Name: human serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin g detection by cell-based assay
Uploaded: 2019-04-05T12:30:00
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Die Autoren sind dankbar für die Unterstützung von Zuschüssen vom National Science Foundation of China (Nr. 31600820), die Gesundheit und Familienplanung Kommission der Provinz Jilin (Nein 2016Q036), und der Wissenschaft und Technik Planung Projekt der Provinz Jilin (Nr. 20180520110JH).

Dieses Verfahren wurde von der Ethikkommission der ersten Krankenhaus der Jilin Universität zugelassen und wurde auf etwa 1.500 Probanden durchgeführt.
(1) Patienten und Blood Sample-Sammlung
<ol><li>Gelten Sie die Labor-Nachweis von Serum Anti-AQP4 IgG Klinik Patienten mit dem chief Beschwerden und Symptome unten aufgeführten. Durchführen Sie sowie körperliche Untersuchungen. Optikusneuritis: Patienten leiden mit visuellen Defiziten, wie Verlust des Gesichtsfeldes und Reduktion ...

<ol>
	<li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+autoimmunity.">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 2 (4), 110 (2015).</li><li>Ho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+aquaporin+4+at+1.8+A+and+its+mechanism+of+conductance.">Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).</li><li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuromyelitis+optica-IgG+at+the+blood-brain+barrier+in+vitro.">Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro.</a> in vitro.Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (1), 311 (2016).</li><li>Sato, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinction+between+MOG+antibody-positive+and+AQP4+antibody-positive+NMO+spectrum+disorders.">Distinction between MOG antibody-positive and AQP4 antibody-positive NMO spectrum disorders.</a> Neurology. 82 (6), 474-481 (2014).</li><li>Wingerchuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+consensus+diagnostic+criteria+for+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders.">International consensus diagnostic criteria for neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Neurology. 85 (2), 177-189 (2015).</li><li>Ruiz-Gaviria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sensitivity+of+aquaporin+4+antibody+detection+tests+in+patients+with+neuromyelitis+optica:+A+meta-analysis.">Specificity and sensitivity of aquaporin 4 antibody detection tests in patients with neuromyelitis optica: A meta-analysis.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 4 (4), 345-349 (2015).</li><li>Waters, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicentre+comparison+of+a+diagnostic+assay:+aquaporin-4+antibodies+in+neuromyelitis+optica.">Multicentre comparison of a diagnostic assay: aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 87 (9), 1005-1015 (2016).</li><li>Fryer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AQP4+autoantibody+assay+performance+in+clinical+laboratory+service.">AQP4 autoantibody assay performance in clinical laboratory service.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 1 (1), 11 (2014).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+antibody+in+neuromyelitis+optica:+re-testing+study+in+a+large+population+from+China.">Aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica: re-testing study in a large population from China.</a> The International Journal of Neuroscience. 127 (9), 790-799 (2017).</li><li>Pisani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+autoantibodies+in+Neuromyelitis+Optica:+AQP4+isoform-dependent+sensitivity+and+specificity.">Aquaporin-4 autoantibodies in Neuromyelitis Optica: AQP4 isoform-dependent sensitivity and specificity.</a> PloS One. 8 (11), 79185 (2013).</li><li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+antibody+testing:+direct+comparison+of+M1-AQP4-DNA-transfected+cells+with+leaky+scanning+versus+M23-AQP4-DNA-transfected+cells+as+antigenic+substrate.">Aquaporin-4 antibody testing: direct comparison of M1-AQP4-DNA-transfected cells with leaky scanning versus M23-AQP4-DNA-transfected cells as antigenic substrate.</a> Journal of Neuroinflammation. 11, 129 (2014).</li><li>Jury&#324;czyk, M., Craner, M., Palace, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+CNS+inflammatory+diseases:+differentiating+features+of+NMO+and+MS.">Overlapping CNS inflammatory diseases: differentiating features of NMO and MS.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 86 (1), 20-25 (2015).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Features+of+Patients+with+Multiple+Sclerosis+and+Neuromyelitis+Optica+Spectrum+Disorders.">Clinical Features of Patients with Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica Spectrum Disorders.</a> Chinese Medical Journal. 129 (17), 2079-2084 (2016).</li><li>Majed, M., Fryer, J. P., McKeon, A., Lennon, V. A., Pittock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+testing+AQP4-IgG+in+CSF:+Guidance+for+physicians.">Clinical utility of testing AQP4-IgG in CSF: Guidance for physicians.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 3 (3), 231 (2016).</li><li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+antibodies+to+aquaporin-4+in+neuromyelitis+optica+and+related+disorders:+frequency,+origin,+and+diagnostic+relevance.">Cerebrospinal fluid antibodies to aquaporin-4 in neuromyelitis optica and related disorders: frequency, origin, and diagnostic relevance.</a> Journal of Neuroinflammation. 7, 52 (2010).</li><li>Asgari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+leptomeningeal+blood+barrier+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder.">Disruption of the leptomeningeal blood barrier in neuromyelitis optica spectrum disorder.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (4), 343 (2017).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+characteristics+of+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder:+an+international+update.">MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update.</a> Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).</li><li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOG+encephalomyelitis:+international+recommendations+on+diagnosis+and+antibody+testing.">MOG encephalomyelitis: international recommendations on diagnosis and antibody testing.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 134 (2018).</li><li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOG+antibody+disease:+A+review+of+MOG+antibody+seropositive+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder.">MOG antibody disease: A review of MOG antibody seropositive neuromyelitis optica spectrum disorder.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 25, 66-72 (2018).</li><li>Ogawa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOG+antibody-positive,+benign,+unilateral,+cerebral+cortical+encephalitis+with+epilepsy.">MOG antibody-positive, benign, unilateral, cerebral cortical encephalitis with epilepsy.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (2), 322 (2017).</li><li>Valentino, P., Marnetto, F., Granieri, L., Capobianco, M., Bertolotto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+antibody+titration+in+NMO+patients+treated+with+rituximab:+A+retrospective+study.">Aquaporin-4 antibody titration in NMO patients treated with rituximab: A retrospective study.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (2), 317 (2016).</li><li>Kessler, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-aquaporin-4+titer+is+not+predictive+of+disease+course+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder:+A+multicenter+cohort+study.">Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).</li><li>Mealy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+serostatus+does+not+predict+response+to+immunotherapy+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders.">Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Multiple Sclerosis. , (2017).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+aquaporin-4+antibodies+in+Chinese+patients+with+neuromyelitis+optica.">The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica.</a> Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).</li><li>Kitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+factors+and+disease+course+in+aquaporin-4+antibody-positive+patients+with+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder+from+the+United+Kingdom+and+Japan.">Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan.</a> Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).</li></ol>

Wir haben ein breit zugänglich Verfahren zur Erkennung von Anti-AQP4-IgG in humanem Serum beschrieben. Anti-AQP4 IgG ist eng verwandt mit NMOSD und Schaffung einer zuverlässigen Anti-AQP4 IgG Erkennungsmethode ist entscheidend für die klinische Diagnose der NMOSD. Anti-AQP4 IgG ist spezifisch für NMOSD. Multiple Sklerose ist auch eine immun-vermittelte Erkrankung des zentralen Nervensystems und teilt viele Ähnlichkeiten mit NMOSD12. Anti-AQP4 IgG ist jedoch nur positive NMOSD<sup class="xref"...

Serum IgG AQP4 ist ein Kern diagnostischer Biomarker für Neuromyelitis Optica Spektrum Störungen (NMOSD)1. Zellbasierte Assays (CBA) ist eine weit verbreitete Anti-AQP4 IgG Methode mit hoher Sensitivität und Spezifität. Hier ist ein detailliertes Protokoll für CBA vorgestellt.
AQP4, ein Wasser-Kanal-Protein hat sechs Membran überspannt Einheiten und zwei spiralförmige Domains rund um eine wässrige pore2. Anti-AQP4 IgG in der Pathogenese der NMOSD durch Bindung an ihr Ziel AQP4, engagiert sich vor allem auf die Endfeet von Astrozyten3liegt. Es hat sich gezeigt, dass Anti-AQP4-IgG positiv in etwa zwei Drittel der NMOSD Patienten4ist. In der jüngsten internationalen Diagnosekriterien für NMOSD Anti-AQP4 IgG gilt eine Core-diagnostischer Biomarker-5. In dieser Hinsicht ist es entscheidend, ein zuverlässiges Protokoll zur Humanserum erkennen zu etablieren Anti-AQP4-IgG und klinische Diagnose der NMOSD zu erleichtern.
Derzeit sind verschiedene Anti-AQP4-IgG-Nachweismethoden zur Verfügung, wie z. B. CBA, Gewebe-basierten Tests und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay Flow Cytometry6,7. CBA beschäftigt EU90 Zellen, die mit menschlichen AQP4 Anti-AQP4 IgG erfassen transfiziert sind. Die erfassten Anti-AQP4-IgG ist von fluoreszierenden Sekundärantikörper erkannt und anschließend visualisiert durch Mikroskopie. Sammeln Beweise hat gezeigt, dass CBA empfindlicher und spezifischer als andere Anti-AQP4 IgG Erkennung Methoden6,7. Laut einer Meta-Analyse die Sensitivität und Spezifität der KNA erwiesen sich 76 % und 99 %, die höher als gewebebasierten waren und Enzym-linked Immunosorbentprobe assays6. Darüber hinaus wurde ein multizentrische Vergleich der diagnostischen Tests von Anti-AQP4 IgG durchgeführten7. Insgesamt 193 Studie waren Themen aus 15 europäischen Diagnosezentren eingeschrieben7. Vier verschiedene Methoden wurden verwendet, um Serum Anti-AQP4 IgG7erkennen. Es konnte gezeigt werden, dass CBA empfindlicher und spezifischer als die anderen Methoden7war. Wie AQP4 als zwei große Isoformen (AQP4-M1 und AQP4-M23) zum Ausdruck kommt, ist Anti-AQP4-IgG-Capture-Zelle mit AQP4-M1 oder AQP4-M23 transfiziert. Welche Art von Capture-Zelle ist jedoch besser bleibt umstritten. Eine Untersuchung hat AQP4-M1 Basis unterstützt CBA8, während andere schon angedeutet haben, dass AQP4-M23 CBA basierend ist besser7,9,10. AQP4-M23-basierte CBA kann jedoch falsch positive Ergebnisse durch unspezifische IgG Bindung8erzielen. Jarius Et Al. 11 berichtet, dass gab es keinen signifikanten Unterschied in Anti-AQP4-IgG-Erkennungsraten zwischen AQP4-M1 und AQP4-M23-basierte GAV.
In Zusammenfassung, Serum Anti-AQP4 IgG ist ein Kern-Biomarker für NMOSD. CBA hat höhere Spezifität und Sensitivität als andere Anti-AQP4-IgG-Nachweisverfahren. Es bleibt umstritten, ob AQP4-M1 - oder AQP4-M23-basierte CBA besser ist. In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für AQP4-M1-basierte CBA beschrieben, die für klinische Diagnose und Studien von NMOSD gelten kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:553px;" width="552">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:185px;">Anti-aquaporin-4 IIFT</td>
			<td style="width:96px;">Euroimmun</td>
			<td style="width:105px;">FA 1128-2005-50</td>
			<td style="width:167px;">Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellSens Dimension</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>photograph software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel &#38; clot activator tube</td>
			<td>Improve medical</td>
			<td>623040202</td>
			<td>From a local Chinese company</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin g detection by cell-based assay

Anti-Aquaporin-4 (AQP4) Immunglobulin G (IgG) ist der Kern diagnostischer Biomarker für Neuromyelitis Optica-Spektrum-Störungen (NMOSD). Zellbasierte Assays (CBA) ist eine weit verbreitete Methode, Anti-AQP4-IgG in humanem Serum mit hoher Sensitivität und Spezifität zu erkennen. Kurz, Serum Anti-AQP4 IgG wird von AQP4-transfizierten Zellen, die feste auf dem Biochip ist dann durch einen Fluorescein-gekennzeichnete sekundäre Antikörper erkannt gefangen genommen. Fluoreszenzmikroskopie wird genutzt, um die Fluoreszenz sichtbar zu machen, und die Intensität der Fluoreszenz wird durch mindestens zwei erfahrene Kliniker ausgewertet. Eine endgültige Diagnose des NMOSD kann basierend auf der Kombination von Anti-AQP4 IgG Detektionsergebnisse, klinischen Manifestationen und neuroradiologische Befunde erfolgen. Früheren Studien zufolge CBA ist empfindlicher und spezifischer als andere Anti-AQP4-IgG-Nachweisverfahren und klinische Diagnose und Studien des NMOSD aufgebracht werden. Die Methode hat Einschränkungen; zum Beispiel fehlt noch eine internationale Skala Serum Anti-AQP4-IgG-Titer bewertet. Hier wird ein detailliertes Protokoll für menschliches Serum Anti-AQP4 IgG Nachweis mit CBA beschrieben.

Verwendung des beschriebenen Verfahrens hier, ist die spezifische Anti-AQP4-IgG im Serum nachweisbar. Während des Verfahrens waren vorverdünnt Proben, eine positiv-Kontrolle und eine negative Kontrolle der Reaktion Felder hinzugefügt, die transfizierte und untransfected Bereiche (Abbildung 2) enthalten. Fluoreszenz von der negativen Kontrolle in einem transfizierten Bereich angegeben vor allem die unspezifische Bindung des sekundären Antikörper zu den tr...

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Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Humanem Serum Anti-Aquaporin-4 Immunglobulin G Erkennung durch zellbasierte Assays

Zellbasierte Assays ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von Serum Anti-Aquaporin-4 Immunglobulin G. Diese Methode könnte auf klinische Diagnose und wissenschaftlichen Forschungen der Neuromyelitis-optisches Spektrum-Störungen angewendet werden.

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Nach den jüngsten internationalen diagnostischen Kriterien für Neuromyelitis optica Spektrum Störungen, Anti-AQP4 IgG gilt als kerndiagnostische Biomarker. Die Anti-AQP4 IgG-Erkennung durch zellbasierten Assay kann die klinische Diagnose erleichtern. Daher ist der zellbasierte Assay empfindlicher und spezifischer als andere Nachweismethoden.Und es kann sowohl auf klinische Diagnose als auch auf die wissenschaftlichen Studien angewendet werden. Bringen Sie zunächst die Serumproben des Patienten, den Biochipschlitten, das PBS-Pulver und das TWEEN 20 aus dem auf Kühlzellen basierenden Assay-Kit auf die Raumtemperatur. Dann bereiten Sie mehr als 200 Milliliter PBS-Waschpuffer mit 0,2 Prozent TWEEN 20 für jeden Biochip-Dia vor.Verwenden Sie den Waschpuffer, um 10-fache serielle Verdünnungen jeder Serumprobe zu machen. Bereiten Sie positive und negative Kontrollen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Fügen Sie 30 Mikroliter der 10-fachen seriellen Verdünnungen der Probe, der Positivkontrolle und der Negativkontrolle zu fünf einzelnen Reaktionsfeldern auf der Reagenzschale hinzu.Halten Sie den Biochip-Dia an seinen Dias und entfernen Sie seine Schutzhülle, ohne seine Reaktionsfelder zu berühren. Setzen Sie die Folie auf das Reagenzfach und inkubieren Sie das Setup bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Spülen Sie den Biochip-Schlitten vorsichtig mit dem Waschpuffer ab.Dann tauchen Sie es in einen 500 Milliliter Becher gefüllt mit 100 Milliliter des Waschpuffers, und lassen Sie es bei der Raumtemperatur für 10 Minuten. Nehmen Sie die Biochip-Rutsche aus dem Waschpuffer. Verwenden Sie ein Papiertuch, um den verbleibenden Puffer von außerhalb der Reaktionsfelder vorsichtig wegzuwischen.Lassen Sie das Dia ein bis zwei Minuten lufttrocknen. Fügen Sie im dunklen Raum 25 Mikroliter fluoreszierenden Sekundärantikörper in jedes Reaktionsfeld der Reagenzschale ein. Setzen Sie die Folie auf das Reagenzfach und inkubieren Sie das Setup bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Spülen Sie den Biochip-Schlitten vorsichtig mit dem Waschpuffer ab. Dann tauchen Sie es in einen 500 Milliliter Becher gefüllt mit 100 Milliliter des frischen Waschpuffers, und lassen Sie es bei der Raumtemperatur für 10 Minuten. Nehmen Sie die Biochip-Rutsche aus dem Waschpuffer.Verwenden Sie ein Papiertuch, um den verbleibenden Puffer von außerhalb der Reaktionsfelder vorsichtig wegzuwischen. Lassen Sie das Dia ein bis zwei Minuten lufttrocknen. Fügen Sie vorsichtig einen Tropfen des Einbettungsmediums zu jedem Reaktionsfeld auf dem Biochip-Dia hinzu.Schließlich versiegeln Sie den Biochip-Schlitten mit einem Deckglas, während Luftblasen vermieden werden, und fahren Sie mit der Bildgebung fort. Die schwache Fluoreszenzintensität der im infizierten Bereich beobachteten Negativkontrolle deutet auf die unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers hin. Der Vergleich zwischen den nachgewiesenen Fluoreszenzintensitäten der Positivkontrolle in den infizierten und nicht infizierten Gebieten zeigt die spezifische Bindung des Anti-AQP4 IgG an AQP4M1 in den infizierten Zellen.Das Anti-AQP4 IgG Negativserum zeigt Bindungsmuster ähnlich der Negativkontrolle in infizierten und nicht infizierten Bereichen. Das positive Serum zeigt Bindungsmuster, die der positiven Kontrolle sowohl in infizierten als auch in nicht infizierten Gebieten ähneln. Proben gelten als anti-AQP4 IgG positiv, wenn die Fluoreszenz im infizierten Bereich heterogen zunimmt.Die Intensität der Fluoreszenz korreliert mit Anti-AQP4 IgG Titer im Serum. Proben werden wahrscheinlich als positiv angesehen, wenn nur eine kleine Anzahl von Zellen im transfäfierten Bereich nachweisbare Fluoreszenzintensitäten aufweisen. Eine Probe sollte als Anti-AQP4 IgG negativ betrachtet werden, wenn ihre Intensität im infizierten Bereich nur homogen stärker ist als im nicht infizierten Bereich.Die Vermeidung von Luftblasen ist von entscheidender Bedeutung und schwierig. Um Luftblasen zu beseitigen, verwenden Sie zuerst eine Pipette, um Luftblasen in Tröpfchen zu vermeiden. Zweitens, während der Biochip-Rutsche auf das Reagenz-Fach auftragen, lassen Sie zuerst eine Seite des Dias die Tröpfchen berühren, und dann die Folie langsam nivellieren.Berühren Sie außerdem nicht die Reaktionsfelder während des gesamten Experiments.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

Die Bestimmung der Reaktivität und Titre von Serum mit einem Hämagglutinations Assay

Haemagglutination is a specific form of agglutination and is used when antibodies bind to red blood cells, which act as a particulate antigen. Red blood ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Mit der BLT humanisierte Maus als Stem Cell based Gene Therapy Tumormodell

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

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Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

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Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

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