Name: production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting
Uploaded: 2019-03-01T12:30:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить всех членов Уиттакер и Даниэль labs за полезные замечания. Исследования финансировались НИЗ предоставляет R21 AI111085 и R01 AI135270. Т.т. признает поддержку от президентских стипендий науки о жизни в Корнелльском университете и национального научного фонда выпускников исследовательских стипендий программа под Грант № DGE-1650441. Л.н. отмечает поддержку от Samuel C. Флеминг семьи стипендий и национального научного фонда выпускников исследовательских стипендий программа под № Грант DGE-1650441. Эта работа также поддерживается национальной науки фонд 1504846 (чтобы с.д. и G.R.W.).

Авторы не имеют ничего сообщать.

Этот протокол описывает метод для эффективного производства pseudotyped частицы, с учетом белка S риска Группа 3 коронавирус, ТОРС-CoV и РВК-CoV, в обстановке BSL-2. Эти частицы, которые включают Люцифераза Репортер ген, позволяют нам легко количественно коронавирус S-опосредованной запись событий по сравнительно простой Люцифераза пробирного48,49,50,51. В инфективности анализов с использованием разрешительной клеток мы подтверждаем, что Люцифераза активности измеряется зависит от концентрации частиц. Кроме того ACE2 и DPP4 рецептор трансфекции позволяет эффективнее запись в плохо разрешительной клеточных линий, таких как ГЭС 293T клетки. Этот метод хорошо адаптируется к других вирусных конверт гликопротеинов и широко используется,48,49,50,51,52,53 55,56,,5758,59, часто для того, чтобы дополнять другие анализы как биохимические анализы или родной вирусных инфекций.
Протокол, мы описали здесь основан на ретровируса MLV, который включает Люцифераза репортер. Однако важно подчеркнуть, что существует весьма широкий спектр других pseudotyping систем, которые были успешно разработаны для упаковки коронавирус S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 и других вирусных конверт гликопротеинов10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. Некоторые из этих других систем основаны на часто используемые MLV ретровирусной ядро7,8,9,10,11,12,13 ,14,,1516,,1718,19,20, или на основе широко используемых лентивирусные ВИЧ-1 pseudotyping системы, используя различные стратегии23,24,25,26,27,28,29,30 ,,3132,33,34,35, или с rhabdovirus вирусом везикулярного стоматита (ВСВ) как ядро, которое позволяет включать широкий конверт гликопротеинов и снова с различными стратегиями занято37,,3839,40,,4142,43 ,-44,-45,-46,-47. Кроме того другие репортеры такие как флуоресцентные белки как GFP11,13 и ППП36или ферменты помимо Люцифераза как β-галактозидазы16,17 и выделяется щелочная фосфатаза (СЕАП)42 успешно применялись для измерений. Кроме того в assay, представленные в настоящем Протоколе, переходных transfection был использован выразить MLV и CoV S генов и белков. Однако есть другие стратегии для выражения, например создание стабильных клеточных линий для производства pseudotyped вирусов7,14. Поскольку каждая из этих систем имеют свои преимущества и недостатки, важно учитывать следующие важные параметры при принятии решения, какой лучший системы pseudotyping потребностям следователя: pseudovirion ядра (MLV, ВИЧ-1, виллах или другие), как селективный особое pseudotyping лежит в включения конкретных вирусный конверт гликопротеин, репортер пробирного индикация (GFP, Люцифераза, ППОС или другой) и трансфекции стратегии (количество плазмидов, участвующих в совместно трансфекции, переходные Трансфекция или поколения стабильных клеточных линий).
Существует ряд важных шагов в методе, которые важно подчеркнуть. Плотность клеток, особенно по линии клетки продюсер ГЭС 293T/17 является решающим фактором в обеспечении успешного transfection. Было установлено, что плотность ячеек в диапазоне 40 – 60% confluency быть оптимальным. Более высокой плотности обычно приводят к низкой трансфекции эффективность и низкий частиц производства. Кроме того важно иметь в виду, что ГЭС 293T/17 клетки являются менее адэрентных чем других клеточных линий. Следует проявлять осторожность при обработке их во избежание отсоединения их излишне. Одним из вариантов является для лечения клетки культуры пластиковых поверхностей с поли D-Лизин для повышения соблюдения. Кроме того выше ячейки проход часто приводит к плохой трансфекции ставок. После добавления реагента transfection клетки ГЭС 293T/17, важно также помнить, что увеличивает проницаемость клеток. Именно в этот момент лучше всего избегать использования средних содержащих антибиотики, как они могут увеличить цитотоксичности. Прежде чем собирать pseudotyped частицы, проверьте цвет transfected supernatants клетки ГЭС 293T/17. Как правило после 48 ч трансфекции, цвет ячейки питательной среды занимает оранжево розовый оттенок. Желтый цвет среднего обычно переводится как бедных pseudotyped частицы урожайности и часто является результатом проблем с посева плотность или высокий проход номер ячейки.
В этом протоколе производство pseudotyped частиц осуществляется в формате 6-ну пластины. Для увеличения объема производства частиц, несколько скважин 6-ну плиты можно transfected смесью же плазмидов и supernatants могут быть объединены вместе. Бассейн может быть уточнено, отфильтрованные и aliquoted. Кроме того для расширения производства вверх, другие виды судов (например, 25 или 75 см2 фляги) может использоваться. В этом случае условия transfection должен быть масштабируется соответственно. В настоящем Протоколе инфективности генотипирования с помощью формат 24-ну пластины и Люминометр, что позволяет только измерения одной трубы одновременно. Для фильмов высокой пропускной способности другие форматы также возможны, как формат 96-луночных пластины и Люминометр читателя пластины. Тома и реагенты для assay Люцифераза необходимо адаптировать соответствующим образом. Pseudotyped частиц в криопробирки-80 ° c для хранения сохраняет их стабильность в течение нескольких месяцев без заметное снижение инфекционности. Не рекомендуется подвергать их замораживания оттаивания циклов, как это будет уменьшаться с течением времени их инфективности. Таким образом, лучше хранить их в небольших аликвоты например 0,5 – 1 мл и размораживать их перед инфекцией.
Представленные здесь метод имеет некоторые ограничения. Важным является тот факт, что pseudotyped частицы резюмировать только вирусные записи события. Чтобы проанализировать другие шаги в жизненном цикле инфекционные, требуются другие анализы. Кроме того как MLV частицы бутон на плазматической мембраны, важно иметь в виду, что конверт гликопротеин, изучаются потребности также движением к плазматической мембраны для включения в pseudovirions в процессе производства. Таким образом важно знать, где в ячейке конкретного вирусного конверт гликопротеин выражается в трансфекции условий, такие как визуализация субцеллюлярные локализации с помощью иммунофлуоресцентного анализа, и/или проверка для сохранения сигналов в течение белка. Кроме того в то время как протокол описывает шаги для создания и тестирования инфективности, он не подробно, как измерить включению вирусных конверт гликопротеинов pseudotyped частиц. Один метод — выполнить иммуноблоттинга анализов на концентрированные растворы частиц, как описано в50,51 для включения РВК-CoV S. В этих анализов S конверт гликопротеина об РВК-CoV является зондируемой наряду с капсид (p30) белка MLV, которые позволяют нам нормализовать белка S включения частиц. Другие примеры таких анализов, анализа вирусной конверт гликопротеина включения в pseudovirions были выполнены для включения ТОРС-CoV S в ВИЧ-1 лентивирусные pseudovirion системы32 , Эбола гликопротеина (GP) в другой MLV pseudotyped системы частиц17и гриппа гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) в виллах pseudovirions38. Последние развития в характеризующих производство pseudotyped частиц является использование инновационных тепловизионных устройств, таких как Nanosight: он позволяет нам непосредственно визуализировать, количественно и размер вирусных частиц50. Устройство предоставляет подробную информацию о целом частиц производства; Однако важно иметь в виду, что он не представить информацию о включении гликопротеина оболочки. Будущее направление для применения этих универсальных pseudovirion частиц является анализ отдельных вирусный фьюжн событий с помощью одной частицы отслеживания, микрофлюидика и полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии60,61 ,62. Такие подходы были успешно применены к вируса гриппа и кошачьих коронавирус частиц, а также гриппа ха - и NA-pseudotyped на базе VSV pseudovirions63. Развертывание таких методов применяется к коронавирус S-pseudotyped на основе MLV частиц в настоящее время разрабатывается.

Запись узла клеток представляет собой первоначальные шаги вирусных инфекционных жизненного цикла. Для оболочечных вирусов это включает связывание с рецепторами клеток одного узла или нескольких рецепторов, а затем сочетание вирусных и клеточных мембран. Эти основные функции осуществляются вирусный конверт гликопротеинов1,2. Коронавирус гликопротеина оболочки называется белка Спайк (S) и является членом класса я вирусный синтез белков2,3,4,5,6. Изучая вирусный конверт гликопротеинов имеет решающее значение для понимания многих важных характеристик данного вируса, такие как: начало жизненного цикла, его хост и клеточного тропизма, Межвидовая передача, вирусный патогенеза, а также принимающей ячейки записи пути. Вирусный pseudotyped частиц, также названный pseudovirions, являются мощными инструментами, которые позволяют нам легко изучить функции вирусных синтеза белков. Pseudotyped частицы или pseudovirions являются химерных вирионы, которые состоят из суррогатного вирусный ядро с гетерологичных вирусный конверт белков на их поверхности. Основной целью протокола является показать, как получить коронавирус шип pseudotyped частицы, которые основаны на ядре мышиных лейкемии Вирус (МЛВ) и содержат Люцифераза Репортер ген. Представлены примеры, способ получения pseudotyped частиц с белками Спайк высоко патогенного тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС) и Ближнего Востока коронавирус респираторного синдрома (РВК). Протокол описывает трансфекции процедур, как заразить восприимчивы целевой ячейки и количественная оценка инфективности Люцифераза assay.
Поскольку запись шаги pseudovirions регулируются коронавирус S на их поверхности, они введите клетки аналогичным образом исходными аналогами. Как таковые они являются отличным суррогаты функциональных инфективности анализов. Pseudotyped частицы обычно являются производными от родительской модели вирусов, таких как ретровирусы (MLV7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 и вирус иммунодефицита человека — ВИЧ23,24,25,26,27,,2829 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) или rhabdoviruses (вирус везикулярного стоматита — VSV36,39,40,41,42,,4344 , 45 , 46 , 47). при использовании в pseudotyping, геномов родителей вирусов изменяются для удаления важно генов, делая их дефектных для выполнения цикла полной репликации. Эта функция позволяет им использоваться в промежуточном биобезопасности уровня удобства (BSL-2) и является важным преимуществом над использованием родной высоко патогенные вирусы, которые требуют больше удобства биобезопасности (BSL-3, BSL-4, который не так легко доступны) при проведение исследований вирус вход. Здесь, S белки риска группы 3 возбудителей ОРВИ-CoV и РВК-CoV используются в качестве примеров вирусного конверт белков, включаются в MLV pseudotyped частицы, генерации ТОРС-CoV S и S РВК-CoV pseudovirions (атипичной пневмонии-Spp и РВК-Spp, соответственно). Эти pseudovirions были успешно использованы в исследованиях, посвященных запись событий эти вирусы48,49,,5051. Еще одним преимуществом является, что метод, описанный здесь не ограничивается pseudotyping коронавирус S белки: она является очень гибким и может использоваться для включения представителей всех трех классов вирусных синтеза белков. Примеры включают гриппа гемагглютинина (га, класс I)52, гликопротеин вирус Эбола (GP класса I), E1 белков вируса Семлики лес альфавирус (SFV, класс II), и VSV гликопротеина (G, класс III)53. Кроме того, более чем один вид вирусных гликопротеина может быть совместно включены в pseudotyped частицы, как и в случае с гриппа ха-NA - pseudotyped частиц51.
Опираясь на работы, выполняемые Бартошем et al.20, этот протокол описывает поколения MLV pseudotyped частиц с трех плазмида Сопредседатель трансфекции стратегии, с помощью широко доступных и высококомпетентных transfection ГЭС 293T клеток линии 54. Первый плазмид кодирует MLV основных генов кляп и ГСМ , но не хватает MLV конверт env гена. Второй плазмида является передача вектор, который кодирует Светлячок Люцифераза Репортер ген, сигнал упаковки MLV Ψ-РНК, наряду с 5'- и 3'-фланговые MLV долго терминала повторить (LTR) регионах. Третий плазмида кодирует протеин сплавливания интереса, в этом случае либо ТОРС-CoV S или S РВК-CoV белок. После совместного трансфекции трех плазмид, с помощью трансфекции реагента вирусной РНК и белков получить выразил в пределах transfected клеток, позволяя поколения pseudotyped частиц. С MLV используется в качестве pseudovirion, это происходит на плазматической мембраны: РНК, содержащие Люцифераза гена репортера и упаковки сигнал получить инкапсулирован в зарождающейся частицы, которые также включают плазматической мембраны выразил коронавирус Спайк белки. Частицы, которые бутон из клетки содержат белок коронавирус S на их поверхности и собирают для использования в инфективности анализов. Потому что pseudotyped частицы гавани коронавирус S белков и не MLV конверт белков, когда используется для заражения клеток, они ведут себя как их родной коронавирус коллегами для записи шагов. Вирусной РНК содержащие Люцифераза репортер и фланговые л затем выпущен в ячейке и антиретровирусным полимеразы мероприятия позволяют его обратная транскрипция ДНК и интеграции в геном клетки хост. Количественная оценка инфекционности вирусных pseudotyped частиц в инфицированных клетках затем выполняется с простой Люцифераза активности assay. Поскольку последовательность ДНК, которая получает интегрированы в геном клетки хост содержит только Люцифераза гена и никто из MLV или коронавирус генов белков кодирования, они изначально безопаснее использовать чем репликации компетентных родной вирусов.
Помимо того, что более безопасных заменителей и хорошо адаптируется к позволить включение различных видов конвертов гликопротеинов, pseudotyped частиц, описанные здесь также весьма разносторонни и может использоваться для изучения многих аспектов въезда вирус. Это включает, но не ограничивается: тестирование принимающей ячейки восприимчивость к инфекции вируса, анализ клеточных запись пути использует оболочечных вирусов, изучение воздействия фармакологических ингибиторы и наркотиков показы, проведение нейтрализации антител анализы, характеризующие принимающей ячейки вход оболочечных вирусов, которые не могут быть культивировали и генерации вирусных векторов для доставки генов, стабильных клеточных экспрессии генов интерес, или заставлять замолчать гена.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1213px;" width="1212">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:419px;">Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells&#160;</td>
			<td style="width:287px;">ATCC</td>
			<td style="width:155px;">CRL-11268</td>
			<td style="width:353px;">Clone 17 cells are highly competent for transfection.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human hepatic Huh-7 cells&#160;</td>
			<td>Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition</td>
			<td>JCRB0403</td>
			<td style="width:353px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted light microscope with 10 &#215; objective&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#39;s medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>1614071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethanesulphonic acid (HEPES)&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#215; penicillin-streptomycin (PS) solution</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 &#215; solution&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:419px;">Cell counting slides with grids&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Kova</td>
			<td style="width:155px;">87144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-minimal essential medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45 &#181;m pore-size sterile filter&#160;</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10 mL syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5 &#215; luciferase assay lysis buffer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luciferin, substrate for luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile water&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E476-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GloMax 20/20 luminometer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>2030-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting

Протокол призван генерировать коронавирус (CoV) Спайк (S) синтез белка pseudotyped частиц с мышиных лейкемии Вирус (МЛВ) ядро и Люцифераза репортер, используя простой трансфекции процедура широко доступны ГЭС 293T клеток линии. После того, как формируется и освобождены от производителя клетки, эти pseudovirions включают Люцифераза Репортер ген. Так как они содержат только гетерологичных коронавирус Спайк белка на их поверхности, частицы ведут себя как их родной коронавирус коллегами для записи шагов. Таким образом они являются отличным суррогаты родной вирионы для изучения вирусной вступления в клетки хозяина. После успешного входа и инфекции в клетки-мишени репортер Люцифераза получает интегрированы в геном клетки хост и выражается. С помощью простой Люцифераза пробирного, transduced клетки могут быть легко количественно. Важным преимуществом процедуры является, что она может быть выполнена в области биобезопасности уровня 2 зал (BSL-2) вместо BSL-3 объекты, необходимые для работы с высоко патогенного коронавирус, таких, как Ближний Восток респираторный синдром коронавирус (РВК-CoV) и коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (атипичной пневмонии-CoV). Еще одно преимущество происходит от его универсальность, как он может быть применен к конверт белков, принадлежащих всех трех классов вирусных синтез белков, таких как класс я гриппа гемагглютинина (HA) и Эбола вирус гликопротеина (GP), вирус лес Семлики II класса E1 белок, или гликопротеина G вирус везикулярного стоматита III класса. Ограничением методологии является, что она может только резюмировать вирус вход шаги при посредничестве конверт белков проводится расследование. Для изучения других вирусных жизненного цикла действия, требуются другие методы. Многие приложения, которые эти псевдотипов частицы могут быть использованы в примеры расследований принимающей ячейки восприимчивость и тропизма и тестирования эффекты ингибиторов вирус вход для того чтобы рассечь вирусный вход пути используется.

Представитель результаты анализов инфективности ТОРС-CoV S и S РВК-CoV pseudotyped частицы показано на рисунке 1. Как и ожидалось, для обоих Рисунок 1A и 1 b, VSV G pseudotyped позитивного управления частицы (VSV-Gpp) дал очень высокий средний инфективности в 10 диапазон6 – 107 относительной Люцифераза единиц (RLU) соответственно. Для ТОРС-CoV S pseudotyped частиц (рис. 1А) инфекции восприимчивы клеток Веро-E6, сильный средний инфективности была измерена на примерно 9,8 х 104 RLU. Это значение является почти 3 порядка выше, чем значения измеренных элемента-инфицированных (1.1 x 102 RLU), или Δenv частиц (1,5 х 102 RLU), которые не питают гликопротеинов любой вирусный конверт на их поверхности. Аналогично, для РВК-CoV S pseudotyped частиц (рис. 1Б) инфекции ха-7 клеток, высокий средний инфективности была измерена на около 1,0 x 106 RLU. Это почти 4 порядка выше, чем значения измеренных элемента-инфицированных (0,8 x 102 RLU), или Δenv частиц (2.0 x 102 RLU). Дополнительные инфективности assay была исполнена в котором ТОРС-Spp и РВК-Spp были последовательно разбавленный и используется для заражения клеток Веро-E6 (рисA). Этот assay подтверждает, что действие Люцифераза измеряется зависит от концентрации частиц для заразить клетки. Чтобы подтвердить роль ангиотензин преобразования ферментов 2 (ACE2) и dipeptidyl пептидаза 4 (DPP4), рецепторы ТОРС-CoV и РВК-CoV, соответственно, в посредничестве, вложения и записи pseudotyped частиц, мы использовали плохо разрешительной ГЭС 293T клетки и transfected их выразить ACE2 или DPP4 (рис. 2B). Transfected клеток были затем использованы для assay инфективности. Этот анализ показывает, что по гиперэкспрессии ACE2 и DPP4, есть ~ 4-журнал и ~ 2-журнал рост для ТОРС-Spp и РВК-Spp инфективности, соответственно, подтверждающий что рецептор использование pseudovirions похож на основном вирусов.
Приведенные здесь примеры свидетельствуют о важности включая отрицательные (неинфицированных, Δenv частицы) а также положительный контроль (VSV-Gpp) условия при производстве pseudotyped частиц. Действительно частицы положительный контроль VSV-Gpp позволяют нам оценить ли конкретной партии pseudotyped частиц был успешным, уступая функциональных и инфекционный pseudovirions. Ожидаемые результаты типичной инфекции VSV-Gpp частицами в наиболее mammalian клетки линии находятся в диапазоне RLU −107 106. Проблемы с ГЭС 293T/17 производитель клетки (высокий проход номер, проблемы с плотностью клеток) или бедных трансфекции эффективность может повлиять на общую pseudotyped частиц производства и инфективности. Кроме того отрицательный контроль условий также имеют важное значение, поскольку они позволяют нам оценить исходных RLU измерения в конкретной ячейке строки (неинфицированных условие) и неспецифические интернализации частиц (Δenv инфекции), которая не опосредованного на вирусный конверт белков. В идеале для данного типа частицы pseudotyped с вирусной конверт протеин интереса, он рекомендуется для получения значений, которые несколько порядков выше, чем отрицательный контроль значений, как показано в рисунке 1A, B. Однако если для данной ячейки типа pseudotyped вирус дает очень мало инфективности (т.е., закрыть отрицательные элементы управления такие, как показано на рисунке 2B в не transfected Н.Т. условий) это не обязательно означает, что pseudotyped производство частиц был ошибочен. Это может быть что конкретной клетки линии не является или плохо разрешительных к инфекции. Рекомендуется проверить ли тип заданной ячейки ожидается быть восприимчивы к инфекции вируса проводится расследование. Transfecting плохо разрешительной клетки с plasmid(s) выражая вирусных receptor(s) может позволить более эффективные вирусный вход и инфекции происходят, как показано в рисунке 2B, где по transfection ACE2 и DPP4 рецепторов в целевых ГЭС 293T клетки, есть ~ 4- и ~ 2-журнал увеличение инфективности, соответственно.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Плазмиды/реагент</td>
			<td>Количество</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCMV-MLVgagpol MLV кляп и Поль кодирования плазмиды</td>
			<td>300 нг</td>
		</tr>
<tr>
<td>pTG Люк передачу вектор с Люцифераза репортер</td>
			<td>400 нг</td>
		</tr>
<tr>
<td>pcDNA ТОРС-S, pcDNA РВК-S или пустой вектор</td>
			<td>300 нг</td>
		</tr>
<tr>
<td>Сокращение сыворотке клетки культуры среднего</td>
			<td>До 50 мкл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: количество плазмидов и сокращение сыворотке ячейки питательной среды, необходимые для transfect одной скважиной 6-ну плиты ГЭС 293T/17 клеток для производства pseudotyped частица. От концентрации препаратов плазмида рассчитайте необходимый объем для достижения необходимого количества плазмидной ДНК. Если более чем одна скважина является transfected с же плазмид, умножьте томов на необходимое количество лунок для transfect и включают в себя дополнительные скважины в расчеты, чтобы избежать исчерпания смеси в последующих шагах. Общее количество ДНК transfected-1 мкг/хорошо. Плазмиды предоставляются по запросу для авторов.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Реагент</td>
			<td>Количество</td>
		</tr>
<tr>
<td>Трансфекция реагент</td>
			<td>3 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Сокращение сыворотке клетки культуры среднего</td>
			<td>47 МКЛ</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: количество трансфекции реагента и сокращение сыворотке ячейки питательной среды, необходимые для transfect одной скважиной 6-ну плиты ГЭС 293T/17 клеток для производства pseudotyped частиц. Умножьте томов на необходимое количество лунок для transfect и включить дополнительные скважины в расчеты, чтобы избежать исчерпания смеси в последующих шагах. Трансфекция реагента: плазмида ДНК используется показатель 3:1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig1.jpg"> Рисунок 1 : Коронавирус S-pseudotyped частиц инфективности анализов в восприимчивых принимающей ячейки с помощью мышиных лейкемии Вирус (МЛВ) позвоночника и Люцифераза Репортер ген. (A) ТОРС-CoV S pseudotyped частиц инфективности пробирного в клетках Vero-E6. (B) РВК-CoV S pseudotyped частиц инфективности пробирного в клетках ха-7. Для обоих (A) и (B), печатаемых данных соответствует средняя относительная Люцифераза единиц от трех независимых экспериментов, с погрешностей, соответствующее стандартное отклонение (с.д.). Данные отображены в журнал10 шкалы на оси y. Н.и.: неинфицированных управления; Δenv: инфекции с pseudotyped частицами не хватает гликопротеинов вирусный конверт и VSV-Gpp: инфекции с pseudotyped частицами, учитывая положительный контроль VSV G гликопротеина оболочки. Другие аббревиатура используется, ТОРС-Spp: инфекции с ТОРС-CoV S pseudotyped частицы, РВК-Spp: инфекции с РВК-CoV S pseudotyped частиц. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig2.jpg"> Рисунок 2 : Концентрация зависимость инфективности CoV S-pseudovirion и роль рецепторов ACE2 и DPP4 в запись ТОРС-Spp и РВК-Spp. (A) концентрация зависимость ТОРС-Spp и РВК-Spp инфекционности измеряется Люцифераза деятельности пробирного. Pseudovirions серийно были разбавленный и используется для заражения клеток Веро-E6. (B) инфективности transfected ТОРС-Spp и РВК-СПП в плохо разрешительной ГЭС 293T клеток-мишеней для Экспресс ACE2 и DPP4 рецепторов, соответственно. Данные диаграмме в журнал10 шкалы на оси y как показано на рисунке 1 из повторяющихся экспериментов, с погрешностей, соответствующее стандартное отклонение (с.д.). Н.Т.: не transfected управления ГЭС 293T клетки; ACE2: ангиотензин-превращающего фермента 2 (атипичной пневмонии-CoV рецептор) и DPP4: dipeptidyl пептидаза 4 (РВК-CoV рецептор). Другие сокращения, используемые такие же, как на рисунке 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting at JoVE.com

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

Производство Pseudotyped частиц для изучения патогенного коронавирус в условиях 2-го уровня биобезопасности

Здесь мы представляем протокол для создания pseudotyped частиц в обстановке BSL-2, включающих Спайк белка высоко патогенные вирусы Ближнего Востока респираторного синдрома и тяжелый острый респираторный синдром коронавирус. Эти pseudotyped частицы содержат Люцифераза Репортер ген, позволяя количественного определения вирусов вступления в целевые клетки хозяина.

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Этот протокол позволяет исследователям генерировать псевдотипные вирусы, которые могут быть безопасно использованы для изучения вирусных событий вступления высоко патогенных вирусов, таких как саль коронавирус и большинство коронавирусов. Эта универсальная техника основана на легкой установке переходной трансфекции. Эта система также может быть применена для производства частиц псевдотипов с белками синтеза других вирусов, а не только коронавирус S.Для наилучших результатов важно контролировать здоровье клеток и плотность для трансфекции, а также для псевдотипа вирусной инфекции.Демонстрацией этой процедуры будет Тиффани Тан и Лакшми Натан. Аспиранты из моей лаборатории. Для начала тщательно промыть клетки HEK293T с 10 миллилитров 37 градусов по Цельсию, предварительно разогретые DPBS дважды.Далее, аспирировать супернатант и прикрепить клетки с одним миллилитр 25%трипсин раствор, который был предварительно нагревается при 37 градусов по Цельсию. Чем, инкубировать колбу клеток при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа окружающей среды в течение трех-пяти минут, пока клетки начинают отделяться. Добавьте четыре миллилитров полного DMEM для деактивации трипсиного раствора.А затем подсчитайте клетки с помощью слайда подсчета клеток и светового микроскопа. Разбавить клетки до 500 000 клеток на миллилитр с полным DMEM. Далее, семена два миллилитра на колодец клеточного раствора в 6-хорошо ткани культуры пластины.И осторожно перемещать пластину вперед и назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки. После убедившись, что клетки равномерно распределены инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа окружающей среды в одночасье или от 16 до 18 часов. Для преформы трех плазмидных котрансфекции первая смесь вычислила объемы плазмидов и пониженную среду культуры клеток сыворотки в микро центрифуге.Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте три микролитров на колодец липидного реагенция на основе трансфекции до 47 микролитров на колодец среды культуры клеток сыворотки. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение пяти минут.Далее, в микро центрифуге трубки, смешать равное количество трансфекции реагента и плазмидных растворов трубы заголовок вверх и вниз несколько раз. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 20 минут. После ночной инкубации клеточной пластины используйте перевернутый световой микроскоп для изучения клеток на их морфологию и плотность.Затем, аспирировать провел среды клеток и осторожно добавить один миллилитр на колодец предварительно разогретой снижение культуры клеток сыворотки среды для каждого хорошо. Далее добавьте 100 микролитров трансфектного раствора, чтобы каждый хорошо упал мудрым. И инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение четырех-шести часов.В конце инкубации добавьте один миллилитр предварительно разогретой антибиотиков свободной трансфекции DMEM, при 37 градусах Цельсия к каждой хорошо. И инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение 48 часов. Для начала сбора псевдотипных частиц используйте перевернутый световой микроскоп для обследования клеток на их морфологию и общее состояние.Цвет среды должен быть светло-розовый или слегка оранжевый. Затем перенесите супернатанты трансфицированных клеток в 50 миллилитров конических центрифугных трубок. Центрифуга труб в 290 раз тяжести в течение семи минут, чтобы удалить клеточный мусор.Далее фильтр уточнил супернатант через стерильный фильтр размером 0,45 микрона. Сделайте небольшие объемные алициты псевдотипного вирусного раствора в крио-флаконах. И хранить их при отрицательных 80 градусов по Цельсию.Для выполнения псевдотипной инфекции частиц, первые клетки экзамена под световым микроскопом, чтобы подтвердить, что есть слияние ковер клеток. Затем трижды промыть клетки 0,5 миллилитров предварительно разогретого DPBS при 37 градусах цельсия. Далее аспирируют супернатанты клеток и прививают клетки 200 микролитров раствора талых псевдотипированных частиц.Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение одного-двух часов. После инкубации добавьте 300 микролитров предварительно разогретого DMEMc при 37 градусах Цельсия. И инкубировать инфицированные клетки при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение 72 часов.Наконец аспирировать супернатанты инфицированных клеток. И предшествуют люциферазы репортер анализа. Для количественной оценки инфекционности псевдотипических частиц сначала оттепель люциферина субстрата, хранящегося при температуре минус 80 градусов по Цельсию, в пять раз люцифераза анализ лиза буфер хранится при минус 20 градусов по Цельсию до комнатной температуры.Затем разбавьте буфер анализа люциферазы до одной концентрации стерильной водой. Затем добавьте 100 микролитров разбавленного буфера к каждой колодец. И инкубировать при комнатной температуре на рокере в течение 15 минут.Для выполнения измерения активности люциферазы, по одному хорошо за один раз, сначала добавьте 20 микролитров люциферина субстрата в микро центрифугу трубки. Затем добавьте в трубку 10 микролитров лизата. Смешайте содержимое, аккуратно стряхивая трубки.И поместил трубку в люминометрное устройство. Закройте крышку и измерьте значение люминесценции трубки. Завехать измерение относительных световых единиц и предшествовать анализу данных.Инфекционные анализы ТОРС-СПП и БВРС-Спп в восприимчивых клетках-хозяинах показали сильную среднюю инфекционность по сравнению с ожидаемыми положительными контрольными частицами. Неин инфицированные элементы управления и отрицательные контрольные частицы, не имеющие вирусных гликопротеинов оболочки. Также анализы активности люциферазы показали концентрационную зависимость от инфекции ТОРС-Спп и БВРС-Спп.Увеличение инфекционности ТОРС-СПП или БВРС-Спп в плохо разрешительных целевых клетках, трансфицированных для выражения рецептора ACE2 ТОРС-Сппа, или рецептора DPP4 БВРС-Спп, подтверждает, что использование рецепторов псевдовирусов аналогично использованию вирусов НАТО для посредничества в крепления и ввода псевдовирусов. Двойные расчеты проверки перед выполнением этого шага. И убедитесь, что все решения смешиваются хорошо во время шага.Западный анализ помарки может быть выполнен на концентрированных псевдотипированных частицах для оценки включения S гликопротеина в псевдовирии. Хотя псевдотипные частицы, описанные здесь, являются более безопасными суррогатами, чем вирусы НАТО, они по-прежнему требуют мер предосторожности уровня биобезопасности.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Упаковка с ВИЧ или FIV основе Lentivector Конструкции выражения и трансдукции VSV-G Pseudotyped вирусных частиц

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения гетерогенности человека дифференциации макрофагов и поляризация

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Меры предосторожности и эксплуатационные процедуры в (A) BSL-4 лаборатории: 1. Уровень биологической безопасности 4 Костюм лабораторный люкс въезда и выезда Процедуры

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Моделирование жизненного цикла Эбола Вирус Меньше уровень биологической безопасности 2 Условия вирусом типа частиц, содержащих Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Индукция лекарственно-индуцированного аутоиммунного гепатита у мышей BALB/c для изучения его патогенных механизмов

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Высокоэффективная трансфекция первичных макрофагов с помощью In Vitro транскрибированная мРНК

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Производство высокотитерных инфекционных частиц гриппа Псевдотипированные с конвертами гликопротеинов из высокопатогенных вирусов H5N1 и Avian H7N9

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

Стабильность и структура Bat Major Histocompatibility Complex Class I с гетерологическим β2-Микроглобулин

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Двойная маркировка иммунофлуоресценции с использованием антител одного и того же вида для изучения взаимодействий хозяина и патогена

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...