Name: human serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin g detection by cell-based assay
Uploaded: 2019-04-05T12:30:00
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Los autores agradecemos el apoyo de becas de la Fundación Nacional de Ciencias de China (Nº 31600820), la salud y la Comisión de planificación familiar de la provincia de Jilin (no. 2016Q036) y la ciencia y tecnología de planificación de proyecto de la provincia de Jilin (Nº 20180520110JH).

Este procedimiento fue aprobado por el Comité de ética de la Universidad del primer Hospital de Jilin y se realizó en aproximadamente 1.500 temas.
1. paciente inscripción y recogida de muestras de sangre
<ol><li>Aplicar la detección de laboratorio del suero de que IgG anti-AQP4 en pacientes de la clínica con las principales quejas y los síntomas enumerado a continuación. Realizar exámenes físicos también. Neuritis óptica: pacientes sufren déficits visuales, tales como pé...

<ol>
	<li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+autoimmunity.">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 2 (4), 110 (2015).</li><li>Ho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+aquaporin+4+at+1.8+A+and+its+mechanism+of+conductance.">Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).</li><li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neuromyelitis+optica-IgG+at+the+blood-brain+barrier+in+vitro.">Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro.</a> in vitro.Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (1), 311 (2016).</li><li>Sato, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+characteristics+of+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder:+an+international+update.">MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update.</a> Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).</li><li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOG+encephalomyelitis:+international+recommendations+on+diagnosis+and+antibody+testing.">MOG encephalomyelitis: international recommendations on diagnosis and antibody testing.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 134 (2018).</li><li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOG+antibody+disease:+A+review+of+MOG+antibody+seropositive+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder.">MOG antibody disease: A review of MOG antibody seropositive neuromyelitis optica spectrum disorder.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 25, 66-72 (2018).</li><li>Ogawa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOG+antibody-positive,+benign,+unilateral,+cerebral+cortical+encephalitis+with+epilepsy.">MOG antibody-positive, benign, unilateral, cerebral cortical encephalitis with epilepsy.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (2), 322 (2017).</li><li>Valentino, P., Marnetto, F., Granieri, L., Capobianco, M., Bertolotto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+antibody+titration+in+NMO+patients+treated+with+rituximab:+A+retrospective+study.">Aquaporin-4 antibody titration in NMO patients treated with rituximab: A retrospective study.</a> Neurology Neuroimmunology &amp; Neuroinflammation. 4 (2), 317 (2016).</li><li>Kessler, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-aquaporin-4+titer+is+not+predictive+of+disease+course+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder:+A+multicenter+cohort+study.">Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).</li><li>Mealy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+serostatus+does+not+predict+response+to+immunotherapy+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders.">Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Multiple Sclerosis. , (2017).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+aquaporin-4+antibodies+in+Chinese+patients+with+neuromyelitis+optica.">The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica.</a> Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).</li><li>Kitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+factors+and+disease+course+in+aquaporin-4+antibody-positive+patients+with+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder+from+the+United+Kingdom+and+Japan.">Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan.</a> Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).</li></ol>

Hemos descrito un método ampliamente accesible para la detección de IgG anti-AQP4 en suero humano. IgG anti-AQP4 se relaciona estrechamente con NMOSD y establecer un método de detección de IgG anti-AQP4 confiable es crucial para el diagnóstico clínico de NMOSD. En primer lugar, la IgG anti-AQP4 es específico para NMOSD. Esclerosis múltiple es una enfermedad mediada inmune del sistema nervioso central y comparte muchas similitudes con NMOSD12. Sin embargo, IgG anti-AQP4 es sólo positiva en...

Suero IgG de AQP4 es un biomarcador diagnóstico base para Neuromielitis optica espectro trastornos (NMOSD)1. El ensayo celular (CBA) es un método de detección de IgG anti-AQP4 ampliamente utilizado con alta sensibilidad y especificidad. Aquí, se presenta un protocolo detallado para el CBA.
AQP4, una proteína de canal de agua, tiene seis unidades que atraviesan la membrana y dos dominios helicoidales rodeando uno acuoso poro2. IgG anti-AQP4 es implicar en la patogenesia de NMOSD mediante el enlace a su objetivo de AQP4, que se encuentra principalmente en el endfeet de astrocitos3. Se ha demostrado que la IgG anti-AQP4 es positiva en aproximadamente dos tercios de NMOSD pacientes4. En los más recientes criterios de diagnóstico internacionales para NMOSD, IgG anti-AQP4 se considera un núcleo biomarcador diagnóstico5. En este sentido, es crucial para establecer un protocolo confiable para la detección de suero humano IgG anti-AQP4 y facilitar el diagnóstico clínico de NMOSD.
Actualmente, varios métodos de detección de IgG anti-AQP4 están disponibles, como CBA, análisis de tejidos, análisis enzima-ligado del inmunosorbente y flujo cytometry6,7. CBA emplea EU90 células, que son transfectadas con AQP4 humana, captar IgG anti-AQP4. La IgG anti-AQP4 capturado es detectada por anticuerpos fluorescentes de secundarios y posteriormente visualizada por microscopía. La acumulación de pruebas ha demostrado que la CBA es más sensible y específico que otros anti-AQP4 IgG detección métodos6,7. Según un meta-análisis, la sensibilidad y especificidad de la CBA se demostró que el 76% y 99%, que fueron superior a base de tejido y análisis de la enzima-ligado del inmunosorbente6. Además, una comparación multicéntrica de diagnóstico análisis de IgG anti-AQP4 fue llevado a cabo7. Un total de 193 estudio temas de 15 centros diagnóstico europeos fueron inscritos7. Se utilizaron cuatro métodos distintos para la detección de IgG del suero anti-AQP47. Se demostró que el CBA fue más sensible y específico que otros métodos7. AQP4 es expresada como dos isoformas principales (AQP4-M1 y AQP4 M23), celular de captura de IgG anti-AQP4 es transfected con AQP4-M1 o AQP4 M23. Sin embargo, qué tipo de célula de captura es mejor sigue siendo controvertido. Una investigación ha apoyado AQP4-M1 base CBA8, mientras que otros han indicado que AQP4 M23 basado en CBA es mejor7,9,10. Sin embargo, AQP4 M23 basado en CBA puede producir resultados falsos positivos debido a la no específica IgG enlace8. Jarius et al.. 11 informó que no hubo ninguna diferencia significativa en las tasas de detección de IgG anti-AQP4 entre M1 de AQP4 y AQP4 M23 basado en CAD.
En Resumen, suero anti-AQP4 IgG es un biomarcador de núcleo para NMOSD. CBA tiene mayor especificidad y sensibilidad que otros métodos de detección de IgG anti-AQP4. Sigue siendo polémico si la AQP4-M1 o AQP4 M23-basado en CBA es mejor. En este artículo, se describe un protocolo detallado para CBA AQP4 M1-basada, que puede aplicar a diagnóstico clínico y estudios de NMOSD.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:553px;" width="552">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:185px;">Anti-aquaporin-4 IIFT</td>
			<td style="width:96px;">Euroimmun</td>
			<td style="width:105px;">FA 1128-2005-50</td>
			<td style="width:167px;">Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CellSens Dimension</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>photograph software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel &#38; clot activator tube</td>
			<td>Improve medical</td>
			<td>623040202</td>
			<td>From a local Chinese company</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin g detection by cell-based assay

Anti-Acuaporina-4 (AQP4) inmunoglobulina G (IgG) es el biomarcador diagnóstico base para trastornos del espectro de Neuromielitis optica (NMOSD). El ensayo celular (CBA) es un método ampliamente utilizado para la detección de IgG anti-AQP4 en suero humano con alta sensibilidad y especificidad. Brevemente, suero IgG anti-AQP4 es captada por células transfected AQP4 que es fijo en el biochip entonces detectado por un anticuerpo secundario marcado con fluoresceína. Microscopía de fluorescencia se utiliza para visualizar la fluorescencia, y la intensidad de fluorescencia es evaluada por al menos dos médicos experimentados. Puede hacer un diagnóstico definitivo de NMOSD basado en la combinación de resultados de detección de IgG anti-AQP4, manifestaciones clínicas y resultados neuroradiological. Según estudios previos, CBA es más sensible y específico que otros métodos de detección de IgG anti-AQP4, y puede ser aplicado al diagnóstico clínico y estudios de NMOSD. El método tiene limitaciones; por ejemplo, todavía carece de una escala internacional para evaluar los títulos de IgG del suero anti-AQP4. Aquí, se describe un protocolo detallado para la detección de IgG anti-AQP4 suero humano utilizando CBA.

Utilizando el procedimiento descrito aquí, IgG específica anti-AQP4 en suero es detectable. Durante el procedimiento, las muestras, un control positivo y control negativo fueron agregados a los campos de reacción, que contienen áreas transfected y untransfected (figura 2). Fluorescencia del control negativo en un área de transfected indica principalmente la Unión inespecífica del anticuerpo secundario a las células transfected en biochips (<strong cla...

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Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Suero humano Anti-Acuaporina-4 inmunoglobulina G detección por análisis Cell-based

Ensayo basado en células es un método ampliamente utilizado para detectar la inmunoglobulina del suero de anti-Acuaporina-4 G. Este método podría aplicarse a diagnóstico clínico y las investigaciones científicas de los trastornos del espectro óptico de Neuromielitis óptica.

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Según los recientes criterios de diagnóstico internacional para los trastornos del espectro de la neuromielitis óptica, anti-AQP4 IgG se considera un biomarcador de diagnóstico central. La detección de IgG anti-AQP4 mediante un ensayo basado en células puede facilitar el diagnóstico clínico. Por lo tanto, el ensayo basado en células es más sensible y específico que otros métodos de detección.Y se puede aplicar tanto al diagnóstico clínico como a los estudios científicos. En primer lugar, lleve las muestras de suero del paciente, el portaobjetos de biochip, el polvo PBS y el TWEEN 20 del kit de ensayo basado en células refrigeradas a la temperatura ambiente. A continuación, prepare más de 200 mililitros de tampón de lavado PBS que contengan 0,2 por ciento de TWEEN 20 para cada diapositiva de biochip.Utilice el tampón de lavado para hacer diluciones en serie de 10 veces de cada muestra de suero. Preparar controles positivos y negativos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agregue 30 microlitros de diluciones seriales de 10 veces de la muestra, el control positivo y el control negativo, a cinco campos de reacción individuales en la bandeja de reactivos.Sujete el portaobjetos de biochip por sus diapositivas y retire su cubierta protectora sin tocar sus campos de reacción. Coloque el portaobjetos en la parte superior de la bandeja de reactivos e incubar la configuración a temperatura ambiente durante 30 minutos. Enjuague suavemente el portaobjetos biochip con el tampón de lavado.A continuación, sumerja en un vaso de precipitados de 500 mililitros lleno de 100 mililitros del tampón de lavado, y déjelo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Saque el portaobjetos biochip del tampón de lavado. Use una toalla de papel para limpiar cuidadosamente cualquier tampón restante del exterior de los campos de reacción.Deje que el portaobjetos se seque al aire durante uno o dos minutos. En la sala oscura, añada 25 microlitros de anticuerpos secundarios fluorescentes a cada campo de reacción de la bandeja de reactivos. Coloque el portaobjetos en la parte superior de la bandeja de reactivos e incubar la configuración a temperatura ambiente durante 30 minutos.Enjuague suavemente el portaobjetos biochip con el tampón de lavado. A continuación, sumérgelo en un vaso de precipitados de 500 mililitros lleno de 100 mililitros del tampón de lavado fresco, y déjalo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Saque el portaobjetos biochip del tampón de lavado.Use una toalla de papel para limpiar cuidadosamente cualquier tampón restante del exterior de los campos de reacción. Deje que el portaobjetos se seque al aire durante uno o dos minutos. Agregue cuidadosamente una gota del medio de incrustación a cada campo de reacción en la diapositiva del biochip.Por último, selle el portaobjetos biochip con un vidrio de cubierta evitando burbujas de aire y proceda con imágenes. La débil intensidad de fluorescencia del control negativo observado en la zona infectada indica la unión inespecífica del anticuerpo secundario. La comparación entre las intensidades de fluorescencia detectadas del control positivo en las áreas infectadas y no infectadas indica la unión específica del IgG anti-AQP4 a AQP4M1 en las células infectadas.El suero negativo anti-AQP4 IgG muestra patrones de unión similares al control negativo en áreas infectadas y no infectadas. El suero positivo muestra patrones de unión similares al control positivo en áreas infectadas y no infectadas. Las muestras se consideran anti-AQP4 IgG positivas cuando la fluorescencia aumenta heterogéneamente en el área infectada.La intensidad de la fluorescencia está correlacionada con el título de IgG anti-AQP4 en el suero. Las muestras se consideran probablemente positivas cuando sólo un pequeño número de células en el área trans infectada muestran intensidades de fluorescencia detectables. Una muestra debe considerarse como anti-AQP4 IgG negativo cuando su intensidad en la zona infectada es sólo homogéneamente más fuerte que en la zona no infectada.Evitar las burbujas de aire es vital y difícil. Para eliminar las burbujas de aire, utilice primero una pipeta para evitar burbujas de aire en las gotas. En segundo lugar, mientras aplica la diapositiva de biochip a la bandeja de reactivos, primero deje que un lado de la diapositiva toque las gotas, y luego nivele la diapositiva lentamente.Además, no toque los campos de reacción a lo largo del experimento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Investigación

Inmunología e Infección

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

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Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

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Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

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Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus

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