविरस एस प्रोटीन बंदरगाह और नहीं mlv लिफाफा प्रोटीन, कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया, वे प्रवेश कदम के लिए अपने मूल कोरोनाविरस समकक्षों की तरह व्यवहार करते हैं । वायरल आरएनए लूसिफेरेज़ रिपोर्टर और अगल बगल लटर्स युक्त तो सेल के भीतर जारी किया है और रेट्रोवाइरल पॉलीमरेज़ गतिविधियों के डीएनए और मेजबान सेल जीनोम में एकीकरण में अपने रिवर्स प्रतिलेखन सक्षम । संक्रमित कोशिकाओं में वायरल स्यूडोटाइप कणों की संक्रामकता का quantification तो एक सरल luciferase गतिविधि परख के साथ प्रदर्शन किया है । क्योंकि डीएनए अनुक्रम है कि मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत हो जाता है केवल luciferase जीन और mlv या कोरोनाविरस प्रोटीन-एंकोडिंग जीन में से कोई भी शामिल है, वे स्वाभाविक प्रतिकृति से उपयोग करने के लिए सुरक्षित है-सक्षम देशी वायरस ।
सुरक्षित surrogates और उच्च लिफाफे के विभिंन प्रकार के निगमन की अनुमति के लिए अनुकूलनीय होने के अलावा नच, छद्म यहां वर्णित कणों भी अत्यधिक बहुमुखी है और वायरस प्रविष्टि के कई पहलुओं का अध्ययन किया जा सकता है । यह शामिल है, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं है: वायरस के संक्रमण के लिए मेजबान सेल संवेदनशीलता का परीक्षण, सेलुलर प्रवेश रास्ते का विश्लेषण एक घिरा वायरस का उपयोग करता है, औषधीय inhibitors और दवा स्क्रीनिंग के प्रभाव का अध्ययन, बेअसर एंटीबॉडी का आयोजन assays, आवरण वायरस है कि सभ्य नहीं किया जा सकता है, और जीन वितरण, ब्याज के जीन की स्थिर सेलुलर अभिव्यक्ति, या जीन silencing के लिए वायरल वैक्टर पैदा की विशेषता मेजबान सेल प्रविष्टि ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1213px;" width="1212">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:419px;">Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells&#160;</td>
			<td style="width:287px;">ATCC</td>
			<td style="width:155px;">CRL-11268</td>
			<td style="width:353px;">Clone 17 cells are highly competent for transfection.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human hepatic Huh-7 cells&#160;</td>
			<td>Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition</td>
			<td>JCRB0403</td>
			<td style="width:353px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted light microscope with 10 &#215; objective&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#39;s medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>1614071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethanesulphonic acid (HEPES)&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#215; penicillin-streptomycin (PS) solution</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 &#215; solution&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:419px;">Cell counting slides with grids&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Kova</td>
			<td style="width:155px;">87144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-minimal essential medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45 &#181;m pore-size sterile filter&#160;</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10 mL syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5 &#215; luciferase assay lysis buffer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luciferin, substrate for luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile water&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E476-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GloMax 20/20 luminometer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>2030-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting

प्रोटोकॉल को व्यापक रूप से उपलब्ध hek-293t सेल लाइन के एक सरल अभिकर्मक प्रक्रिया का उपयोग कर, एक murine ल्यूकेमिया वायरस (mlv) कोर और luciferase रिपोर्टर के साथ कोरोनावायरस (cov) स्पाइक (एस) फ्यूजन प्रोटीन स्यूडोटाइप कणों उत्पन्न करने के लिए करना है । एक बार का गठन किया और निर्माता कोशिकाओं से जारी, इन स्यूडोविरिओन एक luciferase रिपोर्टर जीन शामिल. चूँकि वे केवल उनकी सतह पर विषमजातीय कोरोनाविरस स्पाइक प्रोटीन होते हैं, अतः कणों के प्रवेश चरणों के लिए उनके देशी कोरोनाविरस समकक्षों की तरह व्यवहार करते हैं. इस तरह के रूप में, वे मेजबान कोशिकाओं में वायरल प्रवेश का अध्ययन करने के लिए देशी virions के उत्कृष्ट surrogates हैं । लक्ष्य कोशिकाओं में सफल प्रवेश और संक्रमण पर, luciferase रिपोर्टर मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत हो जाता है और व्यक्त की है । एक साधारण luciferase परख का उपयोग करना, transduced कोशिकाओं को आसानी से quantified जा सकता है । इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इस तरह के मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस (MERS-cov) के रूप में उच्च रोगजनक कोरोनावायरसों के साथ काम के लिए आवश्यक सुविधाएं बीएसएल-3 सुविधाओं के बजाय जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल-2) सुविधाओं में किया जा सकता है और गंभीर एक्यूट श्वसन सिंड्रोम कोरोनाविरस (सार्स-सीओवी) । एक और लाभ अपनी बहुमुखी प्रतिभा से आता है के रूप में यह लिफाफा प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है वायरल फ्यूजन प्रोटीन के सभी तीन वर्गों से संबंधित, इस तरह के वर्ग के रूप में मैं इंफ्लूएंजा hemagglutinin (हा) और ebola वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी), वर्ग द्वितीय सेमलीकी वन वायरस E1 प्रोटीन, या कक्षा III vesicular स्टेमाइटिस वायरस जी ग्लाइकोप्रोटीन । कार्यप्रणाली की एक सीमा यह है कि यह केवल वायरस प्रविष्टि लिफाफा प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता कदम पुनर्निमित कर सकते है जांच की जा रही है । अन्य वायरल जीवन चक्र चरणों का अध्ययन करने के लिए, अन्य तरीकों की आवश्यकता है । कई अनुप्रयोगों के उदाहरण इन छद्म प्रकार कणों में इस्तेमाल किया जा सकता है मेजबान सेल संवेदनशीलता और अनुवर्तन की जांच शामिल है और वायरस प्रवेश inhibitors के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए वायरल प्रवेश रास्ते काटना इस्तेमाल किया ।

एसएआरएस-सीओवी एस और MERS-सीओवी एस स्यूडोटाइप कणों के संक्रामकता assays के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1में दिखाया गया है । के रूप में की उंमीद है, दोनों चित्रा 1ए और 1bके लिए, vsv जी pseudotyped सकारात्मक नियंत्रण कणों (vsv-gpp) 106 से 107 रिश्तेदार luciferase इकाइयों (rlu) रेंज में बहुत उच्च औसत संक्रामकता दी क्रमशः । सार्स के लिए-सीओवी एस स्यूडोटाइप कणों (चित्रा 1ए) अतिसंवेदनशील वेरो-E6 कोशिकाओं का संक्रमण, एक मजबूत औसत संक्रामकता लगभग ९.८ x 104 rlu पर मापा गया था । यह मान गैर-संक्रमित नियंत्रण (१.१ x 102 rlu), या (१.५ x 102 rlu) के लिए मापा गया मान से अधिक परिमाण के लगभग 3 आदेश है, जो किसी भी वायरल लिफाफा उनके सतह पर नच बंदरगाह नहीं है । इसी प्रकार, MERS-cov S स्यूडोटाइप कणों के लिए (चित्रा 1ख) हं-7 कोशिकाओं का संक्रमण, एक उच्च औसत संक्रामकता लगभग १.० x 106 rlu पर मापा गया था । यह गैर-संक्रमित नियंत्रण (०.८ x 102 rlu), या (२.० x 102 rlu) के लिए मापा गया मान से अधिक परिमाण के लगभग 4 आदेश है । एक अतिरिक्त संक्रामकता परख का प्रदर्शन किया गया जिसमें सार्स-एसपीपी और MERS-spp प्रश्नपत्र पतला था और वेरो-E6 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया (चित्रा 2ए) । इस परख पुष्टि की है कि luciferase गतिविधि मापा कणों की एकाग्रता पर निर्भर है कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया । एंजियोटेनसिन परिवर्तित एंजाइम की भूमिका की पुष्टि करने के लिए 2 (ACE2) और dipeptidyl पेप्टिडेस 4 (DPP4), सार्स के रिसेप्टर्स-cov और MERS-cov, क्रमशः, mediating लगाव और स्यूडोटाइप कणों की प्रविष्टि में, हम खराब-permissive hek-293t कोशिकाओं का इस्तेमाल किया और उन्हें ट्रांसफेक्टेड या तो ACE2 या DPP4 (चित्रा 2बी) व्यक्त करने के लिए । ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं तो एक संक्रामकता परख के लिए इस्तेमाल किया गया । इस विश्लेषण को दर्शाता है कि ACE2 और DPP4 के overexpression पर, वहां एक ~ 4-लॉग और ~ 2-sars के लिए लॉग वृद्धि-spp और MERS-spp संक्रामकता, क्रमशः, पुष्टि कि स्यूडोविरिओन के रिसेप्टर उपयोग देशी वायरस के समान है ।
यहां दिखाए गए उदाहरणों में नकारात्मक (गैर-संक्रमित, δ env कणों) के साथ-साथ सकारात्मक नियंत्रण (vsv-gpp) शर्तों को शामिल करने के महत्व को प्रदर्शित करता है जब स्यूडोटाइप कणों का उत्पादन होता है । वास्तव में, सकारात्मक नियंत्रण vsv-gpp कणों हम का आकलन करने के लिए कि क्या छद्म कणों का एक विशेष बैच कार्यात्मक और संक्रामक स्यूडोविरिओन उपज में सफल था की अनुमति देते हैं । सबसे स्तनधारी कोशिका लाइनों में vsv-gpp कणों द्वारा ठेठ संक्रमण के अपेक्षित परिणाम 106− 107 rlu रेंज में हैं । hek के साथ कोई समस्या-293t/17 उत्पादक कोशिकाओं (उच्च मार्ग संख्या, सेल घनत्व के साथ मुद्दों) या गरीब अभिकर्मक क्षमता समग्र pseudotyped कण उत्पादन और संक्रामकता प्रभाव कर सकते हैं । इसके अलावा, नकारात्मक नियंत्रण की स्थिति भी महत्वपूर्ण है के रूप में वे हमें एक विशेष सेल लाइन में rlu माप के आधाररेखाओं का आकलन करने की अनुमति (गैर संक्रमित हालत) और गैर कणों के विशिष्ट internalization (δ env संक्रमण) जो मध्यस्थता नहीं है एक वायरल लिफाफा प्रोटीन से । आदर्श रूप में, एक दिए गए प्रकार के कण के लिए एक वायरल लिफाफा ब्याज के प्रोटीन के साथ स्यूडोटाइप, यह मान प्राप्त करने के लिए अनुशंसित है कि नकारात्मक नियंत्रण मूल्यों से अधिक परिमाण के कुछ आदेश हैं, जैसा कि यहाँ चित्र 1ए, बीमें दिखाया गया है । हालांकि, यदि किसी दिए गए सेल प्रकार के लिए एक स्यूडोटाइप वायरस संक्रमण बहुत कम संक्रामकता देता है (यानी, नकारात्मक नियंत्रणों के करीब जैसे चित्रा 2बी में गैर-ट्रांसफेक्टेड n.t. शर्तों) इसका मतलब यह नहीं है कि स्यूडोटाइप कण उत्पादन दोषपूर्ण था । यह अच्छी तरह से हो सकता है कि विशेष रूप से सेल इस्तेमाल किया लाइन नहीं है या खराब संक्रमण के लिए स्वतंत्र । यह जांच करने के लिए अनुशंसित है कि क्या किसी दिए गए सेल प्रकार के वायरस की जांच की जा रही द्वारा संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होने की उम्मीद है । प्लाज्मिड (एस) वायरल रिसेप्टर व्यक्त (ओं) के साथ खराब स्वतंत्र कोशिकाओं transfecting अधिक कुशल वायरल प्रवेश और संक्रमण होने की अनुमति कर सकते हैं, के रूप में चित्रा 2बीमें दिखाया गया है, जहां ACE2 और लक्ष्य hek में DPP4 रिसेप्टर्स के transfecting पर-293t कोशिकाओं, वहां एक ~ 4-और ~ 2-संक्रामकता में प्रवेश के लिए क्रमशः वृद्धि हुई है ।
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>प्लाज्मिड अभिकर्मक</td>
			<td>मात्रा</td>
		</tr>
<tr>
<td>pcmv-mlvgagpol mlv झूठ और पीओएल एन्कोडिंग प्लाज्मिड</td>
			<td>३०० एनजी</td>
		</tr>
<tr>
<td>ptg-luc स्थानांतरण वेक्टर luciferase रिपोर्टर के साथ</td>
			<td>४०० एनजी</td>
		</tr>
<tr>
<td>pcdna-सार्स-एस, pcdna-MERS-s या खाली वेक्टर</td>
			<td>३०० एनजी</td>
		</tr>
<tr>
<td>कम सीरम कोशिका संवर्धन माध्यम</td>
			<td>से ५० μl</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: plasmids की मात्रा और कम सीरम कोशिका संस्कृति मध्यम एक अच्छी तरह से एक 6-hek के एक अच्छी तरह से थाली-293t के लिए आवश्यक/ प्लाज्मिड तैयारी की एकाग्रता से, प्लाज्मिड डीएनए की आवश्यक मात्रा तक पहुंचने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें । एक से अधिक अच्छी तरह से एक ही plasmids के साथ transfected है, तो, transfected करने के लिए कुओं की आवश्यक संख्या से गुणा मात्रा, और बाद में चरणों में मिश्रण से बाहर चलने से बचने के लिए गणना में एक अतिरिक्त अच्छी तरह से शामिल हैं । डीएनए की कुल मात्रा को ट्रांसफेक्टेड किया जा रहा है 1 μg/ plasmids लेखकों के अनुरोध पर उपलब्ध हैं ।
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>अभिकर्मक</td>
			<td>मात्रा</td>
		</tr>
<tr>
<td>ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक</td>
			<td>3 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>कम सीरम कोशिका संवर्धन माध्यम</td>
			<td>४७ μl</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 2: अभिकर्मक अभिकर्मक की मात्रा और कम सीरम कोशिका संस्कृति मध्यम एक अच्छी तरह से एक 6-hek के अच्छी तरह से थाली-293t के लिए आवश्यक/ transfect और बाद के चरणों में मिश्रण से बाहर चलने से बचने के लिए गणना में अतिरिक्त कुओं को शामिल करने के लिए कुओं की आवश्यक संख्या से गुणा मात्रा. ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक: इस्तेमाल किया प्लाज्मिड डीएनए अनुपात 3:1 है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig1.jpg"> चित्रा 1 : कोरोनावायरस एस-स्यूडोटाइप कण संक्रामकता अतिसंवेदनशील मेजबान कोशिकाओं में एक मूरीन ल्यूकेमिया वायरस (mlv) रीढ़ और luciferase रिपोर्टर जीन का उपयोग कर assays । (क) सार्स-सीओवी एस स्यूडोटाइप कण वेरो-E6 कोशिकाओं में संक्रामकता परख । (B) MERS-cov S स्यूडोटाइप कण में संक्रामकता परख हं-7 कोशिकाओं । (A) और (B) दोनों के लिए, प्लॉट किए गए डेटा मानक विचलन (s.d.) के संगत त्रुटि पट्टियों के साथ, तीन स्वतंत्र प्रयोगों से औसत सापेक्ष luciferase इकाइयों से संबंधित होते हैं. y-अक्ष पर लॉग10 स्केल में प्लॉट किए गए डेटा । n.i.: गैर-संक्रमित नियंत्रण; δ env: छद्म के साथ संक्रमण वायरल लिफाफा नच और vsv-gpp कमी कणों: सकारात्मक नियंत्रण vsv जी लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन असर छद्म टाइप कणों के साथ संक्रमण. अंय संक्षिप्त नाम इस्तेमाल किया, सार्स-spp: सार्स के साथ संक्रमण-cov एस स्यूडोटाइप कणों, mers-spp: mers-cov एस स्यूडोटाइप कणों के साथ संक्रमण । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig2.jpg"> चित्रा 2 : सार्स-एसपीपी और MERS-एसपीपी प्रविष्टि में ACE2 और DPP4 रिसेप्टर्स की एकाग्रता-सीओवी एस-स्यूडोविरिओन संक्रामकता और भूमिका की निर्भरता । (क) सार्स-एसपीपी और MERS-एसपीपी संक्रामकता की एकाग्रता-निर्भरता luciferase गतिविधि परख द्वारा मापा जाता है । स्यूडोविरिओन प्रश्नपत्र पतला और वेरो-E6 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । (ख) सार्स की संक्रामकता परख-spp और MERS-खराब स्वतंत्र hek में spp-293t लक्षित कोशिकाओं को ACE2 एक्सप्रेस, और DPP4 रिसेप्टर्स, क्रमशः transfected । डेटा पर लॉग10 स्केल में y-अक्ष के रूप में चित्र 1 में डुप्लिकेट प्रयोगों से, मानक विचलन (s.d.) के संगत त्रुटि पट्टियों के साथ प्लॉट किए गए । n.t.: गैर ट्रांसफेक्टेड नियंत्रण hek-293t कोशिकाओं; ACE2: एंजियोटेनसिन परिवर्तित एंजाइम 2 (सार्स-cov रिसेप्टर) और DPP4: dipeptidyl पेप्टिडेस 4 (MERS-cov रिसेप्टर). अंय संक्षिप्त रूप में चित्र 1के समान ही हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।</a>

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Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

जैव सुरक्षा स्तर 2 की स्थापना में अत्यधिक रोगजनक कोरोनावायरस का अध्ययन करने के लिए स्यूडोटाइप कणों का उत्पादन

यहां, हम एक बीएसएल-2 उच्च रोगजनक वायरस मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम और गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस के स्पाइक प्रोटीन को शामिल करने की स्थापना में स्यूडोटाइप कणों उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इन कूटलिखित कणों एक luciferase रिपोर्टर जीन लक्ष्य मेजबान कोशिकाओं में वायरस प्रविष्टि के परिमाणन की अनुमति होते हैं ।

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को छद्म प्रकार के वायरस उत्पन्न करने की अनुमति देता है जिसका उपयोग अत्यधिक रोगजनक वायरस की वायरल प्रवेश घटनाओं जैसे साल कोरोनावायरस और सबसे कोरोनावायरस का अध्ययन करने के लिए सुरक्षित रूप से किया जा सकता है। यह बहुमुखी तकनीक आसान सेटअप क्षणिक ट्रांसफैक्शन पर आधारित है। इस प्रणाली को अन्य वायरस के संलयन प्रोटीन के साथ छद्म प्रकार के कणों का उत्पादन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, न केवल कोरोनावायरस एस सर्वोत्तम परिणामों के लिए यह ट्रांसफेक्शन के लिए सेल स्वास्थ्य और घनत्व की निगरानी के साथ-साथ छद्म प्रकार वायरस संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है।इस प्रक्रिया का प्रदर्शन टिफ़नी तांग, और लक्ष्मी नाथन होगा । मेरी प्रयोगशाला से स्नातक छात्रों। शुरू करने के लिए, ध्यान से 37 डिग्री सेल्सियस के 10 मिलीलीटर के साथ HEK293T कोशिकाओं को धोएं, पूर्व गर्म DPBS दो बार।इसके बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 25% ट्राइपसिन समाधान के एक मिलीलीटर के साथ संलग्न करें जिसे 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म किया गया है। की तुलना में, तीन से पांच मिनट के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं के फ्लास्क इनक्यूबेट जब तक कोशिकाओं को अलग शुरू करते हैं । ट्राइप्सिन समाधान को निष्क्रिय करने के लिए पूर्ण डीएमईएम के चार मिलीलीटर जोड़ें।और फिर एक सेल गिनती स्लाइड और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती । पूर्ण डीएमईएम के साथ 500, 000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर के लिए पतला कोशिकाओं। इसके बाद, 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट में सेल समाधान के प्रति दो मिलीलीटर बीज।और धीरे-धीरे प्लेट को आगे और पीछे ले जाएं और समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए साइड में जाएं। यह सुनिश्चित करने के बाद कि कोशिकाओं को समान रूप से वितरित किया जाता है ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर्यावरण रातोंरात या 16 से 18 घंटे पर थाली इनक्यूबेट । तीन प्लाज्मिड कोट्रांस्फेक्शन को प्रीफॉर्म करने के लिए, पहले मिक्स कैल्डमिड्स की मात्रा और माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में कम सीरम सेल कल्चर मीडियम ।मिश्रण को कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर कम सीरम सेल कल्चर मीडियम के प्रति कुएं में लिपिड आधारित ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के प्रति तीन माइक्रोलीटर जोड़ें। मिश्रण को कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।इसके बाद, एक माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में, ट्रांसफैक्शन रिएजेंट की बराबर मात्रा और पाइप द्वारा प्लाज्मिड समाधान को कई बार ऊपर और नीचे की ओर बढ़ाते हुए मिलाएं। मिश्रण को कमरे के तापमान पर 20 मिनट तक इनक्यूबेट करें। सेल प्लेट के रातभर इनक्यूबेशन के बाद, उनके आकृति विज्ञान और घनत्व के लिए कोशिकाओं की जांच करने के लिए एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।फिर, कोशिकाओं के खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और धीरे-धीरे प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्व-गर्म कम सीरम सेल संस्कृति माध्यम के प्रति एक मिलीलीटर जोड़ें। इसके बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से ड्रॉप वार में ट्रांसफेक्शन समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। और चार से छह घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड में ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट ।इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक कुएं में 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म एंटीबायोटिक मुक्त ट्रांसफैक्शन डीएमईएम का एक मिलीलीटर जोड़ें। और 48 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट। छद्म प्रकार के कणों का संग्रह शुरू करने के लिए एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए उनके आकृति विज्ञान और सामांय हालत के लिए कोशिकाओं की परीक्षा ।माध्यम का रंग हल्का गुलाबी या थोड़ा नारंगी होना चाहिए। फिर, संक्रमित कोशिकाओं के अधिनाटियों को 50 मिलीलीटर शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें। सेल मलबे को हटाने के लिए सात मिनट के लिए २९० बार गुरुत्वाकर्षण पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र ।इसके बाद, फिल्टर एक बाँझ 0.45 माइक्रोन पोर आकार फिल्टर के माध्यम से supernatant स्पष्ट किया। क्रायो शीशियों में छद्म प्रकार वायरस समाधान के छोटे वॉल्यूम एलिकोट्स बनाएं। और उन्हें नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।छद्म प्रकार के कण संक्रमण को करने के लिए, प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत पहली परीक्षा कोशिकाओं की पुष्टि करने के लिए कि कोशिकाओं का एक ढुलमुल कालीन है। फिर, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म डीपीबीएस के 0.5 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं। इसके बाद, कोशिकाओं के अधिनाटों को एएसपाइप करें और गल गए छद्म प्रकार के कण समाधान के 200 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को टीका लगाएं।एक से दो घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन अवधि के बाद, पूर्व गर्म डीएमईएमसी के 300 माइक्रोलीटर 37 डिग्री सेल्सियस पर जोड़ें। और 72 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड में 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित कोशिकाओं को इनक्यूबेट।अंत में संक्रमित कोशिकाओं के अधिनाटियों को एस्पिरेट करें। और लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर परख से पहले । छद्म प्रकार के कणों की संक्रामकता को निर्धारित करने के लिए पहले ल्यूसिफ़ेरिन सब्सट्रेट को पिघला दिया, जो शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होता है, पांच समय में लूसिफ़ेरेस परख लाइसिस बफर कमरे के तापमान में शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस तक संग्रहीत होता है।फिर, लूसिफ़ेरेस परख लाइसिस बफर को बाँझ पानी के साथ एक बार एकाग्रता के लिए पतला करें। इसके बाद, प्रत्येक कुएं में पतला बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। और 15 मिनट के लिए एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट ।लूसिफ़ेरेस गतिविधि माप करने के लिए, एक समय में अच्छी तरह से, पहले एक माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में लूसिफ़ेरिन सब्सट्रेट के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसके बाद ट्यूब में लस् ट के 10 माइक्रोलीटर डालें। धीरे-धीरे ट्यूबों को फ्लिक करके सामग्री मिलाएं।और ट्यूब को एक ल्यूमिनोमीटर डिवाइस में रखा। ढक्कन को बंद करें और ट्यूब के ल्यूमिनेसेंस मूल्य को मापें। सापेक्ष प्रकाश इकाइयों माप रिकॉर्ड, और डेटा विश्लेषण करने से पहले।अतिसंवेदनशील मेजबान कोशिकाओं में सार्स-स्पीप और मर्स-स्प्प की संक्रमण परख ने अपेक्षित सकारात्मक नियंत्रण कणों की तुलना में एक मजबूत औसत संक्रमण दिखाया। गैर संक्रमित नियंत्रण और वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन की कमी वाले नकारात्मक नियंत्रण कण। इसके अलावा लूसिफ़ेरेस गतिविधि परख सार्स-Spp और मर्स-Spp संक्रमित की एकाग्रता निर्भरता दिखाया ।खराब स्वतंत्र लक्ष्य कोशिकाओं में सार्स-एसपीपी या मर्स-एसपीपी संक्रमितता की वृद्धि, सार्स-एसपीपी के ACE2 रिसेप्टर, या मर्स-एसपीपी के डीपीपी 4 रिसेप्टर को व्यक्त करने के लिए संक्रमित, इस बात की पुष्टि करता है कि छद्म वायरस का रिसेप्टर उपयोग लगाव और छद्म वायरस के प्रवेश में मध्यस्थता करने के लिए नाटो वायरस के समान है। इस चरण को करने से पहले दोहरी जांच गणना। और सुनिश्चित करें कि सभी समाधान कदम के दौरान अच्छी तरह से मिश्रित हैं।छद्म वायरस में एस ग्लाइकोप्रोटीन समावेश का आकलन करने के लिए केंद्रित छद्मता कणों पर एक पश्चिमी दाग परख किया जा सकता है। हालांकि यहां वर्णित छद्म प्रकार के कण नाटो वायरस की तुलना में सुरक्षित किराए हैं, उन्हें अभी भी जैव रक्षा स्तर दो सावधानियों की आवश्यकता है ।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

पैकेजिंग एचआईवी या FIV आधारित Lentivector अभिव्यक्ति constructs और VSV जी Pseudotyped वायरल कणों की transduction

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

एक<em&gt; इन विट्रो में</emमानव बृहतभक्षककोशिका भेदभाव और ध्रुवीकरण की विविधता का अध्ययन करने के&gt; मॉडल

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

सुरक्षा सावधानियों और एक (ए) में संचालन प्रक्रिया बीएसएल 4 प्रयोगशाला: 1. जैव सुरक्षा स्तर 4 सूट प्रयोगशाला सुइट प्रवेश और निकास प्रक्रिया

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Tetracistronic Minigenomes युक्त वायरस की तरह कणों के साथ जैव सुरक्षा स्तर 2 शर्तों के तहत Ebola वायरस के जीवन चक्र मॉडलिंग

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

एक उपंयास फीडर इन विट्रो में Murine प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए मुफ्त प्रणाली

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

इसके रोगजनक तंत्र के अध्ययन के लिए बीएएलबी /सी चूहों में दवा-प्रेरित, ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस का प्रेरण

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

इन विट्रो लिखित एमआरएनए के साथ प्राथमिक मैक्रोफेज का अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

अत्यधिक रोगजनक एच5एन1 और एवियन एच7एन9 वायरस से लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन के साथ उच्च टिटर संक्रामक इन्फ्लूएंजा स्यूडोटाइप कणों का उत्पादन

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

स्थिरता और बैट मेजर Histocompatibility जटिल वर्ग की संरचना विषमβ 2-माइक्रोग्लोबुलिन के साथ

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

डबल लेबलिंग Immunofluorescence मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक ही प्रजाति से एंटीबॉडी का उपयोग कर

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...