Name: production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting
Uploaded: 2019-03-01T12:30:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting at JoVE.com

Tüm üyeleri, Whittaker ve Daniel labs yararlı yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. Araştırma fonları NIH tarafından sağlanan R21 AI111085 ve R01 AI135270 verir. T.T. Cumhurbaşkanlığı hayat bilgisi bursu Cornell Üniversitesi ve Ulusal Bilim Vakfı yüksek lisans araştırma bursu Program kapsamında hibe No desteğinden kabul eder. DGE-1650441. L.N. Samuel C. Fleming aile Yüksek Lisans Bursu ve Ulusal Bilim Vakfı yüksek lisans Araştırma Bursu Programı hibe No altında destek kabul eder. DGE-1650441. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı 1504846 (için S.D. ve G.R.W.) tarafından da desteklenir.

1. hücre Pseudotyped parçacık üretimi için tohum
Not: Biyogüvenlik kabini bu adımı gerçekleştirin.
<ol><li>Standart hücre kültürü teknikleri tarafından bir % 80 – 90 Konfluent 75 cm2 şişe tam Dulbecco pasajlı HEK-293T/17 hücre elde'nın modifiye kartal orta (DMEM-C) içeren %10 (vol/vol) fetal sığır serum (FBS), 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 100 IU/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin. DMEM-T orta (kompozisyon DMEM-C olarak ama Antibiyotikler olmadan aynıdır) transfections için hazır olun.</li>
	<li>Hücreleri 10 mL, Önceden ısıtılmış (37 ° C) Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile iki kez yıkayın. Not: Onlar kolayca ayırmak gibi HEK293T/17 hücreleri itina ile başa.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve 1 mL % 0.25 tripsin çözeltisi 37 ° C'de önceden ısınmış hücrelerle ayır Hücre şişeye 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka 3−5 min için veya hücreleri ayırma başlayana yerleştirin. Not: Bu genellikle hücre topaklanma için yol açar gibi tripsin daha--dan 5 min için hücrelerle kuluçka kaçının.</li>
	<li>Tripsin 4 mL DMEM-C orta ve sayısı hücre ışık mikroskobu ve slayt sayımı bir hücre kullanarak ekleyerek devre dışı bırakın. Not: Çok fazla hücreleri saymak zorunda kalmamak için bir ek seyreltme adım önceden gerekli olabilir. Trypsinized hücreleri gerçek hücre yoğunluğu hesaplanırken bu seyreltme faktörü unutmayın.</li>
	<li>5 x 105 hücre/mL DMEM-c ile hücrelere sulandırmak</li>
	<li>6-iyi doku kültürü plaka hücre çözümü de başına 2 mL ile tohum ve yavaşça plaka ileri geri hareket ve hücreleri, dairesel hareketlerle kaçınarak olarak dağıtabilmenizi yan. Not: Bu önemli bir adımdır. Eşit olarak dağıtılmış hücreler hücreleri wells merkezinde yığın değil sağlayacaktır. Buna karşılık, bu iyi transfection verimliliği ve pseudotyped parçacık sağlayacaktır üretim.</li>
	<li>Plaka gecede (16-18 h) bir 37 ° C'de % 5 CO2 hücre kültür kuluçka kuluçkaya.</li>
</ol>2. üç-plazmid co transfection
Not: Biyogüvenlik kabini bu adımı gerçekleştirin.
<ol><li>Hücreleri hücre morfolojisi ve yoğunluğu için kontrol etmek için bir ters ışık mikroskobu altında gözlemlemek. Not: İdeal olarak, hücre yoğunluğu % 40-60 confluency aralığında olmalıdır. Bu hücreler de çok olduğunu önemlidir birleşmesi (%80−90 birleşmesi) ne de çok seyrek dağıtılmış (%20−30 birleşmesi) her kuyuya. %40−60 confluency hücre yoğunluğu iyi pseudotyped parçacıklar üretim sağlayacaktır.</li>
	<li>
Plazmid mix
	<ol>
<li>Plazmid karıştırmak için bir kuyu miktarları Tablo 1' de gösterilen 6-şey plaka takip her zarf glikoprotein hesaplayın. Miktarları çarpma Eğer birkaç kuyu transfecting ve karışımı azalmasını önlemek için ilave bir şey dahil. Not: SARS-CoV S ve MERS-CoV plazmid kodlama S ile birlikte, boş vektör kontrolü gibi viral zarf glikoproteinlerin (Δenv parçacıklar) ile birlikte olumlu denetim glikoprotein eksikliği negatif kontrol parçacıkları oluşturulmasında içerir veziküler sağlam hücreleri (VSV-Gpp) çok geniş bir yelpazesi bulaştırmak için bilinen virüs (VSV) G glikoprotein Stomatit. Plazmid talep üzerine temin edilmektedir.</li>
		<li>Plazmid ve düşük serum hücre kültür orta ( Tablo malzemelerigörmek) hesaplanan miktarda bir microcentrifuge tüp içinde karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection lipid-esaslı reaktif mix (bkz. Tablo malzemeleri)<ol>
<li>Bu birim için Tablo 2 ' de bir şey (1:3 transfection oranı, çarpın gerektiği gibi miktarları) gösterilen miktarları transfection reaktif karışımından hesaplayın. Transfection reaktif karışımı azalmasını önlemek için ilave kuyu bulunmaktadır.</li>
		<li>Lipid tabanlı transfection reaktifi (iyi başına 3 µL) ve düşük serum hücre kültür orta (47 µL iyi başı) transfection reaktif düşük serum hücre kültür orta ve başka bir yol eklemek emin bir microcentrifuge tüp hesaplanan miktarda karıştırın etrafında.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her iki karışımları kuluçkaya (bir şey için: mix 50 µL Plazmidler ve mix 50 µL lipid tabanlı transfection reaktif) oda sıcaklığında 5 min için ayrı ayrı.</li>
	<li>1:1 oranında plazmid karışıma transfection reaktif mix içeriği ekleyin (1 iyi için: 50 µL her Mix)</li>
	<li>Tam yukarı-aşağı elde edilen karışımı pipetting gerçekleştirin.</li>
	<li>Karıştırmak için oda sıcaklığında en az 20 dk kuluçkaya.</li>
	<li>Hücre harcanan orta Aspire edin.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış (37 ° C) indirimli serum hücre kültür orta iyi başına yavaşça 1 mL ekleyin.</li>
	<li>Eklemek dropwise 100 µL her şey için transfection karışımı. Not: Onlar kolayca ayırmak gibi transfection mix HEK-293T kuyu için eklerken dikkatli olun.</li>
	<li>Hücreleri bir 37 ° C'de % 5 CO2 hücre kültür kuluçka için 4-6 h kuluçkaya.</li>
	<li>Antibiyotik içeren önceden ısıtılmış (37 ° C) DMEM-T orta kuyu başına 1 mL ekleyin Not: Bu önemli bir adımdır. Transfection reaktifler hücre geçirgenliği artırır ve antibiyotik duyarlılığı artırmak. İyi transfection verimlilik ve pseudotyped parçacık üretim emin olmak için hücre kültürü antibiyotik içeren orta kullanmamak önemlidir</li>
	<li>Hücreleri bir 37 ° C'de % 5 CO2 hücre kültür kuluçka 48 h için kuluçkaya.</li>
</ol>3. pseudotyped parçacıklar koleksiyonu
Not: Biyogüvenlik kabini bu adımı gerçekleştirin.
<ol><li>Hücreleri hücre morfolojisi ve genel durumu denetlemek için ters ışık mikroskop altında gözlemlemek. Ayrıca hafif olmalı orta renk kontrol pembe/biraz turuncu. Not: Bu önemli bir adımdır. Transfection ile ilgili çok fazla hücre ölümü veya turuncu/sarı (asidik pH) açık orta renk varsa, bu genellikle bulaşıcı pseudotyped parçacıkları daha düşük verimleri ile ilişkili olacaktır</li>
	<li>Transfected hücre supernatants 50 mL konik santrifüj tüpleri için transfer.</li>
	<li>Tüpler, 290 x g hücre artıkları kaldırmak 7 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Eritilmiş supernatants gözenek ölçekli steril 0,45 µm filtreden filtre.</li>
	<li>Küçük hacimli aliquots yapmak (e.g., 500 µL veya 1 mL) cryovials pseudotyped virüs çözüm.</li>
	<li>Mağaza-80 ° C'de Not: Protokol burada duraklatılmış. Pseudotyped parçacıklar aylarca-80 ° C'de sabit ama bir kez çözdürülen infektivite kaybederler gibi onları yeniden donma önlemek</li>
</ol>4. pseudotyped parçacık enfeksiyon duyarlı hücre
Not: Biyogüvenlik kabini bu adımı gerçekleştirin.
<ol><li>
24-şey plaka duyarlı hücrelerin hücre tohumlama
	<ol>
<li>Standart hücre kültürü teknikleri %80−90 Konfluent 75 cm2 şişeye duyarlı hücre tarafından elde etmek: Vero-E6 hücreler için SARS-CoV pseudotyped parçacıklar (SARS-Spp) ve ha-7 hücreleri MERS-CoV s pseudotyped parçacıklar (MERS-Spp). Not: Üretilen pseudotyped parçacıklar bulaşıcı olup olmadığını doğrulamak için dikkatli bir şekilde pseudovirion infektivite deneyleri için uygun duyarlı hücre satır seçmek önemlidir. Kötü izin veren hücreler kullanma için düşük infektivite yol açacaktır.</li>
		<li>Hücreleri iki kez Önceden ısıtılmış (37 ° C) DPBS 10 mL ile yıkayın.</li>
		<li>Süpernatant Aspire edin ve 1 mL % 0.25 tripsin çözeltisi 37 ° C'de önceden ısınmış hücrelerle ayır Hücre şişeye 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka 3−5 min için veya hücreleri ayırma başlayana yerleştirin. Not: Bu genellikle hücre topaklanma için yol açar gibi 5 dakikadan fazla tripsin hücrelerle kuluçka kaçının. Ha-7 hücreleri bu yönde özellikle duyarlıdır.</li>
		<li>Tripsin DMEM-C orta ve sayısı hücreleri ışık mikroskobu ve slayt sayımı bir hücre kullanarak ekleyerek devre dışı bırakın.</li>
		<li>5 x 105 hücre/mL DMEM-c ile hücrelere sulandırmak</li>
		<li>24-iyi tohum kuyu hücre çözümü de başına 0.5 mL ile plaka yavaşça plaka ileri geri hareket ve hücreleri, dairesel hareketlerle kaçınarak olarak dağıtabilmenizi yan Not: Bu önemli bir adımdır. Eşit olarak dağıtılmış hücreler hücreleri wells merkezinde yığın değil sağlayacaktır. Buna karşılık, bu iyi infektivite deneyleri sağlayacaktır. Her pseudotyped parçacık (SARS-Spp, MERS-Spp) ve koşul için üç kuyular için üç deneysel çoğaltır hazırlayın. Enfekte olmayan (nı), boş vektör Δenv parçacıklar ve VSV Gpp gibi olumlu denetim parçacıkların Wells dahil</li>
		<li>Plaka gecede (16−18 s) bir 37 ° C'de % 5 CO2 hücre kültür kuluçka kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pseudotyped parçacık enfeksiyon
	<ol>
<li>Hücreleri ışık mikroskop altında gözlemlemek ve görsel olarak hücre Konfluent halı olduğunu doğrulayın.</li>
		<li>Cryovials buz erimek için pseudotyped virüs getir.</li>
		<li>Yıkama hücreleri üç kez ile 0.5 mL (37 ° C) DPBS önceden ısındı Not: Bu önemli bir adımdır. Düzgün olmayan hücreler öncesinde enfeksiyon genellikle yoksul infektivite çıktıları için kurşun durulanır</li>
		<li>Hücre supernatants Aspire edin.</li>
		<li>Çözdürülen pseudotyped parçacık çözüm 200 µL hücrelerle aşılamak.</li>
		<li>Hücreleri bir 37 ° C'de % 5 CO2 hücre kültür kuluçka 1−2 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış (37 ° c) DMEM-C orta 300 µL ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri bir 37 ° C'de % 5 CO2 hücre kültür kuluçka 72 h için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. infektivite miktar Luciferase tahlil okuma tarafından
Not: Biyogüvenlik kabini ilk adımları atmış olursunuz.
<ol><li>Tezcan biyoluminesans substrat (-80 ° C'de depolanan) ve oda sıcaklığında ulaşmak (-20 ° C'de depolanan) 5 x luciferase tahlil lizis tampon onlar kadar.</li>
	<li>Luciferase tahlil lizis arabelleğe steril su ile 1 x oranında seyreltin.</li>
	<li>Supernatants pseudotyped parçacıkları ile enfekte hücreleri Aspire edin.</li>
	<li>1 x luciferase tahlil lizis arabelleği 100 µL her şey için ekleyin.</li>
	<li>(Plaka dışında bir biyogüvenlik kabini ele alınabilir bu noktadan itibaren) oda sıcaklığında sallanan ile 15dk için kuluçkaya ve plaka üzerinde bir rocker yerleştirin.</li>
	<li>Microcentrifuge tüpler her tüpte biyoluminesans substrat 20 µL ekleyerek her şey için hazır olun.</li>
	<li>Luminometer üzerinde açın.</li>
	<li>Luciferase etkinlik ölçümü bir de teker teker biyoluminesans substrat 20 µL içeren bir tüp lysate, 10 µL aktararak gerçekleştirin.</li>
	<li>Yumuşak içeriğini karıştırmak, ama sıvı tüp duvarlarında yerinden önlemek için tüp fiske.</li>
	<li>Cihazda tüpü yerleştirin ve kapağını kapatın.</li>
	<li>Tüp ışıldama değerini luminometer kullanarak ölçün.</li>
	<li>Göreli ışık biriminin ölçüm kaydedin.</li>
	<li>Bütün wells analiz 5.8-5.12 tamamlayana dek. Not: Luminometer okuma bir tabak gibi uygun ekipman ile bu işlemi otomatik olarak gerçekleştirilir. Tahlil plaka biçimi (örneğin, 96-şey plaka biçimi) ölçeklendirilmesi gerekecek.</li>
</ol>6. veri analizi
<ol><li>
Hesaplama ve çizme göreli luciferase birimlerinin ortalamaları ve standart sapmalar
	<ol>
<li>Bir grafik yazılımı komplo luciferase tahlil ölçüm ortalamasını alır ve standart sapmalar deneysel ve biyolojik çoğaltır hesaplamak için kullanın.</li>
		<li>Verileri standart sapmalar ile çubuk grafik olarak çizmek. Not: İstatistiksel analizler üzerinde veri işlemi sırasında veri kümelerinde en az üç biyolojik çoğaltır eklediğinizden emin olun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı etkin bir şekilde risk grubu 3 coronaviruses, SARS-CoV ve MERS-CoV, BSL-2 ortamda S protein taşıyan pseudotyped parçacıklar üretmek için bir yöntem açıklanır. Bir luciferase muhabir gen dahil, bu parçacıklar bize kolayca coronavirus S-aracılı giriş olayları bir nispeten basit luciferase tahlil48,49,50,51tarafından ölçmek sağlar. Keyfi hücreleri kullanarak infektivite deneyleri içinde ölçülen luciferase aktivite parçacıklar konsantrasyon bağımlı olduğunu doğrulayın. Ayrıca, ACE2 ve DPP4 reseptör transfection HEK-293T hücreleri gibi kötü keyfi hücreleri satırında daha verimli giriş için izin verir. Yöntem diğer viral zarf glikoproteinlerin son derece uyarlanabilir ve yoğun kullanılan48,49,50,51,52,53, kez biyokimyasal analizler veya yerel virüs enfeksiyonları gibi diğer deneyleri tamamlayacak 55,56,57,58,-59.
Biz burada tarif Protokolü retrovirüsü luciferase muhabir birleştirmek MLV dayanır. Ancak, ambalaj coronavirus için S12,13,25,26, başarılı bir şekilde geliştirilmiştir diğer pseudotyping sistemleri çok geniş bir dizi olduğunu vurgulamak önemlidir 30 , 31 , 32 ve diğer viral zarf glikoproteinlerin10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. bazı bu diğer sistemlerin sık kullanılan MLV retroviral çekirdek7,8,9,10,11,12,13 temel alan ,14,15,16,17,18,19,20, veya yaygın olarak kullanılan lentiviral HIV-1 tarihinde pseudotyping sistemi kullanarak farklı stratejiler23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, veya rhabdovirus vesicular Stomatit virüs ile (VSV) olarak çekirdek sağlayan çeşitli dahil etmek için Zarf glikoproteinlerin ve yine çeşitli stratejileri37,38,39,40,41,42,43 istihdam ,44,45,46,47. Buna ek olarak, diğer gazeteciler floresan proteinler gibi GFP11,13 ve RFP36veya luciferase β-galaktozidaz16,17 gibi başka enzimler gibi ve salgılanan alkalen fosfataz (SEAP)42 başarıyla istihdam için ölçümleri. Ayrıca, bu protokol için sunulan assay olarak, geçici bir transfection MLV ve CoV S genler ve proteinler ifade etmek için kullanılmıştır. Ancak, ifade, örneğin, üretim pseudotyped virüs7,14için kararlı hücre satır oluşturma için diğer stratejileri vardır. Bu sistemlerin her biri gibi avantaj ve dezavantajları, hangi pseudotyping sistemini en iyi dedektif'ın ihtiyaçlarınıza uygun karar verirken aşağıdaki önemli parametreleri dikkate almak önemlidir: pseudovirion çekirdek (MLV, HIV-1, VSV veya diğerleri), nasıl belirli pseudotyping çekirdek bir belirli viral zarf glikoprotein, tahlil okuma (GFP, luciferase, SEAP veya diğer) için muhabir ve transfection strateji (plazmid eş transfection, geçici yer sayısı birleştirilerek seçicidir transfection veya istikrarlı hücre hatları nesil).
Vurgulamak için önemli olan kritik adımları yöntemi vardır. Hücre yoğunluğu, özellikle HEK-293T/17 yapımcı hücre kültürünü başarılı transfection sağlanmasında önemli bir faktördür. Bir hücre yoğunluğu % 40-60 confluency aralığındaki en uygun bulundu. Daha yüksek yoğunlukları genellikle düşük transfection verimliliği ve düşük parçacık üretim neden. Ayrıca, HEK-293T/17 hücreler daha az çok diğer hücre satır yapisan akılda tutmak önemlidir. Bakım onları gereksiz yere ayırma önlemek için işlerken edilmelidir. Hücre kültürü plastik yüzeyler bağlılık geliştirmek için Poli-D-lisin ile tedavi etmek için bir seçenektir. Ayrıca, daha yüksek hücre geçiş genellikle yoksul transfection fiyatlarına sonuçları. Transfection reaktif HEK-293T/17 hücrelere ekledikten sonra Ayrıca hücre geçirgenliği artar hatırlamak önemlidir. Bu yüzden bu noktada sitotoksisite arttıkça orta içeren antibiyotik kullanmaktan kaçınmak en iyisidir. Pseudotyped parçacıklar toplama önce transfected HEK-293T/17 hücre supernatants rengini kontrol edin. Genellikle, transfection, 48 saat sonra hücre kültür orta rengi turuncu-pembe belirti alır. Sarı renkli orta genellikle yoksul pseudotyped parçacıklar verimleri için çevirir ve sık sık hücre yoğunluğu veya yüksek geçit numarası tohum ile ilgili sorunlar bir sonucudur.
Bu protokolünde pseudotyped parçacık üretim bir 6-şey plaka biçimde gerçekleştirilir. Üretilen parçacıklar hacmi artırmak için bir 6-şey plaka birkaç kuyu aynı plazmid karışımı ile transfected ve supernatants birlikte havuza alınmış. Havuz sonra açıklık, filtre uygulanmış ve bölünmemeli olabilir. Alternatif olarak, üretimi, gemiler, diğer tür ölçeklemek için (örneğin, 25 veya 75 cm2 şişe) kullanılabilir. Bu durumda, transfection koşullar buna göre ölçekli olmalıdır. Bu protokol için infektivite tahlil bir 24-şey plaka biçimi ve sadece bir defada bir tüp ölçümleri sağlayan bir luminometer kullanılarak gerçekleştirilir. Yüksek işlem hacmi gösterimleri için diğer formatlar da 96-şey plaka biçimi ve bir plaka okuyucu luminometer gibi mümkündür. Birimler ve luciferase tahlil Kimyasalları buna göre adapte gerekir. Depolama birimi cryovials-80 ° C'de pseudotyped parçacıkların onların istikrar infektivite belirgin azalma olmadan birkaç ay tutar. Onları donma-çözülme çevrimleri gibi bu zaman içinde onların infektivite azaltacaktır için tabi tavsiye edilmez. Böylece, onları küçük aliquots 0.5-1 gibi depolamak en iyi mL ve onları daha önce bir enfeksiyon çözülme.
Burada sunulan yöntem bazı sınırlamaları vardır. Önemli bir pseudotyped parçacıklar sadece viral giriş olayları özetlemek gerçektir. Bulaşıcı yaşam döngüsü içinde diğer adımları çözümlemek için diğer deneyleri gereklidir. Ayrıca, MLV parçacıklar bud, plazma zarı çıkarmamak önemlidir gibi ihtiyaçları da plazma zarı birleşme için içine pseudovirions üretim sırasında trafik okudu zarf glikoprotein yenilmemiz umurumda. Bu nedenle, nerede hücreye belirli viral zarf glikoprotein transfection koşullarda gibi bir ayirt tahlil ile hücre altı yerelleştirme görüntülenmesi, ve/veya saklama sinyalleri içinde denetleme ifade edilir bilmek önemlidir protein. Protokol üretmek ve infektivite test adımları açıklar iken, aynı zamanda, bu viral zarf glikoproteinlerin birleşme pseudotyped parçacıkları içine ölçmek ayrıntılı nasıl değil. Western blot deneyleri MERS-CoV S birleşme için yukarıda açıklanan50,51 olarak parçacıkların, konsantre çözümleri gerçekleştirmek için bir yöntemdir. Bu deneyleri MERS-CoV S zarf glikoprotein bize S protein birleşme parçacıklar halinde normalize etmek izin olan MLV, (p30) kapsid protein ile birlikte probed. Bu tür deneyleri viral zarf glikoprotein birleşme pseudovirions içine analiz diğer örnekleri bir HIV-1 lentiviral pseudovirion sistem32 , Ebola glikoprotein (GP) başka bir MLV pseudotyped içinde SARS-CoV S birleşme için gerçekleştirilen Parçacık sistemi17ve grip hemagglutinin (HA) ve neuraminidase (NA) VSV pseudovirions38. Pseudotyped parçacık üretim karakterize içinde bir yeni gelişme Nanosight gibi yenilikçi görüntüleme cihazları kullanılır: doğrudan görselleştirmek, ölçmek ve viral parçacıkların50boyutu bize sağlar. Cihazın genel parçacık üretim üzerinde ayrıntılı bilgi sağlar; Ancak, bu zarf glikoprotein birleşme üzerinde bilgi sağlamaz akılda tutmak önemlidir. Bu çok yönlü pseudovirion parçacıklar uygulanması için gelecekteki yönünü tek parçacık izleme, havacilik ve toplam iç yansıma Floresans mikroskobu60,61 kullanarak bireysel viral füzyon olayları analiz etmektir ,62. Bu tür yaklaşımlar grip HA - ve NA-pseudotyped VSV tabanlı pseudovirions63yanı sıra grip virüsü ve kedi coronavirus parçacıklar başarıyla uygulandı. Bu tür teknikler coronavirus S pseudotyped MLV tabanlı parçacıklar uygulanan dağıtım şu anda geliştirilmektedir.

Konak Hücre girişini bulaşıcı viral ömrünün ilk adımlar oluşturmaktadır. Saran virüs, bu bağlama için bir tek ana bilgisayar hücre reseptör veya birkaç reseptörleri, viral ve hücresel zarları füzyon tarafından takip içerir. Bu temel işlevler viral zarf glikoproteinlerin1,2tarafından yapılmaktadır. Coronavirus zarf glikoprotein spike (S) protein denir ve sınıf üyesi olan viral ben füzyon protein2,3,4,5,6. Viral zarf glikoproteinlerin eğitim çok önemli özellikleri belirli bir virüs gibi anlamak için kritik: yaşam döngüsü başlatma, kendi ev sahibi ve hücresel tropism, türler arası iletim, viral Patogenez yanı sıra ana hücre giriş yollar. Adı da pseudovirions, viral pseudotyped parçacıklar bize kolayca viral füzyon proteinlerin işlevi incelemek izin güçlü araçlardır. Pseudotyped partikülleri veya pseudovirions bir vekil viral çekirdek Contegra viral zarf protein onların yüzeyde oluşan chimeric virions vardır. Protokolün temel amacı elde etme göstermektir coronavirus spike bir fare lösemi virüs (MLV) çekirdeğini temel alır ve bir luciferase muhabir gen içeren pseudotyped parçacıklar. Örnek olarak, spike proteinler yüksek patojenik şiddetli akut solunum Sendromu (SARS) ve Orta Doğu solunum Sendromu (MERS) coronaviruses ile pseudotyped parçacıklar üretmek için yöntem sunulmaktadır. Protokol transfection yordam hücreleri duyarlı hedef bulaştırmak için nasıl, yer ve infektivite miktar luciferase tahlil tarafından açıklanır.
Pseudovirions giriş adımlardan onların yüzeyde coronavirus S tarafından yönetilir beri onlar yerel meslektaşları benzer şekilde hücre girin. Bu nedenle, onlar fonksiyonel infektivite deneyleri mükemmel vekilleri vardır. Pseudotyped parçacıklar genellikle ebeveyn modeli virüs Retrovirüsler (MLV7,8,9,10,11,12,13 gibi türetilir , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 ve lentivirus insan immün yetmezlik virüsü — HIV23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) veya rhabdoviruses (vesicular Stomatit virüs — VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). pseudotyping içinde kullanıldığında, ebeveyn virüslerin genleri gerekli genler, onları tam çoğaltma döngüsü gerçekleştirmek için arızalı işleme kaldırmak için değiştirilir. Bu özellik onları (BSL-2) ara biyogüvenlik düzeyi tesislerinde kullanılmak üzere sağlar ve daha yüksek Biyogüvenlik İmkanları (BSL-3, BSL-4 olarak kolayca kullanılabilir değil) gerektiren yüksek patojenik yerel virüs kullanarak önemli bir avantaj olduğu zaman virüs giriş çalışmalar yürütmektedir. Burada, grup riski S proteinlerin 3 patojenler SARS-CoV ve MERS-CoV MLV dahil ediliyor viral zarf proteinleri örnekleri olarak kullanılır pseudotyped parçacıklar, SARS-CoV ve MERS-CoV leri pseudovirions üreten (SARS-Spp ve MERS-Spp, sırasıyla). Bu pseudovirions başarılı bir şekilde giriş bu virüs48,49,50,51olaylara odaklanan çalışmalarda kullanılmaktadır. Burada açıklanan tekniği pseudotyping coronavirus S proteinler için sınırlı değildir başka bir avantajdır: çok esnek ve viral füzyon protein tüm üç sınıf temsilcileri dahil etmek için kullanılabilir. Grip hemagglutinin örnekler (HA, sınıf ı)52, Ebola virüsü glikoprotein (GP sınıf ı), E1 protein alphavirus Semliki orman virüs (SFV, sınıf II) ve VSV glikoprotein (G, Sınıf III)53. Ayrıca, birden fazla tür viral glikoprotein grip gibi durumunda ortak pseudotyped bir parçacık dahil olabilir HA - ve NA - pseudotyped parçacıklar51.
Bartosch ve ark.20tarafından gerçekleştirilen çalışmalara dayanarak, bu iletişim kuralını açıklar MLV nesil pseudotyped parçacıkları yaygın olarak bulunur ve son derece transfection yetkili HEK 293T kullanarak bir üç-plazmid co transfection stratejisi ile hücre satırı 54. ilk plazmid MLV çekirdek genler gag ve pol kodlar ama MLV zarf env gen yoksun. İkinci plazmid ile birlikte 5' bir MLV Ψ-RNA ambalaj sinyal bir ateş böceği luciferase muhabir gen kodlar bir transfer vektörü olduğu- ve 3'-kanat MLV uzun terminal tekrar (LTR) bölgeler. Üçüncü plazmid füzyon protein ilgi, bu durumda da SARS-CoV S veya MERS-CoV S protein kodlar. Ortak transfection transfection reaktif kullanarak üç Plazmidler, viral RNA ve proteinler pseudotyped parçacıklar nesil izin transfected hücrelerde ifade. MLV pseudovirion bel kemiği olarak kullanıldığından, bu plazma zarı oluşur: luciferase gen muhabir ve ambalaj sinyal içeren RNA'ların Ayrıca plazma zarı ifade coronavirus spike dahil doğmakta olan parçacıklar halinde kapsüllenmiş proteinler. Hücrelerden bud parçacıklar onların yüzeyde coronavirus S protein içerir ve kullanılmak üzere infektivite deneyleri hasat. Çünkü pseudotyped parçacıklar liman coronavirus S protein ve değil MLV zarf protein, hücreleri bulaşmasını için kullanıldığında, yerel coronavirus karşılıkları için giriş merdiven gibi davranıyorlar. Viral RNA luciferase muhabir içeren ve LTRs kanat sonra hücre içinde serbest bırakılır ve onun ters transkripsiyon DNA içine ve konak hücre genomu entegrasyonu retroviral polimeraz faaliyetleri etkinleştirin. Enfekte hücreleri pseudotyped parçacıklar viral infektivite miktar sonra basit luciferase etkinliği tahlil ile gerçekleştirilir. Luciferase gen ve MLV veya coronavirus protein kodlama genler hiçbiri sadece konak hücre genomu entegre DNA dizisi içerdiğinden, onlar doğal olarak çoğaltma yetkili yerel virüs kullanmak daha güvenli.
Daha güvenli vekilleri olmanın yanı sıra ve çeşitli zarf glikoproteinlerin birleşmesiyle izin vermek son derece uyarlanabilir, burada açıklanan pseudotyped parçacıklar da çok yönlü ve virüs giriş birçok yönlerini incelemek için kullanılır. Bu içerir ancak bunlarla sınırlı değildir: virüs enfeksiyonu konak hücre duyarlılık test, saran bir virüs kullanır hücresel giriş yolları analiz, farmakolojik inhibitörleri ve uyuşturucu gösterimleri etkileri eğitimi, nötralizasyon antikor iletken konak Hücre girişini kültürlü cant saran virüslerin karakterize ve gen teslim için viral vektörler üreten deneyleri, hücresel ifade faiz veya gen susturmak genlerin kararlı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1213px;" width="1212">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:419px;">Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells&#160;</td>
			<td style="width:287px;">ATCC</td>
			<td style="width:155px;">CRL-11268</td>
			<td style="width:353px;">Clone 17 cells are highly competent for transfection.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human hepatic Huh-7 cells&#160;</td>
			<td>Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition</td>
			<td>JCRB0403</td>
			<td style="width:353px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted light microscope with 10 &#215; objective&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#39;s medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>1614071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethanesulphonic acid (HEPES)&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#215; penicillin-streptomycin (PS) solution</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 &#215; solution&#160;</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:419px;">Cell counting slides with grids&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Kova</td>
			<td style="width:155px;">87144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-minimal essential medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45 &#181;m pore-size sterile filter&#160;</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10 mL syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5 &#215; luciferase assay lysis buffer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Luciferin, substrate for luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile water&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E476-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GloMax 20/20 luminometer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>2030-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting

Protokol amaçlamaktadır coronavirus (CoV) Başak (S) füzyon proteini oluşturmak için yaygın olarak kullanılan HEK-293T, basit transfection yordamı kullanarak fare lösemi virüs (MLV) çekirdek ve luciferase muhabir, pseudotyped parçacıkları hücre satırı. Bir kez oluşan ve yapımcı hücrelerden serbest bırakmak, bu pseudovirions bir luciferase muhabir gen dahil. Yalnızca içerdikleri beri onların yüzeyinde protein Contegra coronavirus spike, parçacıklar giriş adımlar için yerel coronavirus karşılıkları gibi davranırlar. Bu nedenle, onlar konak hücreleri viral girdiği eğitim için yerel virions mükemmel vekilleri vardır. Başarılı girmek ve enfeksiyon hedef hücreleri içine, luciferase muhabir konak hücre genomu entegre ve ifade edilir. Basit luciferase tahlil kullanarak, transduced hücreleri kolayca sayısal. Biyogüvenlik içinde gerçekleştirilebilir yordam önemli bir avantaj olduğunu 2 (BSL-2) özellikleri yerine BSL-3 imkanları ile Orta Doğu solunum Sendromu coronavirus (MERS-CoV) gibi yüksek patojenik coronaviruses çalışmaları için gerekli düzey ve Şiddetli akut solunum Sendromu coronavirus (SARS-CoV). Ait tüm üç sınıf sınıfı gibi viral füzyon protein için ben grip hemagglutinin (HA) ve Ebola virüsü glikoprotein (GP), sınıf II Semliki orman virüs E1 zarf proteinleri uygulanabilir olarak başka bir yararı çok yönlülüğünü gelir protein, ya da sınıf III vesicular Stomatit virüs G glikoprotein. Bir metodoloji sadece virüs giriş adımları soruşturuluyor zarf protein tarafından aracılı özetlemek kısıtlamasıdır. Diğer viral ömrünün adımları eğitimi için diğer yöntemleri gereklidir. Bu pseudotype parçacıklar-ebilmek var olmak kullanılmış içinde birçok uygulama örnekleri soruşturma konak hücre duyarlılık ve tropism ve kullanılan viral giriş yolları incelemek için virüs giriş inhibitörlerinin etkileri test içerir.

Temsilcisi sonuçları SARS-CoV S ve MERS-CoV S infektivite deneyleri pseudotyped parçacıklar şekil 1' de gösterilmiştir. , Her iki şekil 1A ve 1Biçin VSV G pseudotyped beklendiği gibi olumlu denetim parçacıklar (VSV-Gpp) verdi çok yüksek ortalama infektivite 10 '6 -107 göreli luciferase birim (RLU) aralığı anılan sıraya göre. SARS-CoV s pseudotyped parçacıklar (şekil 1A) enfeksiyon duyarlı Vero-E6 hücre güçlü bir ortalama infektivite ölçülen yönü 9,8 x 104 RLU. Bu değer neredeyse 3 büyüklük enfekte olmayan denetim için ölçülen değerleri daha yüksek olur (1.1 x 102 RLU), veya Δenv parçacıklar (1.5 x 102 RLU), hangi onların yüzeyde herhangi bir viral zarf glikoproteinlerin liman değil. Benzer şekilde, MERS-CoV S için ha-7 hücre pseudotyped parçacıklar (şekil 1B) enfeksiyon, yüksek bir ortalama infektivite ölçülen yönü 1.0 x 10 civarında6 RLU. Bu neredeyse 4 büyüklük enfekte olmayan denetim için ölçülen değerleri daha yüksek olduğunu (0.8 x 102 RLU), veya Δenv parçacıklar (2.0 x 102 RLU). Bir ek infektivite tahlil içinde SARS-Spp MERS-Spp seri olarak seyreltilmiş ve Vero-E6 hücreleri (Şekil 2A) bulaştırmak için kullanılan gerçekleştirildi. Bu tahlil ölçülen luciferase etkinliği hücre bulaştırmak için kullanılan parçacıklar konsantrasyon bağımlı olduğunu onaylar. Dipeptidyl peptidaz 4 (DPP4), SARS-CoV ve MERS-CoV, reseptörleri ve rolü anjiyotensin dönüştürme enzim 2 (ACE2) sırasıyla, ek ve giriş pseudotyped parçacıkların arabuluculuk onaylamak için izin veren kötü HEK-293T hücreleri kullanılan ve Onları ACE2 ya da DPP4 ifade etmek için transfected (Resim 2B). Transfected hücreleri sonra bir infektivite tahlil için kullanılmıştır. Bu analiz overexpression ACE2 ve DPP4 orada bir ~ 4-günlük ve ~ 2-günlük artış SARS-Spp ve MERS-Spp infektivite için sırasıyla göstermektedir bu reseptör kullanım-in pseudovirions teyit yerel virüs için benzer.
Burada gösterilen örnekler de dahil olmak üzere önemini negatif (non-enfekte, Δenv parçacıklar) yanı sıra pozitif kontrol (VSV-Gpp) koşulları pseudotyped parçacıklar üretirken göstermektedir. Nitekim, olumlu denetim VSV Gpp parçacıklar pseudotyped parçacıkları belirli bir dizi fonksiyonel ve Enfektif pseudovirions verimli başarılı olup olmadığını değerlendirmek sağlamak. Tipik enfeksiyon en memeli hücre hatları 106−107 RLU aralığında olan VSV Gpp parçacıklar tarafından beklenen sonuçları. HEK-293T/17 üretici hücreler (yüksek geçit sayı, hücre yoğunluğu ile sorunları) ile ilgili sorunlar veya genel pseudotyped parçacık üretim ve infektivite zavallı transfection verimliliği etkisi. Ayrıca, negatif kontrol koşulları da bizi RLU ölçüm sonuçları belirli hücre satırı (enfekte olmayan koşul) taban ve parçacıklar (Δenv enfeksiyonu) hangi değil aracılık ettiği belirsiz içselleştirilmesi değerlendirmek izin gibi önemli viral zarf protein tarafından. İdeal olarak, verilen bir tür parçacık pseudotyped için bir viral zarf protein ilgi ile bu rakam 1A, Bburada gösterildiği gibi birkaç büyüklük negatif kontrol değerleri yüksek olan değerleri elde etmek için tavsiye edilir. Ancak, belli bir hücre türü için bir pseudotyped virüs enfeksiyonu çok az infektivite verirse (yani, yakın olmayan transfected N.T. koşullarda ' Resim 2deki gibiB böyle negatif denetimlere) bu mutlaka bu pseudotyped anlamına gelmez parçacık üretim hatalı. Bu iyi olabilir kullanılan belirli hücre satırı ya da kötü değil izin veren enfeksiyon için. Bu belli bir hücre türü enfeksiyona duyarlı olması soruşturuluyor virüs tarafından beklenen olup olmadığını kontrol etmek için tavsiye edilir. Viral receptor(s) daha verimli viral giriş ve enfeksiyon, gösterildiği Şekil 2B, transfection ACE2 ve DPP4 reseptörlerinin nerede üzerine yapılmasına izin verebilirsiniz plasmid(s) ifade transfecting kötü izin veren hücreler HEK-293T hedef hücreleri, bir ~ 4- ve ~ 2-günlük infektivite içinde sırasıyla artırmak.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Plazmid/reaktif</td>
			<td>Miktar</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCMV-MLVgagpol MLV gag ve plazmid kodlama pol</td>
			<td>300 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>FTG-Luc transfer vektör luciferase muhabir ile</td>
			<td>400 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>pcDNA-SARS-S, pcDNA-MERS-S veya boş vektör</td>
			<td>300 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>İndirimli serum hücre kültür orta</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Plazmid ve düşük serum miktarda hücre kültürü 6-şey plaka HEK-293T/17 hücre pseudotyped parçacık üretim için bir şey transfect için gerekli orta. Plazmid hazırlıklar konsantrasyon, plazmid DNA gerekli miktarda ulaşmak için gerekli hacim hesaplamak. Birden fazla şey aynı Plasmid'ler ile transfected birimler tarafından kuyu transfect için gerekli sayıda çarpın ve hesaplamaları sonraki adımda karışımı azalmasını önlemek için ilave bir şey dahil. Toplam DNA transfected 1 µg/iyi miktarıdır. Plazmid yazarlar için istek üzerine mevcuttur.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Miktar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transfection reaktif</td>
			<td>3 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>İndirimli serum hücre kültür orta</td>
			<td>47 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: transfection reaktif ve düşük serum miktarda hücre kültürü 6-şey plaka HEK-293T/17 hücre pseudotyped parçacık üretim için bir şey transfect için gerekli orta. Birimler tarafından kuyu transfect ve ilave wells Mix sonraki adımda azalmasını önlemek için hesaplamalar eklemek için gerekli sayıda çarpın. Transfection reaktif: kullanılan plazmid DNA oranı 3: 1'dir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig1.jpg"> Resim 1 : Coronavirus S-pseudotyped parçacık infektivite deneyleri bir fare lösemi virüs (MLV) omurga ve luciferase muhabir gen kullanarak duyarlı ana bilgisayar hücrelerdeki. (A)SARS-CoV S pseudotyped parçacık infektivite tahlil Vero-E6 hücrelerdeki. (B) MERS-CoV S pseudotyped parçacık infektivite tahlil ha-7 hücrelerdeki. Her iki (A) ve (B), çizilen veri karşılık gelen ortalama göreli luciferase birimlerine üç bağımsız deneylerden standart sapma (SD) karşılık gelen hata çubukları ile. Veri günlüğü10 ölçeğinde y ekseni üzerinde çizilen. N.I.: Sigara enfekte denetimi; Δenv: pseudotyped parçacıklar viral zarf glikoproteinlerin ve VSV Gpp eksik mantar enfeksiyonu: pseudotyped parçacıklar pozitif kontrol VSV G zarf glikoprotein taşıyan ile enfeksiyon. Kullanılan, diğer kısaltma SARS-Spp: SARS-CoV S ile enfeksiyon pseudotyped parçacıklar, MERS-Spp: MERS-CoV S ile enfeksiyon pseudotyped parçacıklar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59010/59010fig2.jpg"> Resim 2 : Konsantrasyon-bağımlılık CoV S-pseudovirion infektivite ve rol SARS-Spp ve MERS-Spp girişindeki ACE2 ve DPP4 reseptörlerinin. (A)konsantrasyon-bağımlılık SARS-Spp ve MERS-Spp infektivite luciferase etkinliği tahlil tarafından ölçülür. Pseudovirions seri olarak seyreltilmiş ve Vero-E6 hücre bulaştırmak için kullanılır. (B) infektivite tahlil SARS-Spp ve MERS-Spp kötü keyfi HEK-293T hedef hücrelerde hızlı ACE2 için transfected ve DPP4 reseptörleri, anılan sıraya göre. Standart sapma (SD) karşılık gelen hata çubukları ile günlük10 ölçeğinde olduğu gibi Resim 1 y eksenindedir yinelenen deneyler, üzerinden veri çizilen. N.T.: Sigara transfected kontrol HEK-293T hücreleri; ACE2: Anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (SARS-CoV alıcı) ve DPP4: dipeptidyl peptidaz 4 (MERS-CoV reseptör). Diğer kısaltmalar kullanılan Resim 1ile aynıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59010/59010fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting at JoVE.com

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

Bir biyogüvenlik seviye 2 ortamda yüksek patojenik Coronaviruses çalışmaya Pseudotyped parçacıklar imalatı

Burada, pseudotyped parçacıklar spike protein yüksek patojenik virüs Ortadoğu solunum sendromu ve şiddetli akut solunum Sendromu coronaviruses birleştiren bir BSL-2 ayar oluşturmak için bir protokol mevcut. Pseudotyped bu parçacıklar hedef ana bilgisayar hücreler virüs girdiği miktar izin luciferase muhabir gen içerir.

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Bu protokol, araştırmacıların sal coronavirus ve en coronavirus gibi yüksek patojenik virüslerin viral giriş olaylarını incelemek için güvenle kullanılabilecek psödotip virüsleri üretmesine olanak tanır. Bu çok yönlü teknik, kolay kurulum geçici geçici dayanmaktadır. Bu sistem aynı zamanda diğer virüslerin füzyon proteinleri ile psödotiplenmiş parçacıklar üretmek için uygulanabilir, sadece coronavirus S.For en iyi sonuçlar için hücre sağlığı ve transfeksiyon için yoğunluğu izlemek için önemlidir yanı sıra psödotipi virüs enfeksiyonu için.Bu prosedürü gösteren Tiffany Tang ve Lakshmi Nathan olacaktır. Laboratuvarımdan mezun öğrenciler. Başlamak için, HEK293T hücrelerini 10 mililitre 37 santigrat derece ile dikkatlice yıkayın, dpbs önceden ısıtılmış iki kez.Daha sonra, supernatant aspire ve 37 santigrat derece önceden ısıtılmış olan% 25 tripsin çözeltisi bir mililitre ile hücreleri eklemek. Daha, hücreler ayrışmaya başlayana kadar 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ortamında hücrelerin şişe kuluçka. Trypsin çözeltisini devre dışı bırakmak için dört mililitre tam DMEM ekleyin.Ve sonra hücreleri bir hücre sayma slayt ve ışık mikroskobu kullanarak saymak. Hücreleri mililitrede 500,000 hücreye seyreltin. Sonra, 6-iyi doku kültür plaka hücre çözeltisi kuyu başına iki mililitre tohum.Ve yavaşça hücreleri eşit dağıtmak için plakayı ileri geri ve yan lara doğru hareket ettirin. Hücrelerin eşit olarak 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit çevre gecede veya 16-18 saat olarak plaka kuluçka dağıtıldıktan sonra. Üç plazmid kotransfeksiyonp reform için, ilk mix plazmidler ve mikro santrifüj tüp azaltılmış serum hücre kültürü orta hacimleri hesaplanır.Karışımı oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra lipid bazlı transfeksiyon reaktifinin her biri için üç mikrolitre ekleyin ve azaltılmış serum hücre kültürü ortamının 47 mikrolitresini ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra, bir mikro santrifüj tüpünde, transfeksiyon reaktifinin eşit miktarda ve plazmid çözeltilerini birkaç kez yukarı ve aşağı boru ile karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre plakasının bir gecede kuluçkaya yatmasını sonra, hücreleri morfolojileri ve yoğunlukları için incelemek için ters ışık mikroskobu kullanın.Daha sonra, hücrelerin harcanan orta aspire ve yavaşça her kuyu için önceden ısıtılmış azaltılmış serum hücre kültürü orta kuyu başına bir mililitre ekleyin. Daha sonra, her iyi damla akıllıca transfection çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin. Ve hücreleri 37 derecede %5 karbondioksitle 4-6 saat kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonunda, her kuyuya 37 santigrat derecede bir mililitre önceden ısıtılmış antibiyotiksiz transfeksiyon DMEM ekleyin. Ve hücreleri 37 derecede 48 saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Psödotipi parçacıklar toplama başlamak için onların morfolojisi ve genel durumu için hücreleri muayene etmek için ters ışık mikroskobu kullanın.Orta renk açık pembe veya biraz turuncu olmalıdır. Daha sonra, transfected hücrelerin supernatants 50 mililitre konik santrifüj tüpleri aktarın. Hücre enkazını temizlemek için tüpleri 290 kat yer çekiminde yedi dakika santrifüj edin.Daha sonra, filtre steril 0,45 mikron gözenek boyutu filtresi ile supernatant açıklık. Cryo şişelerde pseudotype virüs çözeltisi küçük hacimli aliquots olun. Ve onları negatif 80 derecede saklayın.Psödotipli parçacık enfeksiyonu gerçekleştirmek için, hücrelerin bir confluent halı olduğunu doğrulamak için ışık mikroskobu altında ilk muayene hücreleri. Daha sonra hücreleri 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış DPBS'nin 0,5 mililitresi ile üç kez yıkayın. Daha sonra, hücrelerin süpernatantları aspire ve çözülmüş psödotipli parçacık çözeltisi 200 mikrolitre ile hücreleri aşılamak.Hücreleri 37 derecede %5 karbondioksitle 1-2 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka döneminden sonra, 37 santigrat derece önceden ısıtılmış DMEMc 300 mikrolitre ekleyin. Ve enfekte hücreleri 72 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.Son olarak enfekte hücrelerin supernatants aspire. Ve luciferase muhabir insay öncesinde. Psödotipli parçacıkların enfekteliğini ölçmek için ilk olarak eksi 80 santigrat derecede saklanan luciferin substratı, beş seferde eksi 20 santigrat derecede oda sıcaklığında depolanan luciferase assay lisis tamponu.Daha sonra, steril su ile bir kez konsantrasyon luciferase assay lysis tampon seyreltin. Daha sonra, her kuyuya seyreltilmiş arabellek 100 mikrolitre ekleyin. Ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir rocker'da kuluçkaya yat.Luciferase aktivite ölçümü gerçekleştirmek için, bir seferde bir iyi, ilk bir mikro santrifüj tüp için luciferin substrat 20 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, tüp için lysate 10 mikrolitre ekleyin. Tüpleri hafifçe hareket ettirerek içindekileri karıştırın.Ve tüpü bir luminometre cihazına yerleştirdim. Kapağı kapatın ve tüpün Parlaklık değerini ölçün. Göreli ışık birimleri ölçümünü kaydedin ve veri çözümlemesi öncesinde.Duyarlı konak hücrelerde SARS-Spp ve MERS-Spp'nin enfekte likitlik tahlilleri, beklenen pozitif kontrol parçacıklarına kıyasla güçlü bir ortalama enfektivite gösterdi. Enfekte olmayan kontroller ve viral zarf glikoproteinlereksik negatif kontrol parçacıkları. Ayrıca luciferase aktivite tahlilleri SARS-Spp ve MERS-Spp enfektivite konsantrasyon bağımlılığı gösterdi.SARS-Spp veya MERS-Spp enfektivitesinin, SARS-Spp'in ACE2 reseptörü veya MERS-Spp'nin DPP4 reseptörü ile ifade etmek üzere transfece edilmiş, kötü müsamahakar hedef hücrelerde artması, psödoviriyonların reseptör kullanımının psödovirions'a aracılık etmek ve psödovirions'a giriş yapmak için nato virüslerine benzediğini doğrular. Bu adımı gerçekleştirmeden önce hesaplamaları çift kez kontrol edin. Ve adım sırasında tüm çözümlerin iyi karıştırıldığından emin olun.Batı dayonu, sistravirions içine S glikoprotein dahil değerlendirmek için konsantre psödotipli parçacıklar üzerinde yapılabilir. Burada tanımlanan sözde tiplenmiş parçacıklar NATO virüslerinden daha güvenli suretler olmakla birlikte, yine de biyogüvenlik seviyesi iki önlem gerektirir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları &amp; VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

bir (A) Güvenlik Önlemleri ve Çalışma Usul BSL-4 Laboratuvar: 1. Biyogüvenlik Seviye 4 Suit Laboratuvar Suite Giriş ve Çıkış İşlemleri

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Tetracistronic minigenomlar İçeren virüs benzeri partiküller ile Biyogüvenlik Seviyesi 2 Koşullarında Ebola virüsü Ömrü Modelleme

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

Heterologöz β2-Microglobulin ile Yarasa Major Histocompatibility Complex Class I'in Stabilitesi ve Yapısı

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Konak-Patojen Etkileşimlerini İncelemek için Aynı Türden Antikorlar Kullanarak Çift Etiketleme İmmünofluoresans

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...