Name: human serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin g detection by cell-based assay
Uploaded: 2019-04-05T12:30:00
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Os autores são gratos pelo apoio de subsídios da Fundação Nacional de Ciências da China (n. º 31600820), a saúde e Comissão planejamento familiar da província de Jilin (não 2016Q036) e a ciência e tecnologia planejamento projeto da província de Jilin (n. º 20180520110JH).

Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de ética da Universidade primeiro Hospital de Jilin e realizou-se em aproximadamente 1.500 indivíduos.
1. se o paciente registro e coleta de amostra de sangue
<ol><li>Aplica a detecção laboratorial de soro de que IgG anti-AQP4 aos pacientes da clínica com os principais queixas e sintomas listado abaixo. Realize exames físicos também. Neurite óptica: pacientes sofrem com déficits visuais, tais como a perda dos campos visuais e reduç...

<ol>
	<li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+autoimmunity.">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 2 (4), 110 (2015).</li><li>Ho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+aquaporin+4+at+1.8+A+and+its+mechanism+of+conductance.">Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).</li><li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuromyelitis+optica-IgG+at+the+blood-brain+barrier+in+vitro.">Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro.</a> in vitro.Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (1), 311 (2016).</li><li>Sato, D. 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P., McKeon, A., Lennon, V. A., Pittock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+testing+AQP4-IgG+in+CSF:+Guidance+for+physicians.">Clinical utility of testing AQP4-IgG in CSF: Guidance for physicians.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 3 (3), 231 (2016).</li><li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+antibodies+to+aquaporin-4+in+neuromyelitis+optica+and+related+disorders:+frequency,+origin,+and+diagnostic+relevance.">Cerebrospinal fluid antibodies to aquaporin-4 in neuromyelitis optica and related disorders: frequency, origin, and diagnostic relevance.</a> Journal of Neuroinflammation. 7, 52 (2010).</li><li>Asgari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+leptomeningeal+blood+barrier+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder.">Disruption of the leptomeningeal blood barrier in neuromyelitis optica spectrum disorder.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (4), 343 (2017).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+characteristics+of+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder:+an+international+update.">MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update.</a> Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).</li><li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOG+encephalomyelitis:+international+recommendations+on+diagnosis+and+antibody+testing.">MOG encephalomyelitis: international recommendations on diagnosis and antibody testing.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 134 (2018).</li><li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOG+antibody+disease:+A+review+of+MOG+antibody+seropositive+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder.">MOG antibody disease: A review of MOG antibody seropositive neuromyelitis optica spectrum disorder.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 25, 66-72 (2018).</li><li>Ogawa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOG+antibody-positive,+benign,+unilateral,+cerebral+cortical+encephalitis+with+epilepsy.">MOG antibody-positive, benign, unilateral, cerebral cortical encephalitis with epilepsy.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (2), 322 (2017).</li><li>Valentino, P., Marnetto, F., Granieri, L., Capobianco, M., Bertolotto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+antibody+titration+in+NMO+patients+treated+with+rituximab:+A+retrospective+study.">Aquaporin-4 antibody titration in NMO patients treated with rituximab: A retrospective study.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (2), 317 (2016).</li><li>Kessler, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-aquaporin-4+titer+is+not+predictive+of+disease+course+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder:+A+multicenter+cohort+study.">Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).</li><li>Mealy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+serostatus+does+not+predict+response+to+immunotherapy+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders.">Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Multiple Sclerosis. , (2017).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+aquaporin-4+antibodies+in+Chinese+patients+with+neuromyelitis+optica.">The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica.</a> Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).</li><li>Kitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+factors+and+disease+course+in+aquaporin-4+antibody-positive+patients+with+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder+from+the+United+Kingdom+and+Japan.">Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan.</a> Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).</li></ol>

Descrevemos um método amplamente acessível para detectar IgG anti-AQP4 no soro humano. IgG anti-AQP4 está intimamente relacionado com NMOSD, e que estabelece um método de deteção de IgG anti-AQP4 confiável é fundamental para o diagnóstico clínico de NMOSD. Primeiro, o IgG anti-AQP4 é específico para NMOSD. Esclerose múltipla é também uma doença imune-mediada do sistema nervoso central e compartilha muitas semelhanças com NMOSD12. No entanto, o IgG anti-AQP4 só é positivo em NMOS...

Soro AQP4 IgG é um biomarcador de diagnóstico de núcleo para Neuromielite optica espectro transtornos (NMOSD)1. O ensaio de baseada em célula (CBA) é um método de deteção de IgG anti-AQP4 amplamente utilizado com alta sensibilidade e especificidade. Aqui, um protocolo detalhado para a CBA é introduzido.
AQP4, uma proteína de canal de água, possui seis unidades de membrana que mede e dois domínios helicoidais em torno um aquosa pore2. IgG anti-AQP4 está envolvida na patogênese da NMOSD por meio de ligação ao seu alvo AQP4, que situa-se principalmente sobre o endfeet de astrócitos3. Tem sido demonstrado que IgG anti-AQP4 é positivo em cerca de dois terços dos pacientes NMOSD4. Nos mais recentes critérios diagnósticos internacionais para NMOSD, IgG anti-AQP4 é considerado ser um biomarcador diagnóstico do núcleo5. A este respeito, é fundamental estabelecer um protocolo confiável para detectar soro humano IgG anti-AQP4 e facilitar o diagnóstico clínico de NMOSD.
Atualmente, vários métodos de deteção de IgG anti-AQP4 estão disponíveis, tais como a CBA, ensaio baseado em tecido, ensaio imunoenzimático e citometria de fluxo6,7. CBA emprega EU90 células, que são transfected com AQP4 humano, para capturar IgG anti-AQP4. O IgG anti-AQP4 capturado é detectado pelos anticorpos secundários fluorescentes e posteriormente visualizado por microscopia. Acumular evidências tem mostrado que a CBA é mais sensível e específico do que outros anti-AQP4 IgG deteção métodos6,7. De acordo com uma meta-análise, a sensibilidade e especificidade do CBA foram mostrados para ser de 76% e 99%, que eram superiores baseados em tecido e ensaios de enzima-lig da imunoabsorção6. Além disso, uma comparação multicêntrico de ensaios de diagnósticos de IgG anti-AQP4 foi realizado7. Um total de 193 estudo sujeitos de 15 centros de diagnósticos europeus foram matriculados7. Quatro diferentes métodos foram utilizados para detectar soro de IgG anti-AQP47. Foi demonstrado que a CBA foi mais sensível e específico do que os outros métodos7. Como AQP4 é expressa em duas isoformas principais (AQP4-M1 e M23-AQP4), célula de captura de IgG anti-AQP4 é transfectada com AQP4-M1 ou AQP4-M23. No entanto, o tipo de célula de captura é melhor permanece controverso. Uma investigação apoiou AQP4-M1 baseado CBA8, enquanto outros têm indicado que AQP4-M23 baseado CBA é melhor7,9,10. No entanto, CBA AQP4 M23-baseados pode produzir resultados falso-positivos devido a inespecíficos IgG ligação8. Jarius et al.. 11 relataram que não houve significativa diferença em taxas de detecção de IgG anti-AQP4 entre AQP4-M1 e CBAs AQP4-M23-baseado.
Em resumo, soro anti-AQP4 IgG é um biomarcador de núcleo para NMOSD. CBA tem maior especificidade e sensibilidade que outros métodos de deteção de IgG anti-AQP4. Permanece controverso se AQP4-M1-AQP4 M23-baseado ou CBA é melhor. Neste artigo, um protocolo detalhado para a CBA AQP4 M1-baseada é descrito, que pode aplicar para o diagnóstico clínico e estudos de NMOSD.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:553px;" width="552">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:185px;">Anti-aquaporin-4 IIFT</td>
			<td style="width:96px;">Euroimmun</td>
			<td style="width:105px;">FA 1128-2005-50</td>
			<td style="width:167px;">Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellSens Dimension</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>photograph software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel &#38; clot activator tube</td>
			<td>Improve medical</td>
			<td>623040202</td>
			<td>From a local Chinese company</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin g detection by cell-based assay

Antiaquaporina-4 (AQP4) Imunoglobulina G (IgG) é o biomarcador de núcleo diagnóstico para transtornos do espectro do Neuromielite optica (NMOSD). O ensaio de baseada em célula (CBA) é um método amplamente utilizado para detectar IgG anti-AQP4 no soro humano com alta sensibilidade e especificidade. Brevemente, soro anti-AQP4 IgG é capturado pela célula AQP4-transfectadas que é fixada sobre o biochip então detectada por um anticorpo secundário marcado com fluoresceína. Microscopia de fluorescência é utilizada para visualizar a fluorescência, e a intensidade da fluorescência é avaliada pelo menos dois médicos experientes. Um diagnóstico final de NMOSD pode ser feito com base na combinação de resultados de deteção de IgG anti-AQP4, manifestações clínicas e achados neurorradiológica. De acordo com estudos anteriores, a CBA é mais sensível e específica do que outros métodos de deteção de IgG anti-AQP4, e pode ser aplicada para diagnóstico clínico e estudos de NMOSD. O método tem limitações; por exemplo, a escala internacional para avaliar a concentração de IgG do soro anti-AQP4 é ainda insuficiente. Aqui, um protocolo detalhado para a deteção de IgG anti-AQP4 soro humano usando CBA é descrito.

Usando o procedimento descrito aqui, anti-AQP4 específicos IgG no soro é detectável. Durante o procedimento, pre-diluídas amostras, um controle positivo e um controle negativo foram adicionados aos campos de reação, que contêm áreas transfectadas e untransfected (Figura 2). Fluorescência do controlo negativo numa área transfectada indicado principalmente a vinculação não específico do anticorpo secundário às células transfectadas em biochips ...

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Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Deteção de imunoglobulina Antiaquaporina-4 G de soro humano por ensaio baseados em células

Baseada em célula de ensaio é um método amplamente utilizado para detectar imunoglobulina de soro antiaquaporina-4 G. Esse método pode ser aplicado para o diagnóstico clínico e pesquisas científicas de transtornos do espectro óptico Neuromielite.

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

De acordo com os recentes critérios de diagnóstico internacional para distúrbios do espectro neuromielite optica, o IgG anti-AQP4 é considerado um biomarcador de diagnóstico central. A detecção de IgG anti-AQP4 por ensaio baseado em células pode facilitar o diagnóstico clínico. Assim, o ensaio baseado em células é mais sensível e específico do que outros métodos de detecção.E pode ser aplicado tanto ao diagnóstico clínico quanto aos estudos científicos. Primeiro, leve as amostras de soro do paciente, o slide biochip, o pó PBS e o TWEEN 20 do kit de ensaio à base de células refrigeradas à temperatura ambiente. Em seguida, prepare mais de 200 mililitros de tampão de lavagem PBS contendo 0,2% de TWEEN 20 para cada slide de biochip.Use o tampão de lavagem para fazer diluições seriais de 10 vezes de cada amostra de soro. Prepare controles positivos e negativos de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 30 microliters de diluições seriais de 10 vezes da amostra, o controle positivo e o controle negativo, a cinco campos de reação individuais na bandeja de reagentes.Segure o slide biochip por seus slides e remova sua tampa protetora sem tocar em seus campos de reação. Coloque o slide em cima da bandeja de reagente e incubar a configuração em temperatura ambiente por 30 minutos. Enxágue suavemente o slide de biochip com o tampão de lavagem.Em seguida, mergulhe-o em um béquer de 500 mililitros cheio de 100 mililitros do tampão de lavagem, e deixe-o na temperatura ambiente por 10 minutos. Retire o slide biochip do tampão de lavagem. Use uma toalha de papel para limpar cuidadosamente qualquer tampão restante fora dos campos de reação.Deixe o deslizamento secar por um a dois minutos. Na sala escura, adicione 25 microliters de anticorpo secundário fluorescente a cada campo de reação da bandeja de reagente. Coloque o slide em cima da bandeja de reagente e incubar a configuração em temperatura ambiente por 30 minutos.Enxágue suavemente o slide de biochip com o tampão de lavagem. Em seguida, mergulhe-o em um béquer de 500 mililitros cheio de 100 mililitros do tampão de lavagem fresco, e deixe-o na temperatura ambiente por 10 minutos. Retire o slide biochip do tampão de lavagem.Use uma toalha de papel para limpar cuidadosamente qualquer tampão restante fora dos campos de reação. Deixe o deslizamento secar por um a dois minutos. Adicione cuidadosamente uma gota do meio de incorporação a cada campo de reação no slide biochip.Por fim, sele o slide biochip com um vidro de cobertura, evitando bolhas de ar e proceda com imagens. A intensidade fraca de fluorescência do controle negativo observado na área infectada indica a ligação inespecífica do anticorpo secundário. A comparação entre as intensidades detectadas de fluorescência do controle positivo nas áreas infectadas e não infectadas indica a ligação específica do IgG anti-AQP4 ao AQP4M1 nas células infectadas.O soro negativo IgG anti-AQP4 mostra padrões de ligação semelhantes ao controle negativo em áreas infectadas e não infectadas. O soro positivo mostra padrões de ligação semelhantes ao controle positivo em áreas infectadas e não infectadas. As amostras são consideradas anti-AQP4 IgG positivas quando a fluorescência aumenta heterogeneamente na área infectada.A intensidade da fluorescência está correlacionada com o título anti-AQP4 IgG no soro. As amostras são consideradas provavelmente positivas quando apenas um pequeno número de células na área transfeinada mostram intensidades detectáveis de fluorescência. Uma amostra deve ser considerada como anti-AQP4 IgG negativa quando sua intensidade na área infectada é apenas homogêneamente mais forte do que na área não infectada.Evitar bolhas de ar é vital e difícil. Para eliminar bolhas de ar, primeiro use uma pipeta para evitar bolhas de ar em gotículas. Em segundo lugar, ao aplicar o slide biochip na bandeja do reagente, primeiro deixe um lado do slide tocar as gotículas e, em seguida, nivele o slide lentamente.Além disso, não toque nos campos de reação durante todo o experimento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

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Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

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Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

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