Name: human serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin g detection by cell-based assay
Uploaded: 2019-04-05T12:30:00
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著者は国立科学財団の中国 (第 31600820)、健康と家族計画の吉林省委員会 (ナンバー 2016Q036) と科学と技術計画プロジェクトの吉林省号からの助成金からのサポートに感謝20180520110JH)。

この手順は、最初病院の吉林大学の倫理委員会によって承認された、約 1500 のテーマで行われました。
1. 患者登録や血液検体の採取
<ol><li>以下にクリニック患者主訴や症状に抗 AQP4 IgG 血清の研究室検出を適用します。同様の物理的な検査を実行します。 視神経炎: 視野の損失や視力の低下などの視覚障害を持つ患者は苦しみます。 急性脊髄炎: 患者は麻痺、感?...

<ol>
	<li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+autoimmunity.">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 2 (4), 110 (2015).</li><li>Ho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+aquaporin+4+at+1.8+A+and+its+mechanism+of+conductance.">Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).</li><li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuromyelitis+optica-IgG+at+the+blood-brain+barrier+in+vitro.">Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro.</a> in vitro.Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (1), 311 (2016).</li><li>Sato, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-aquaporin-4+titer+is+not+predictive+of+disease+course+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder:+A+multicenter+cohort+study.">Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).</li><li>Mealy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+serostatus+does+not+predict+response+to+immunotherapy+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders.">Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Multiple Sclerosis. , (2017).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+aquaporin-4+antibodies+in+Chinese+patients+with+neuromyelitis+optica.">The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica.</a> Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).</li><li>Kitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+factors+and+disease+course+in+aquaporin-4+antibody-positive+patients+with+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder+from+the+United+Kingdom+and+Japan.">Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan.</a> Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).</li></ol>

ひと血清中 igg 抗 AQP4 抗体を検出する広くアクセス可能なメソッドを説明しました。NMOSD、密接に関連 IgG 抗 AQP4 と信頼性の高い抗 AQP4 igg 抗体検出法の確立 NMOSD の臨床診断のため非常に重要です。まず、IgG 抗 AQP4 は、NMOSD の特定です。多発性硬化症は中枢神経系の免疫介在性疾患ではまた、NMOSD12と多くの類似点を共有します。ただし、抗 AQP4 IgG のみ陽性 NMOSD13...

血中 AQP4 IgG は視神経脊髄炎オプティカ スペクトラム障害 (NMOSD)1のコア診断バイオ マーカーです。細胞に基づく試金 (CBA) は、高い感度と特異性で広く使用されている抗 AQP4 igg 抗体検出法です。ここでは、CBA のための詳しいプロトコルを導入します。
AQP4、水チャネル蛋白質が膜貫通の六つのユニットと周囲の水溶液のいずれか 2 つのヘリカル ドメイン間隙2。IgG 抗 AQP4 は、目標3アストロ サイト終足に主にある AQP4 へのバインディングを介して NMOSD の病因に関与しています。それは抗 AQP4 IgG が陽性 NMOSD 患者4の約 3 分の 2 で示されています。最新国際診断基準 NMOSD のため、IgG 抗 AQP4 は、5コア診断バイオ マーカーと見なされます。この点では、それはひと血清を検出するための信頼性の高いプロトコルを確立する重要な抗 AQP4 IgG と NMOSD の臨床診断を容易にします。
現在、様々 な抗 AQP4 IgG の検出方法は、CBA、組織ベースのアッセイ、酵素抗体法、流れ cytometry6,7など、使用できます。CBA は抗 AQP4 IgG をキャプチャする、人間の AQP4 が発現する EU90 細胞を採用しています。キャプチャされた抗 AQP4 IgG は二次抗体を蛍光で検出され、顕微鏡による可視化しました。証拠の蓄積は CBA はより敏感なよりその他抗 AQP4 IgG の検出の方法6,7特定を示しています。メタ分析によると感度と特異度 CBA の 76% と 99% で、組織ベースよりも高かったことが示された、試金の酵素免疫6。さらに、igg 抗 AQP4 抗体の診断アッセイの多施設比較は実施7だった。193 研究被験者 15 ヨーロッパ診断センターからの合計では、7が在籍しています。7血清抗 AQP4 の igg 抗体を検出する方法は 4 種類活かされています。CBA がより敏感より他の方法7特定だったことを示した。AQP4 は 2 つの主要なアイソ フォーム (AQP4 M1 と AQP4 M23) として表した、抗 AQP4 IgG キャプチャ セルは AQP4 M1 または AQP4 M23 をトランスフェクトしました。ただし、キャプチャ セルのタイプは良いまま論争です。1 つの調査は AQP4 M1 ベースをサポートして CBA8、他人は AQP4 M23 基づく CBA であることが示されている間は良い7,9,10。ただし、AQP4 ベース M23 CBA は、非特異的 IgG 結合8のための偽肯定的な結果をもたらす可能性があります。会堂 et al.11は、AQP4 M1 と AQP4 ベース M23 CBAs 間抗 AQP4 igg 抗体検出率に有意差はなかったことを報告しました。
要約すると、血清抗 AQP4 の IgG は NMOSD コア マーカー。CBA は、高い特異性と他の抗 AQP4 の igg 抗体の検出法よりも感度をが。それは残る AQP4 M1 または AQP4 M23-ベース CBA が良いかどうか物議を醸す。この記事では AQP4 ベース M1 CBA のための詳しいプロトコルは説明した、NMOSD の臨床診断学に適用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:553px;" width="552">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:185px;">Anti-aquaporin-4 IIFT</td>
			<td style="width:96px;">Euroimmun</td>
			<td style="width:105px;">FA 1128-2005-50</td>
			<td style="width:167px;">Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellSens Dimension</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>photograph software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel &#38; clot activator tube</td>
			<td>Improve medical</td>
			<td>623040202</td>
			<td>From a local Chinese company</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin g detection by cell-based assay

アンチ-アクアポリン-4 (AQP4) 免疫グロブリン G (IgG) は視神経脊髄炎オプティカ スペクトラム障害 (NMOSD) のコアの診断バイオ マーカーです。細胞に基づく試金 (CBA) は、高い感度と特異性を持つひと血清中 igg 抗 AQP4 抗体を検出するため広く使用されている方法です。簡単に、血清 IgG 抗 AQP4 は、バイオチップに固定し、フルオレセイン標識二次抗体で検出された AQP4 を発現させた細胞によってキャプチャされます。蛍光顕微鏡を利用して、蛍光を可視化するし、少なくとも 2 つの経験豊富な臨床医によって蛍光の強度を評価します。NMOSD の最終的な診断は、抗 AQP4 IgG の検出結果、臨床症状および画像所見の組み合わせに基づいて行うことが。以前の研究によると CBA はより敏感でありその他抗 AQP4 IgG の検出法よりも特定と臨床診断と NMOSD の研究に適用することができます。メソッドには制限があります。たとえば、血清 IgG 抗体は抗 AQP4 を評価する国際的な規模はまだ欠けています。ここでは、CBA を用いたひと血清抗 AQP4 igg 抗体検出のための詳しいプロトコルを説明します。

ここで説明する手順を使用して、特定の抗 AQP4 血清中 IgG は検出です。中には、希釈サンプル、陽性対照および陰性対照が transfected と融合領域 (図 2) を含む反応のフィールドに追加されました。Transfected 領域で負の制御の蛍光は主にバイオチップ (図 3) に transfected セルに二次抗体の非特異的結合を示されました。均一弱い...

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Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

細胞ベースのアッセイによるひと血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン G の検出

細胞に基づく試金は広く使用されている血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン g. を検出方法です。このメソッドは、臨床診断や視神経脊髄炎光スペクトラム障害の科学的研究に適用でした。

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

神経髄炎の光学スペクトル障害に関する最近の国際的な診断基準によると、抗AQP4 IgGは、コア診断バイオマーカーであると考えられている。細胞ベースのアッセイによる抗AQP4 IgG検出は、臨床診断を容易にすることができる。したがって、細胞ベースのアッセイは、他の検出方法よりも感度が高く、特異的です。そして、それは臨床診断と科学的研究の両方に適用することができます。まず、患者の血清サンプル、バイオチップスライド、PBS粉末、およびTWEEN 20を冷蔵された細胞ベースのアッセイキットから室温に持ち込む。次いで、各バイオチップスライドに対して0.2%のTWEEN 20を含むPBS洗浄バッファーを200ミリリットル以上調製した。洗浄バッファーを使用して、各血清サンプルの 10 倍の連続希釈液を作ります。メーカーの指示に従って、正と負のコントロールを準備します。試薬トレイ上の5つの個々の反応フィールドに、サンプルの10倍の連続希釈液、陽性対照、および陰性対照の30マイクロリットルを加えます。バイオチップスライドをスライドで保持し、反応フィールドに触れることなく保護カバーを取り外します。試薬トレイの上にスライドを置き、30分間室温でセットアップをインキュベートします。洗浄バッファーで、バイオチップスライドをそっと洗い流します。その後、洗浄バッファーの100ミリリットルで満たされた500ミリリットルのビーカーに浸し、室温で10分間放置します。洗浄バッファーからバイオチップスライドを取り出します。ペーパータオルを使用して、残りのバッファーを反応フィールドの外側から慎重に拭き取ります。スライドを1~2分間空気乾燥させます。暗室では、試薬トレイの各反応フィールドに25マイクロリットルの蛍光二次抗体を加えます。試薬トレイの上にスライドを置き、30分間室温でセットアップをインキュベートします。洗浄バッファーで、バイオチップスライドをそっと洗い流します。その後、新鮮な洗浄バッファーの100ミリリットルで満たされた500ミリリットルのビーカーに浸し、室温で10分間放置します。洗浄バッファーからバイオチップスライドを取り出します。ペーパータオルを使用して、残りのバッファーを反応フィールドの外側から慎重に拭き取ります。スライドを1~2分間空気乾燥させます。バイオチップスライドの各反応フィールドに、埋め込み培地を1滴慎重に追加します。最後に、気泡を避けながらカバーガラスでバイオチップスライドをシールし、イメージングを進めます。感染領域で観察された陰性対照の弱い蛍光強度は、二次抗体の非特異的結合を示す。感染した領域と感染していない領域における陽性対照の検出された蛍光強度の比較は、感染細胞におけるAQP4 IgGとAQP4M1の特異的結合を示す。抗AQP4 IgG陰性血清は、感染した領域と感染していない領域の両方で陰性対照と同様の結合パターンを示す。陽性血清は、感染した領域と感染していない領域の両方で陽性対照と同様の結合パターンを示す。サンプルは、感染領域で蛍光が不均一に増加すると、抗AQP4 IgG陽性と見なされます。蛍光強度は、血清中の抗AQP4 IgG価に相関する。サンプルは、トランスフェクション領域内の少数の細胞のみが検出可能な蛍光強度を示す場合に、おそらく陽性と考えられる。感染領域の強度が感染していない領域よりも均質に強い場合、サンプルは抗AQP4 IgG陰性とみなされるべきです。気泡を避けることは非常に重要で困難です。気泡を除去するには、まずピペットを使用して、液滴中の気泡を避けてください。第2に、試薬トレイにバイオチップスライドを施しながら、まずスライドの片側を液滴に触らせ、次にゆっくりとスライドをレベル付けする。また、実験中は反応場に触れないでください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

赤血球凝集アッセイを用いて血清の反応性と力価の決定

Haemagglutination is a specific form of agglutination and is used when antibodies bind to red blood cells, which act as a particulate antigen. Red blood ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてBLTヒト化マウスを用いた

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

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単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

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勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...