Name: human serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin g detection by cell-based assay
Uploaded: 2019-04-05T12:30:00
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Les auteurs sont reconnaissants de l’appui des subventions de la Fondation nationale des sciences de Chine (no 31600820), The Health et Commission planification familiale de la Province du Jilin (no 2016Q036) et la Science et technologie planification projet de la Province du Jilin (no 20180520110JH).

Cette procédure a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Université de premier hôpital de la province du Jilin et s’est déroulée sur environ 1 500 sujets.
1. patient Enrollment et prélèvement d’échantillons de sang
<ol><li>Appliquer le laboratoire de détection du sérum Qu'igg anti-AQP4 pour les patients de la clinique avec les plaintes en chef et les symptômes énuméré ci-dessous. Effectuer les examens physiques aussi bien. Névrite optique : les Patient...

<ol>
	<li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+autoimmunity.">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 2 (4), 110 (2015).</li><li>Ho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+aquaporin+4+at+1.8+A+and+its+mechanism+of+conductance.">Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).</li><li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuromyelitis+optica-IgG+at+the+blood-brain+barrier+in+vitro.">Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro.</a> in vitro.Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (1), 311 (2016).</li><li>Sato, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+characteristics+of+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder:+an+international+update.">MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update.</a> Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).</li><li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOG+encephalomyelitis:+international+recommendations+on+diagnosis+and+antibody+testing.">MOG encephalomyelitis: international recommendations on diagnosis and antibody testing.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 134 (2018).</li><li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOG+antibody+disease:+A+review+of+MOG+antibody+seropositive+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder.">MOG antibody disease: A review of MOG antibody seropositive neuromyelitis optica spectrum disorder.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 25, 66-72 (2018).</li><li>Ogawa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOG+antibody-positive,+benign,+unilateral,+cerebral+cortical+encephalitis+with+epilepsy.">MOG antibody-positive, benign, unilateral, cerebral cortical encephalitis with epilepsy.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (2), 322 (2017).</li><li>Valentino, P., Marnetto, F., Granieri, L., Capobianco, M., Bertolotto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+antibody+titration+in+NMO+patients+treated+with+rituximab:+A+retrospective+study.">Aquaporin-4 antibody titration in NMO patients treated with rituximab: A retrospective study.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (2), 317 (2016).</li><li>Kessler, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-aquaporin-4+titer+is+not+predictive+of+disease+course+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder:+A+multicenter+cohort+study.">Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).</li><li>Mealy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+serostatus+does+not+predict+response+to+immunotherapy+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders.">Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Multiple Sclerosis. , (2017).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+aquaporin-4+antibodies+in+Chinese+patients+with+neuromyelitis+optica.">The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica.</a> Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).</li><li>Kitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+factors+and+disease+course+in+aquaporin-4+antibody-positive+patients+with+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder+from+the+United+Kingdom+and+Japan.">Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan.</a> Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).</li></ol>

Nous avons décrit une méthode largement accessible pour détecter les IgG anti-AQP4 dans le sérum humain. IgG anti-AQP4 est étroitement lié au NMOSD, et établir une méthode de détection des IgG anti-AQP4 fiable est essentiel pour le diagnostic clinique de NMOSD. Tout d’abord, les IgG anti-AQP4 est spécifique pour NMOSD. Sclérose en plaques est également une maladie auto-immune du système nerveux central et partage de nombreuses similitudes avec NMOSD12. Cependant, les IgG anti-AQP4 n...

Sérum AQP4 IgG est un biomarqueur diagnostique de noyau pour neuromyélite optique du spectre des troubles (NMOSD)1. L’essai sur les cellules (ABC) est une méthode de détection des IgG anti-AQP4 largement utilisé avec grande sensibilité et spécificité. Ici, un protocole détaillé pour ABC est introduit.
AQP4, une protéine de canal de l’eau, doté de six modules transmembranaire et deux domaines hélicoïdes entourant une solution aqueuse de pores2. IgG anti-AQP4 est impliqué dans la pathogénie de le NMOSD par la liaison à la cible AQP4, qui se trouve principalement sur l’endfeet des astrocytes3. Il a été démontré que les IgG anti-AQP4 est positif dans environ deux tiers des patients NMOSD4. Les plus récents critères diagnostiques internationaux pour NMOSD, IgG anti-AQP4 est réputé être un biomarqueur diagnostique de base5. À cet égard, il est crucial d’établir un protocole fiable pour détecter le sérum humain IgG anti-AQP4 et faciliter le diagnostic clinique des NMOSD.
Actuellement, les diverses méthodes de détection d’IgG anti-AQP4 sont disponibles, comme ABC, dosage à base de tissus, immuno enzymatique et l’écoulement cytometry6,7. CBA emploie EU90 cellules, qui sont transfectées avec des AQP4 humaines, pour capturer des IgG anti-AQP4. Les IgG anti-AQP4 capturé est détectée par des anticorps secondaires fluorescents et visualisée par la suite par microscopie. Accumuler des preuves a montré que l’ABC est plus sensible et plus spécifique que les autres de6,méthodes détection IgG anti-AQP47. Selon une méta-analyse, la sensibilité et la spécificité d’ABC se sont avérés être de 76 % et 99 %, qui étaient plus élevés que sur tissus et enzyme-linked immunosorbent assays6. En outre, une comparaison multicentrique des épreuves diagnostiques d’IgG anti-AQP4 a été menée7. Un total de 193 étude sujets de 15 centres de diagnostic européens étaient inscrits7. Quatre méthodes différentes ont été utilisées pour détecter le sérum anti-AQP4 IgG7. Il a été démontré que l’ABC était plus sensible et plus spécifique que les autres méthodes7. AQP4 est placée comme deux isoformes majeurs (M1-AQP4 et AQP4-M23), anti-AQP4 IgG capture cellulaire est transfecté avec AQP4-M1 ou AQP4-M23. Toutefois, quel type de cellule de capture est mieux reste controversée. Une enquête a soutenu AQP4-M1 selon ABC8, tandis que d’autres ont indiqué que AQP4-M23 base ABC est mieux7,9,10. Toutefois, ABC AQP4-M23-basé peut donner des résultats faussement positifs en raison de liaison non-spécifique IgG8. . De Jaïre et al. 11 a signalé qu’il n’y avait aucune différence significative dans les taux de détection des IgG anti-AQP4 entre AQP4 M1 et de la base de AQP4-M23 SABC.
En résumé, sérum anti-AQP4 IgG est un biomarqueur de base pour NMOSD. ABC a plus de spécificité et de sensibilité que les autres méthodes de détection des IgG anti-AQP4. Il demeure controversée s’AQP4-M1 AQP4 M23-base ou ABC est préférable. Dans cet article, un protocole détaillé pour ABC AQP4-M1-basée est décrite, qui peut s’appliquer au diagnostic clinique et d’études de NMOSD.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:553px;" width="552">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:185px;">Anti-aquaporin-4 IIFT</td>
			<td style="width:96px;">Euroimmun</td>
			<td style="width:105px;">FA 1128-2005-50</td>
			<td style="width:167px;">Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellSens Dimension</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>photograph software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel &#38; clot activator tube</td>
			<td>Improve medical</td>
			<td>623040202</td>
			<td>From a local Chinese company</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin g detection by cell-based assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4), immunoglobuline G (IgG) est le biomarqueur diagnostique de noyau pour les troubles du spectre de neuromyélite optique (NMOSD). L’essai sur les cellules (ABC) est une méthode largement utilisée pour détecter des IgG anti-AQP4 dans le sérum humain avec une spécificité et une sensibilité élevée. En bref, sériques IgG anti-AQP4 est capté par les cellules transfectées AQP4 qui sont fixé sur la biopuce alors détectée par un anticorps secondaire marqué à la fluorescéine. La microscopie de fluorescence est utilisée pour visualiser la fluorescence, et l’intensité de la fluorescence est évaluée au moins deux des cliniciens expérimentés. Un diagnostic définitif de NMOSD peut être pris en fonction sur la combinaison des résultats de détection IgG anti-AQP4, manifestations cliniques et neuroradiologiques conclusions. Selon des études antérieures, ABC est plus sensible et plus spécifique que les autres méthodes de détection des IgG anti-AQP4, et il peut être appliqué à la fois le diagnostic clinique et les études de NMOSD. La méthode a des limites ; par exemple, il manque encore l’échelle internationale pour évaluer les titres d’IgG sériques anti-AQP4. Ici, un protocole détaillé pour la détection de IgG anti-AQP4 sérum humain à l’aide d’ABC est décrite.

En utilisant la procédure décrite ici, IgG spécifiques anti-AQP4 dans le sérum est détectable. Au cours de la procédure, les échantillons préalablement dilués, un témoin positif et un témoin négatif ont été ajoutés aux champs de réaction, qui contiennent des zones transfectées et celllulaire (Figure 2). Fluorescence du contrôle négatif dans une zone transfectée indiqué principalement la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire ...

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Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Détection d’immunoglobuline Anti-aquaporin-4 G de sérum humain par Cell-based Assay

Essai sur les cellules est une méthode largement utilisée pour détecter les immunoglobulines de sérum anti-aquaporin-4 G. Cette méthode pourrait être appliquée au diagnostic clinique et les recherches scientifiques de neuromyélite optique spectre troubles.

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Selon les critères diagnostiques internationaux récents pour des désordres de spectre d’optica de neuromyélite, l’IgG d’anti-AQP4 est considéré comme biomarqueur diagnostique de noyau. La détection d’IgG anti-AQP4 par essai cellulaire peut faciliter le diagnostic clinique. Ainsi, l’analyse cellulaire est plus sensible et spécifique que d’autres méthodes de détection.Et il peut être appliqué à la fois au diagnostic clinique et aux études scientifiques. Tout d’abord, apportez les échantillons de sérum du patient, la glissière de biopuce, la poudre de PBS, et le TWEEN 20 du kit frigorifique d’analyse à base de cellules à la température ambiante. Ensuite, préparez plus de 200 millilitres de tampon de lavage PBS contenant 0,2 pour cent de TWEEN 20 pour chaque diapositive de biopuce.Utilisez le tampon de lavage pour effectuer 10 dilutions périodiques de chaque échantillon de sérum. Préparez des contrôles positifs et négatifs selon les instructions du fabricant. Ajouter 30 microlitres de dilutions en série 10 fois de l’échantillon, le contrôle positif et le contrôle négatif à cinq champs de réaction individuels sur le plateau de réaccage.Tenez la glissière de biopuce par ses glissières et retirez son couvercle protecteur sans toucher ses champs de réaction. Placez la lame sur le plateau du reagent et incuber la configuration à température ambiante pendant 30 minutes. Rincez doucement la diapositive de biopuce avec le tampon de lavage.Plongez-le ensuite dans un bécher de 500 millilitres rempli de 100 millilitres du tampon de lavage, et laissez-le à la température ambiante pendant 10 minutes. Sortez la diapositive de biopuce du tampon de lavage. Utilisez une serviette en papier pour essuyer soigneusement tout tampon restant de l’extérieur des champs de réaction.Laisser sécher à l’air libre pendant une à deux minutes. Dans la pièce sombre, ajouter 25 microlitres d’anticorps secondaires fluorescents à chaque champ de réaction du plateau de reagent. Placez la lame sur le plateau du reagent et incuber la configuration à température ambiante pendant 30 minutes.Rincez doucement la diapositive de biopuce avec le tampon de lavage. Plongez-le ensuite dans un bécher de 500 millilitres rempli de 100 millilitres du tampon de lavage frais, et laissez-le à la température ambiante pendant 10 minutes. Sortez la diapositive de biopuce du tampon de lavage.Utilisez une serviette en papier pour essuyer soigneusement tout tampon restant de l’extérieur des champs de réaction. Laisser sécher à l’air libre pendant une à deux minutes. Ajouter délicatement une goutte du milieu d’intégration à chaque champ de réaction sur la diapositive de la biopuce.Enfin, sceller la diapositive de biopuce avec un verre de couverture tout en évitant les bulles d’air et procéder à l’imagerie. La faible intensité de fluorescence du contrôle négatif observé dans la zone infectée indique la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire. La comparaison entre les intensités de fluorescence détectées du contrôle positif dans les zones infectées et non infectées indique la liaison spécifique de l’IgG anti-AQP4 à L’AQP4M1 dans les cellules infectées.Le sérum négatif anti-AQP4 IgG montre des modèles contraignants similaires au contrôle négatif dans les zones infectées et non infectées. Le sérum positif montre des modèles contraignants similaires au contrôle positif dans les zones infectées et non infectées. Les échantillons sont considérés comme anti-AQP4 IgG positif lorsque la fluorescence augmente hétérogènement dans la zone infectée.L’intensité de la fluorescence est corrélée au titer anti-AQP4 IgG dans le sérum. Les échantillons sont considérés comme probablement positifs lorsque seul un petit nombre de cellules dans la zone transfectée présentent des intensités de fluorescence détectables. Un échantillon doit être considéré comme anti-AQP4 IgG négatif lorsque son intensité dans la zone infectée n’est que homogènement plus forte que dans la zone non infectée.Il est essentiel et difficile d’éviter les bulles d’air. Pour éliminer les bulles d’air, utilisez d’abord une pipette pour éviter les bulles d’air dans les gouttelettes. Deuxièmement, lors de l’application de la diapositive biopuce sur le plateau de réaccente, laissez d’abord un côté de la diapositive toucher les gouttelettes, puis niveler la diapositive lentement.En outre, ne touchez pas les champs de réaction tout au long de l’expérience.

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